微波驱动合成氧化铁纳米颗粒用于快速检测动脉粥样硬化

摘要

微波技术可实现用于动脉粥样硬化斑块表征的氧化铁纳米颗粒的极快速合成。在纳米颗粒外侧使用氨基双膦酸盐可促进其在动脉粥样硬化区域的快速富集。

摘要

一种快速且可重复的微波驱动法已被开发用于合成尼瑞膦酸功能化的纳米颗粒。该方法从疏水性纳米颗粒的合成为起点，基于将热分解法改进为微波驱动合成法。与传统方法相比，新方法显著缩短了反应时间。此外，微波技术的应用提高了反应的可重复性，这对于临床应用具有重要意义。该氧化铁纳米颗粒的创新之处在于连接了尼瑞膦酸（Neridronate）。该分子的使用使双膦酸基团朝向纳米颗粒外侧，从而提供对钙²⁺ 结合特性 体外 和选择性富集 体内 在动脉粥样硬化斑块中。该方案自有机前体开始合成至斑块检测完成，全程约需3小时。其在动脉粥样硬化区域的积累时间少于1小时，可提供一种特别适用于临床应用的对比剂。

引言

动脉粥样硬化是一种多因素的慢性炎症性疾病，由脂质代谢失调和炎症反应异常引起，累及动脉壁。由于该疾病及相关心血管疾病的高发病率及其带来的巨大经济和社会负担，人们日益关注利用新型工具来应对这一病理过程，其中纳米技术是最具前景的方向之一^1-3。然而，目前能够快速制备并表征探针的实例仍十分有限，而此类能力是实现临床转化的基础⁴。在本实验方案中，我们采用微波法合成氧化铁纳米颗粒，并在1小时内完成其与双膦酸盐的进一步功能化，用于ApoE^-/-小鼠体内动脉粥样硬化的in vivo检测⁵ 。氧化铁纳米颗粒（IONP）是一种广为人知的纳米材料，近年来已被确立作为磁共振成像（MRI）的对比剂，用于多种疾病的检测^6-8。

微波合成法（MWS）能够在极短时间内合成纳米颗粒，具有高重复性和高产率的优势。^9,10 在本实验方案中，我们通过三个步骤获得具有斑块靶向能力的氧化铁纳米颗粒（IONP）。最后一步是连接氨基双膦酸盐——奈瑞德隆酸（Neridronate），这一步在我们的策略中至关重要，因其具有结合钙离子的特性。由于奈瑞德隆酸与天然类似物焦磷酸盐（PPi）结构相似，且对骨矿物质具有高亲和力，已被用于治疗成骨不全症（OI）和骨Paget病（PDB）。^11-13

该实验方案的三个步骤总结于图1中。第一步和第二步采用微波技术进行。第一步通过改进已发表的方法¹⁴，制备油酸包覆的氧化铁纳米颗粒（OA-IONP）。该方案是对传统热分解合成法^15,16进行微波合成的适应性优化。将含有Fe(acac)₃、油酸、油胺和1,2-十二烷二醇的混合物溶解于苯甲醇中，并经历两个加热过程。纯化过程通过乙醇（EtOH）洗涤，并使用钕铁硼（Nd-Fe-B）磁铁收集颗粒，以去除上清液中过量的表面活性剂。随后，将OA-IONP稳定分散于CHCl₃中。正如预期，由于加热速度极快，初步结果表明，与传统热分解法相比，通过微波法合成的纳米颗粒其核心尺寸（3.7 ± 0.8 nm）和流体力学尺寸（7.5 nm）更小；然而，这些纳米颗粒仍具有优异的结晶性。

第二步是利用强氧化剂（如KMnO₄）对油酸中的双键进行直接化学修饰，我们课题组原先建立的方法已针对微波条件进行了改进¹⁷。第一阶段形成MnO₄^-与双键之间的配合物；第二阶段在酸性条件下使油酸分子发生断裂，生成壬二酸-IONP。这两个阶段各持续9分钟，反应完成后对样品进行纯化：首先用1% NaHSO₃洗涤以将过量的MnO₄^-还原为MnO₂，然后用1% NaOH洗涤以中和酸性物质。

纯化步骤完成后，壬二酸-IONP 被稳定于 10 mM、pH = 7.2 的磷酸盐缓冲液中。该缓冲液为颗粒胶体稳定性的最佳环境，与原始热反应中的情况相似¹⁸。利用微波技术直接氧化 OA-IONP 中所含双键，是该技术在纳米颗粒合成中优势的极佳例证。传统方法需反应 24 小时，而采用微波可将反应时间缩短至 18 分钟。此外，微波驱动的合成方案表现出优异的可重复性，经过 4 次重复实验后所得纳米颗粒的流体动力学尺寸为 30 ± 5 nm。除流体动力学尺寸的变化外，zeta 电位是快速验证反应是否成功的一个良好参数。由于壬二酸-IONP 中引入了新的羧基，其 zeta 电位值约为 -44 mV，与热法所得结果非常接近。

为了将奈立膦酸连接到壬二酸-IONP上，采用传统的EDC/磺基-NHS偶联方法¹⁹。该合成方法已被广泛确立，因为使用磺基-NHS活化羧酸盐可确保反应过程中胶体的稳定性。在去除磷酸盐缓冲液后，奈立膦酸的反应在1 mM HEPES缓冲液（pH ~7）中进行。反应得到的奈立膦酸-IONP具有较窄的粒径分布，流体力学尺寸为40 ± 4 nm，zeta电位为-24.1 mV。

本文描述了一种快速合成用于体内动脉粥样硬化斑块成像的铁氧纳米颗粒（IONP）的方法。尽管该方法具有可行性，可在相同条件下利用含有游离氨基的任何多肽/抗体，适用于T₂加权对比剂MRI领域的不同用途。

方案

1. 试剂的准备

1. 将 23.8 mg HEPES 溶解于 100 ml 蒸馏水中，配制 1 mM HEPES 缓冲液。调节 pH 至 7。
2. 将 10 g NaHSO₃ 溶解于 100 ml 蒸馏水中，配制 10% NaHSO₃ 溶液。搅拌混合物 15 分钟。
3. 将 1 g NaOH 溶解于 100 ml 水中，配制 NaOH 溶液。搅拌 10 分钟。
4. 将 600 mg NaH₂PO₄ 溶解于 1 L 水中，配制 10 mM 磷酸盐缓冲液。小心加入 0.34 ml 磷酸，搅拌 30 分钟。调节 pH 至 2.9（可接受范围为 2.7–3.0）。
5. 将 269 mg NaH₂PO₄ 和 1.09 g Na₂HPO₄ 溶解于蒸馏水中，定容至 1 L，配制 10 mM 磷酸盐缓冲液。调节 pH 至 7.2。

2. 油酸包覆纳米颗粒（OA-IONP）的合成

1. 在适用于微波反应的烧瓶中加入 0.5 g Fe(acac)₃、1.4 ml 油酸、0.6 ml 油胺和 1.19 g 1,2-十二烷二醇。使用刻度移液管沿烧瓶壁小心加入 10 ml 苯基醚。
2. 将烧瓶放入微波反应器中，并启动微波程序。
   注意：微波软件允许选择温度、压力、搅拌速度、功率和反应时间等参数的数值。此外，该软件可在同一程序中加载三个不同阶段，从而实现可调控的合成。一旦加载的合成程序开始，微波将尽快加热样品（升温过程），并在设定的反应时间内保持该温度（运行过程）。功率的选择决定了升温所需的时间。
3. 在微波反应器中加载动态反应程序。该程序包含三个阶段：
   1. 第一阶段：设定温度为 60 °C，时间为 2 分钟，压力为 250 psi，功率为 150 W。搅拌速度应调至高位，最大功率需开启。
   2. 第二阶段：设定温度为 200 °C，时间为 20 分钟，压力为 250 psi，功率为 300 W。搅拌速度应调至高位，最大功率需开启。
   3. 第三阶段：设定温度为 250 °C，时间为 10 分钟，压力为 250 psi，功率为 300 W。搅拌速度应调至高位，最大功率需开启。
4. 程序结束后，让烧瓶在室温下自然冷却。
   注意：冷却过程可使用或不使用气流，两种方式结果相同。搅拌子和烧瓶壁上会出现聚集体，用乙醇（EtOH）冲洗并转移至锥形瓶中。
5. 使用玻璃移液管将反应混合物转移至锥形瓶，加入 10 ml 98% 的乙醇（EtOH）。将钕铁硼（Nd-Nb-B）磁铁置于烧瓶下方，静置 5 分钟后，用玻璃移液管移除上清液。
6. 加入 10 ml 乙醇（EtOH），在室温下以 40 kHz 超声处理 2 分钟，将样品置于磁铁上，去除上清液。重复此步骤至少三次。
7. 将油酸包覆的纳米颗粒分散于 30 ml 氯仿（CHCl₃）中，在室温下以 40 kHz 超声处理 5 分钟。按照仪器制造商的说明，使用泽塔电位仪检测流体动力学粒径。取 0.5 ml OA-IONP 样品加入玻璃比色皿中，再加入 0.5 ml 氯仿（CHCl₃）。接受范围为强度加权平均粒径（Z-average）7–10 nm。
   注意：OA-IONP 可良好分散于正己烷中。

3. 壬二酸纳米颗粒（壬二酸-IONP）的合成

1. 将44.3 mg高锰酸钾（KMnO₄）和150.4 mg BTACl溶解于H₂O:CHCl₃（3:2 ml）混合溶剂中。将所得溶液加入微波反应瓶中含5 ml OA-IONP的等分试样中。
2. 启动微波合成壬二酸-IONP的程序，设定温度为105 °C，时间9分钟，压力250 psi，功率300 W。向反应瓶中加入10 ml pH = 2.9的磷酸盐缓冲液，重复微波程序。冷却后，用磁铁回收纳米颗粒，并弃去上清液。
3. 向锥形瓶中加入5 ml 10% NaHSO₃溶液，在25 °C下以40 kHz超声处理2分钟，用磁铁收集颗粒并弃去上清液。（此步骤重复2次。）再用1% NaOH洗涤纳米颗粒三次，最后将其重新分散于5 ml pH = 7.2的磷酸盐缓冲液中。
4. 检测水动力学粒径和zeta电位。取0.7 ml壬二酸-IONP样品加入一次性折叠毛细管池中，插入zetasizer进行测量。
   注意：粒径接受范围为25–35 nm（以强度Z-平均粒径表示），zeta电位接受范围为-45 ± 5 mV。若使用pH >7的磷酸盐缓冲液代替pH = 2.9的缓冲液，可获得较大的纳米颗粒（约70 nm）（参见Chem Eur J 2008）。

4. 奈立膦酸纳米颗粒（奈立膦酸-IONP）的合成

1. 在离心管中加入12 mg EDC和15 mg Sulfo-NHS，并加入2 ml壬二酸修饰的IONP（Azelaic-IONP）分装液。将混合物在室温下涡旋振荡35分钟。
2. 将磁铁置于离心管下方以分离纳米颗粒，吸除上清液，并用1.5 ml pH=7的1 mM HEPES缓冲液洗涤颗粒。（重复此步骤两次。）随后，加入5 mg奈立膦酸，涡旋振荡混合物2小时。
3. 用磁铁分离纳米颗粒，并用1 mM HEPES缓冲液（pH=7）洗涤（每次2 ml，共3次）。最后，将奈立膦酸修饰的IONP（Neridronate-IONP）分散于2 ml pH=7的1 mM HEPES缓冲液中。
4. 检测其流体动力学粒径和zeta电位。取0.7 ml奈立膦酸修饰的IONP加入一次性折叠毛细管池中，并插入zetasizer仪器（参见设备设置）。
   注：粒径的可接受范围为40–45 nm（以强度表示的Z-平均粒径）。Zeta电位的可接受范围为-20 ± 5 mV。

5. 在体 内 ApoE 中动脉粥样硬化斑块的检测^-/- 通过磁共振成像（MRI）研究小鼠

1. 磁共振成像采集的准备工作
   注意：动物实验需要若干额外系统。因此，需准备以下设备：
   1. 使用适当的设备对动物进行麻醉。
   2. 配备带有外部热空气加热的闭路循环温水系统，以维持动物体温稳定。
      注意：本实验中，与磁共振成像（MRI）兼容的监测与门控系统用于记录动物在MRI磁体内的体温。
   3. 通过MRI控制台中的集成接口，监测动物周围环境温度、动物体内温度（直肠温度计测量）以及位于动物躯干下方靠近胸部的呼吸传感器信号。
2. 磁共振成像实验
   1. 使用气化异氟烷（诱导阶段2%，持续2至3分钟；维持阶段1–1.5%）并配合100%氧气气路对动物进行麻醉。
   2. 借助轮廓成像定位，将动物放置于磁体中心位置。
   3. 完成步骤5.2.2后，将射频（RF）线圈调谐至300 MHz（7 T）共振频率，并将线圈的特征阻抗匹配至50欧姆，以实现最佳信号接收。
      注意：需注意通过适配器/分路器连接至测量系统的外部线路和接头，应分别连接至发射线圈的各个部分（本实验中为四通道线圈）。
   4. 完成线圈调谐与阻抗匹配后，将线圈插入扫描仪。
   5. 进行射频脉冲校准（包括脉冲形状与长度）及中心频率调整时，需手动完成脉冲校准与中心频率设置。手动执行90°脉冲校准、粗略匀场（见下文）、中心频率调整及接收增益调节。
   6. 使用梯度回波（FLASH或GRE）定位扫描精确定位，执行三维平面定位扫描（轴向、冠状和矢状面，亦称三平面定位）。
   7. 进行磁体匀场，以优化磁体中心区域的磁场均匀性。该步骤需手动完成（见5.2.3），使用单脉冲自由感应衰减（FID）序列，并调节一阶和二阶匀场线圈，或使用系统内置的自动匀场序列。
      注意：匀场良好的磁场可通过T2*值（越大越好）或谱线半高全宽（FWHM）较窄来识别和评估。
3. 斑块的磁共振成像数据采集⁵
   1. 经尾静脉注射100 µl（1 mg [Fe] ml^-1）的奈立膦酸纳米颗粒，注射后1小时开始成像。加载针对腹主动脉（肾动脉分叉处）动脉粥样硬化斑块的MRI成像参数。
   2. 采用交错模式进行多层扫描，共采集10至20层切片，以最小化伪影。
   3. 在冠状面或轴向面采集高分辨率快速自旋回波T1加权MRI图像，参数如下：视野（FOV）60 × 30 mm（冠状面）、30 × 30 mm（轴向面），层厚0.8 mm（使用小型梯度线圈配置时可降至0.6 mm），重复时间（TR）400 msec，回波时间（TE）8 msec，采集与重建矩阵均为256 × 256，信号平均次数为6次（大梯度线圈）至8次（小梯度线圈），平均采集时间为5–8分钟。
      注意：TE尤为关键，血流信号、流动效应及化学位移伪影可能限制成像应用。在此情况下，可采用对流动不敏感的快速自旋回波T2-IR序列以减少伪影；在完全相同位置采集互补数据有助于斑块特征的准确表征。此外，可使用预饱和脉冲抑制动脉壁周围脂肪组织信号，以更清晰地界定血管壁外边界，并减少化学位移伪影。
   4. 以标准格式（如Dicom）传输图像，并使用适当的软件（例如 Osirix成像软件或AMIDE：医学影像数据检查器）进行查看⁵。通过手动划定血管面积、管壁厚度、管腔面积及斑块负荷，对对比增强效应进行定量分析⁵。

结果

本方案描述了三种不同铁氧化物纳米颗粒（IONP）的合成方法。以疏水性油酸包覆的IONP（OA-IONP）为起始材料，在微波驱动合成的辅助下，获得水相稳定的纳米颗粒。所有纳米颗粒均呈现超小的流体力学尺寸（Dh <50 nm），且尺寸分布极为均一（图1c）。微波技术的使用使得纳米颗粒的核尺寸达到超小水平。由于微波能够实现快速加热，相较于其他方法，成核速率显著提高，从而获得更小的纳米颗粒核尺寸。然而，颗粒仍保持优异的结晶性，透射电子显微镜（TEM）图像中可清晰观察到Fe₃O₄核的晶格条纹（图1a, b）。该方法另一个重要特点是可重复性。在重复四次壬二酸-IONP的合成后，所得流体力学尺寸及分布结果一致（图1d）。

功能化后，通过将含尼立膦酸的纳米颗粒与不同量的 Ca²⁺ 孵育，检测了其因...

讨论

氧化铁纳米颗粒（IONP）是最重要的纳米材料之一，长期以来已被用于多种应用。这些材料作为磁共振成像（MRI）对比剂的使用已是一个成熟的研究领域。然而，传统的合成路线通常耗时较长，且操作过程复杂。为了显著缩短反应时间并提高可重复性，采用微波驱动的合成方法似乎是制备高质量纳米颗粒的一种良好替代方案。在上述方案中，微波技术已被用于合成两种不同的纳米颗粒。微波法能够精确调控影响颗粒最终特性的主要参数。需要注意的是，若改变任一所述条件，纳米颗粒的物理性质均会发生变化。由于合成过程中使用了一些化学试剂，纯化步骤对于获得高质量纳米颗粒至关重要。

在OA-IONP的制备过程中，需使用过量的表面活性剂以确保纳米颗粒具有足够的稳定性。合成后，必须经过三个纯化步骤以彻底去除表面活性剂。对于壬二酸-IONP的合成，需要两个不同的微波反应阶段。在第二阶段中，可通过调节反应条件将最终颗粒尺寸调控至超小尺寸IONP（D_h <50 nm）使用 pH = 2.9 得到较大的流体动力学尺寸（D_h >50 nm）时使用生理p...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
微波反应仪 Explorer/Discover Hybrid-12	CEM Corporation, USA		任何可用于化学合成的微波反应仪均可使用
一次性 PD-10 脱盐柱	GE Healthcare life sciences	17-0851-01	任何尺寸排阻色谱柱均可使用
Amicon®Ultra-0.5 ml	Merck Millipore Ltd
校准过的 pH 计	SI analytics	285105127
钕磁铁	Aiman Gz	ND010B
Vortex Genius 3	IKA	3340000
ZetaSizer Nano ZS	Malvern Instruments
标准（大容量）光学玻璃池	Labbox	11718
Zetasizer 纳米系列一次性折叠毛细管池 DTS1070	Malvern
Bruker Minispec mq60	Bruker