干细胞样 非洲爪蟾 用于研究早期神经发育特征的胚胎外植体 体外 和 在体 内

摘要

在Xenopus胚胎中，囊胚腔顶壁的细胞具有多能性，可被诱导分化为多种组织。本文介绍了利用两栖类囊胚腔顶壁外植体作为实验体系，研究早期神经发育关键体内和体外特征的实验方案。

摘要

理解神经发育背后的遗传程序是发育生物学和干细胞生物学的重要目标。在两栖动物囊胚中，囊胚腔顶壁的细胞具有多能性。这些细胞可以被分离，并通过调控基因表达或形态发生素诱导，被编程以生成各种组织。本文描述了利用非洲爪蟾（Xenopus laevis）囊胚腔顶壁外植体作为实验系统，研究早期神经发育关键体内和体外特征的操作方案。这些方案可用于研究细胞命运的获得、细胞迁移行为以及细胞自主性和非自主性特性。囊胚腔顶壁外植体可在无血清的确定培养基中培养，并移植到宿主胚胎中。这种胚胎内的移植可用来研究移植细胞的长期谱系承诺、诱导特性及其在体内的行为。这些实验体系可用于探究神经发育背后的分子机制、细胞过程以及基因调控网络。在再生医学背景下，这些方法提供了一种在体外生成神经来源细胞类型的手段，可用于药物筛选。

引言

脊椎动物的神经系统起源于神经板，由一层均质的神经上皮细胞发育而来。目前，发育生物学的一个主要目标是理解发育程序在神经板区域化过程中是如何被诱导、编码和建立的。与其他系统相比，实验操作便利的Xenopus胚胎是研究神经发育早期阶段的首选模型^1,2。该系统易于获得大量胚胎，且其体外发育特性使得研究者能够观察神经胚形成的最初阶段³。目前已有多种工具可用于实验性地操控Xenopus laevis（X. laevis）胚胎的发育过程。通过显微注射mRNA或吗啉环寡核苷酸（MO，包括可诱导型MO），结合生物化学与药理学手段，可实现对基因功能的可控性获得（GOF）与缺失（LOF），并特异性地调控信号通路^4,5。位于囊胚或极早期原肠胚动物极周围的囊胚腔顶外胚层，被称为“动物帽”（Animal Cap, AC），是一类具有多能性的细胞来源，可在制备外植体前通过调控基因表达对其进行编程。本文详细描述了利用X. laevis AC外植体在体外（in vitro）和体内（in vivo）检测神经发育相关分子机制与细胞过程的实验方案。

一种技术被提出，可实现对基因表达模式的精细观察 非洲爪蟾 蝌蚪神经管，作为鉴定命运决定信号的初步步骤。尽管扁平封片组织的观察在鸡胚研究中常用⁶，尚未被准确描述 非洲爪蟾通过向2细胞期或4细胞期胚胎的卵裂球中注射合成mRNA或吗啉代寡核苷酸（MO），可实现对AC外植体的基因表达调控⁴例如，通过表达抗BMP因子Noggin抑制骨形态发生蛋白（BMP）通路，可赋予AC细胞神经特性³该方案详细介绍了通过阴离子交换树脂微珠与AC外植体直接接触，实现对外源信号进行局部和时间可控暴露的方法。最后，描述了一种用于检测神经前体细胞发育特性的技术。 体内 通过将来自不同编程细胞解离后重新组合的混合外植体进行移植。

青蛙胚胎是研究脊椎动物早期神经发育的有力模型。将基因表达操作与外植体技术相结合 体外 培养物为研究神经上皮的区域化、增殖和形态发生提供了重要信息^7-12AC外植体的编程促进了功能性心脏的发育 离体^13,14. 外植体移植的应用¹⁵ 确定了诱导神经嵴分化程序的最小转录开关¹⁶。该 丘脑内界带 (ZLI) 是一个信号中心，通过分泌 sonic hedgehog (Shh) 来调控前脑尾部的生长和区域化。当神经上皮细胞持续暴露于 Shh 时，会共表达三种转录因子基因—— barH样同源框-2(barhl2)orthodenticle-2 (otx2) 和 iroquois-3 (irx3) - 获得ZLI区室的两个特征：表达能力 嘘， 以及从前部神经板细胞中分离的能力。作为模型系统，将展示将神经上皮细胞诱导为ZLI命运的过程⁸.

这些方案旨在为发育生物学家及其他研究人员提供简单、廉价且高效的工具，以探索关键神经细胞行为的基本机制。这些方案具有很强的通用性，可用于研究多种外在和内在的神经决定信号。它允许对神经谱系承诺、诱导性相互作用以及细胞行为进行长期的体内分析。

方案

实验遵守国家和欧洲关于保护用于科学目的动物的法规，以及国际公认的替代、减少和优化原则。

1. 平铺固定 非洲爪蟾 蝌蚪整体标本的前部神经管 原位 杂交

1. 根据标准操作流程获取 X. laevis 胚胎⁴，并培养至神经胚期26期及更晚期（依据Nieuwkoop和Faber发育表¹⁷）。
2. 通过将 X. laevis 蝌蚪置于4%多聚甲醛（PFA）溶液中孵育来固定样本，在2 ml玻璃小瓶中于室温下轻轻摇动并旋转孵育，26期至38期胚胎孵育1至1.5小时，更晚期胚胎孵育2小时 。
   警告：PFA接触有毒，且为疑似致癌物，应在通风橱中操作。
   注意：通常一批 X. laevis 胚胎使用一个2 ml玻璃小瓶固定，但也可使用更大的玻璃小瓶。
3. 在同一小瓶中用含0.1% Tween的1x PBS（PBT）清洗胚胎，室温下每次3分钟，共清洗两次。
   注意：除非另有说明，所用PBS可含或不含钙和镁。
4. 在同一小瓶中用100%甲醇（MeOH）对胚胎进行脱水处理，室温下至少12小时。在通风橱中使用塑料移液枪头至少更换两次100% MeOH。
   注意：随着脂质溶解，MeOH会略微变黄。注意MeOH吸入有毒，应在通风橱中操作。
5. 在同一小瓶中通过梯度甲醇溶液逐步复水：75% MeOH/PBS、50% MeOH/PBS、25% MeOH/PBS，随后用PBS清洗两次，每次5–10分钟，室温下进行。使用塑料移液枪头在通风橱中更换MeOH溶液。
6. 使用塑料移液器将待解剖的胚胎转移至盛满PBT的60 mm培养皿中。使用两把精细镊子小心去除眼睛：将一把精细镊子插入眼与神经管之间、视柄水平处，将眼睛从神经管上分离。小心地将镊子插入覆盖神经管的外胚层下方，从头部后方开始小心剥离外胚层并弃去。
7. 使用地高辛标记或荧光素标记的探针进行双重或单重原位杂交（ISH），方法如前所述^18,19。
8. 原位杂交完成后，使用塑料移液器将胚胎转移至另一个盛满PBT的60 mm培养皿中。
9. 使用精细镊子小心地将神经管从胚胎其余部分分离。此时，前部神经管与后部神经管分离。小心去除覆盖在神经管上的残留外胚层、位于神经管下方松散附着的脊索、耳泡以及中胚层的残留部分。确保此时神经管无任何附属结构。
   注意：为避免损伤神经管，所有神经管或胚胎的转移操作应使用塑料转移移液器，必要时可使用末端剪去部分的移液枪头，枪头末端直径应与神经管大小相匹配。
10. 将解剖得到的神经管（见步骤1.9注释）转移至含有50%甘油/PBS溶液的1.5 ml离心管中。等待神经管沉降至甘油溶液底部，通常需过夜（O/N）于4 °C。
11. 使用P1000移液器吸除50%甘油/PBS溶液，并在同一1.5 ml离心管中加入90%甘油/PBS溶液。等待神经管沉降至90%甘油/PBS溶液底部，通常需过夜（O/N）于4 °C。
    注意：如需长期保存，可在90%甘油/PBS中添加抗生素以防止细菌生长。
12. 使用塑料转移移液器将神经管转移至玻璃板或载玻片上。
13. 使用钨针沿背侧和腹侧中线解剖神经管。此步骤中神经管应保持在90%甘油/PBS溶液中。
14. 使用加固环将神经管的两侧置于90%甘油/PBS中，并加盖盖玻片封片。
15. 用封片剂固定盖玻片，并于4 °C保存。

2. 使用阴离子交换树脂珠诱导动物帽外植体

1. 使用移液器 P1000 将 100 µl 阴离子交换树脂珠转移至 2 ml 离心管中。用无菌蒸馏水连续洗涤树脂珠至少五次。待树脂珠沉降到管底后，使用移液器 P1000 更换无菌蒸馏水。切勿触碰树脂珠。
2. 将树脂珠在含有牛血清白蛋白（BSA）（10 mg/ml）的无菌蒸馏水中，于 4 °C 下过夜浸泡。
3. 在收集动物帽（ACs）前两小时，使用移液器 P1000 将一半树脂珠转移至新的 1.5 ml 离心管中。用 500 µl 含有待测诱导分子或已知可诱导特定命运的培养基替换无菌蒸馏水。保留另一半树脂珠作为阴性对照。
4. 将树脂珠在 4 °C 下孵育至少 2 小时。
5. 后续所有步骤均在体视显微镜下进行，并使用移液器完成所有动物帽（AC）的转移操作。
6. 使用塑料转移移液管将囊胚或极早期原肠胚胚胎转移至含钙和镁的 PBS 缓冲液中，该缓冲液补充有 0.2% BSA。
   注：在 12 °C 下发育的胚胎，于 20 至 24 小时内达到囊胚和原肠胚阶段。
7. 使用镊子按照先前描述的方法去除胚胎的卵黄膜²⁰。用一把镊子固定胚胎，用另一把镊子的侧面夹住卵黄膜。握住卵黄膜后，缓慢将其从胚胎上剥离。此操作应在胚胎的腹侧（植物极侧）进行。切勿损伤胚胎的动物极侧。
8. 按照先前描述的方法分离小型动物帽（ACs）²¹。动物极为胚胎的色素化区域。使用精细镊子从动物极切下一小块方形组织。该动物帽组织仅包含外胚层细胞。确保组织厚度均匀。若不均匀，则将该动物帽排除在分析之外。
9. 将每个动物帽置于 Terasaki 多孔板中，加入 0.5x 改良 Barth 盐溶液（MBS）⁴。将动物帽以其色素化的动物极面朝下放入孔中，使其与孔的圆底接触。
   注：用 0.1% BSA 溶液包被移液管可防止黏附性组织碎片黏附于塑料表面。
10. 使用移液器 P20 将一颗树脂珠放置于每个动物帽上。如有需要，可用镊子小心地将树脂珠置于动物帽中央。
    注：当树脂珠浸泡于条件培养基中时会呈现粉红色。应选择着色最深的树脂珠。
11. 在室温（18 至 22 °C）下孵育 6 小时，期间勿移动 Terasaki 多孔板。树脂珠在不到 2 小时内即可黏附于动物帽上。
12. 将 Terasaki 多孔板置于浸湿的滤纸上方，并用塑料容器覆盖。
    注：此“保湿室”可防止孔内液体过早蒸发。
13. 在保湿室中，于 15–20 °C 下用 0.5x MBS 或 3/4 NAM（见步骤 4.1）培养动物帽（ACs），直至其同胞胚胎发育至适合检测目标因子效应的阶段。
14. 用新配制的 4% 多聚甲醛（PFA）固定动物帽 1 小时。随后按照前述方法（步骤 1.4）将动物帽脱水至 100% 甲醇（MeOH）中。

3. 在Xenopuslaevis神经胚中移植前的动物帽细胞解离与重聚集

1. 用无菌水或不含钙和镁的 PBS 将 3% 琼脂糖包被于培养皿（60 mm）或 12 孔板中。加入足量琼脂糖以覆盖培养皿或孔的底部。将板在室温（18–22 °C）预热。可选：将板在 4 °C 保存数天以防止脱水。
2. 制备无钙霍尔特弗雷特氏生理盐水（60 mM NaCl、0.7 mM KCl、4.6 mM HEPES、0.1% BSA（A-7888 Sigma，pH 7.6））和霍尔特弗雷特氏生理盐水（60 mM NaCl、0.7 mM KCl、0.9 mM CaCl₂、4.6 mM HEPES、0.1% BSA，pH 7.6）⁵。注意：CaCl₂ 溶液不能高压灭菌。
3. 用无钙霍尔特弗雷特氏生理盐水将包被琼脂糖的孔加满至顶部。
4. 准备囊胚期或极早期原肠胚期胚胎，以分离其动物帽细胞（ACs），方法如前所述（步骤 2.5 至 2.7）。
5. 分离至少 15 个或最多 30 个较小的动物帽组织（ACs）²¹。使用精细镊子从动物极切下一小块组织。动物帽组织仅包含外胚层细胞，因此厚度均匀。若不满足此条件，则将该动物帽组织排除在分析之外。
   注意：动物极是胚胎的有色部分。
6. 将动物帽组织转移至已用无钙霍尔特弗雷特氏生理盐水加满的琼脂糖包被孔中，使其有色面朝上放置。
   注意：在无钙霍尔特弗雷特氏生理盐水中，细胞解离过程迅速开始。
7. 等待数分钟，观察组织解聚情况，待细胞开始解离后，使用精细镊子将有色层与动物帽其余部分分离，并用 P20 微量移液器弃去。完全的细胞解离表现为细胞彼此分离。
   注意：可在重聚集的外植体中保留一至两层有色细胞，以便在移植过程中便于观察。
8. 通过轻轻旋转培养板使细胞居中。使用 P1000 微量移液器小心吸除尽可能多的培养基，注意不要触碰细胞。
9. 向孔中加入 1 ml 含钙的霍尔特弗雷特氏生理盐水。将解离后的动物帽组织转移至 1.5 ml 离心管中。
   注意：由于 2 ml 管为圆底，因此不可使用。
10. 通过离心沉淀细胞：台式离心机最大转速 2,000 rpm（500 × g）离心 5 分钟。使用 P1000 微量移液器小心吸除上清液。
11. 向解离的细胞中加入 20 µl 含钙的霍尔特弗雷特氏生理盐水（60 mM NaCl、0.7 mM KCl、0.9 mM CaCl₂、4.6 mM HEPES、0.1% BSA（A-7888 Sigma，pH 7.6））⁵。
12. 将解离后的动物帽组织在室温（18–22 °C）下静置 3 至 6 小时。
    注意：此时间为细胞重聚集所必需。重聚集现象表现为细胞在管底形成一个小球状结构。
13. 通过加入 1 ml 0.5× MBS 或 1 ml 3/4 NAM（见步骤 4.1）小心将外植体从管底剥离。使用塑料转移移液器将外植体转移至未包被的培养板中。
14. 根据对照组同胞胚胎确定外植体的发育阶段。如需长期培养，请使用抗生素：卡那霉素（50 µg/ml）、氨苄青霉素（50 µg/ml）和庆大霉素（50 µg/ml）。

4. 将动物帽外植体移植到X. laevis胚胎的神经板中

1. 制备3/4 NAM（110 mM NaCl、2 mM KCl、1 mM Ca(NO₃)₂、1 mM MgSO₄、0.1 mM EDTA、1 mM NaHCO₃、0.2× PBS、50 µg/ml 庆大霉素）。用于解剖的NAM保存时间不得超过1周，需在4 °C下储存。较老的NAM可用于制备琼脂糖包被的解剖培养皿（见下文）。
2. 使用3%琼脂糖（溶于3/4 NAM）包被培养皿（60 mm），并用硅胶模具或乒乓球拍盖在琼脂糖上压出小孔。
   注意：琼脂糖覆盖培养皿底部，需留出一定空间以便后续加入3/4 NAM。也可使用不干型油泥制作解剖培养皿。在解剖过程中，将胚胎轻轻嵌入油泥中固定。使用圆头镊子在琼脂糖中挖出小孔。这种“解剖培养皿”有助于在解剖过程中固定胚胎。
3. 准备解剖工具：塑料移液管、眉刀（用石蜡将眉毛毛发固定在玻璃巴斯德移液管尖端制成）²²、两把精细解剖镊、P1000微量移液器及吸头、放大倍数为8–40×的体视显微镜、带光纤导光的强光源。保持所有解剖工具清洁；每次实验后，用蒸馏水冲洗两次，再用100%乙醇冲洗一次，晾干。存放时避免灰尘污染，必要时对金属解剖工具进行高压灭菌。
4. 将已解离并重新聚集的ACs（方案3）及其同窝的X. laevis胚胎培养至Nieuwkoop和Faber发育表中的13期（神经胚期）¹⁷。用于移植时，选用神经板期13期至15期的胚胎。
5. 后续所有步骤均在体视显微镜下进行。
6. 使用塑料移液管将胚胎转移至含钙和镁并补充0.2% BSA的PBS中。按先前描述的方法去除胚胎的卵膜²⁰。用一把镊子固定胚胎，用另一把镊子的侧面夹住卵膜，牢固握住后缓慢将其从胚胎上剥离。
   注意：此操作应在胚胎的腹侧（植物极侧）进行。避免损伤胚胎的神经板。若在去除卵膜过程中胚胎受损，应使用塑料移液管将胚胎转移至含有3/4 NAM的60 mm培养皿中，静置15分钟，以允许足够时间进行修复。
7. 用新鲜的3/4 NAM将解剖培养皿加满至顶部。
8. 使用塑料移液管将去除卵膜的胚胎转移至解剖培养皿中，将胚胎背侧朝上放入孔洞中。转移过程中避免胚胎接触气液界面，因为X. laevis胚胎会因表面张力而裂解。
9. 使用塑料移液管或P1000微量移液器将待移植的AC外植体转移至解剖培养皿中。当移液管进入液体后，让外植体依靠重力缓慢沉降，或极轻柔地推动。
10. 用圆头镊子固定胚胎，用眉刀在拟移植区域的神经板上做切口。
    注意：在14期，神经板前部的弯曲可作为解剖标志，代表间脑区域（图4）。
11. 使用圆头镊子和眉刀切除一小块神经上皮组织，再用眉刀切下一小块外植体。
    注意：外植体的大小和形状应与被切除的神经上皮区域大致相同。
12. 使用眉刀和精细镊子将外植体组织块置入神经上皮切口中，确保外植体迅速与胚胎贴附。
13. 也可将一小片盖玻片置于移植后的胚胎上，以固定移植物。操作时，使用粗镊子将细小的盖玻片剪成极小的碎片，确保尺寸约为1.5 mm²。用镊子将碎片浸入盛有3/4 NAM或PBS的培养皿中。选择比胚胎稍大的盖玻片碎片，以避免损伤胚胎。此时胚胎会略微变扁。
14. 至少静置30分钟，期间不要移动，或仅轻柔移动解剖培养皿。让胚胎恢复30分钟至2小时，必要时轻柔移除盖玻片。使用塑料移液管小心地将移植后的胚胎转移至盛有新鲜3/4 NAM的洁净培养皿中。
    注意：移植后的胚胎容易发生细菌或真菌污染。长期培养时应使用抗生素：卡那霉素（50 µg/ml）、氨苄青霉素（50 µg/ml）和庆大霉素（50 µg/ml）。

结果

根据对不同物种的形态学观察、胚胎操作以及调控基因表达模式的研究，一种概念模型认为，神经板被划分为横向和纵向的节段，形成一个发育网格，从而产生不同的组织发生区域。在神经板中，前脑、中脑、后脑和脊髓的原基在原肠胚形成期间已沿前后（AP）轴建立（综述见^23-25）。在神经管形成过程中，组织发生区域可表现为基因表达的空间限制性结构域。根据调控基因的表达模式，前脑原基被划分为六个横向节段，每个节段产生称为前脑节（p）的不同组织发生区域。每个前脑节进一步分为腹侧（基板）和背侧（翼板）两部分（综述见^26,27）。在两栖类中，前脑节2（p2）发育为上丘脑和丘脑，并形成其组织中心——丘脑内界带（Zona Limitans Intrathalamica，ZLI）⁸（综述见^28,29）。

在图1中展示了经全胚胎原位杂交（WM-DISH）...

讨论

神经发育由细胞内在发育程序与周围组织信号之间的复杂相互作用所调控（综述见^3,31,32）。本文介绍了一套可用于 X. laevis 胚胎以研究神经命运决定和神经形态发生过程中涉及的外在与内在因素 体外 和 体内这些方案可直接用于 X. tropicalis 胚胎，然而 X. tropicalis 胚胎的体积仅为四分之一 X. laevis 胚胎。所使用的镊子和钨针都需要更精细。在可能的情况下，使用 X. laevis.

精确可视化 X. laevis 和 X. tropicalis 通过WM-ISH分离的神经管进行组织学平铺包埋，可实现神经组织发生区域的观察。该技术已成功应用于 X. laevis 26期至45期的胚胎（图1以及在 X. tropicalis 30期至45期的胚胎^8,33较老的胚胎比年轻的胚胎更...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
多聚甲醛	VWR	20909.290	有毒
阴离子交换树脂微珠	Biorad	140- 1231
牛血清白蛋白	SIGMA	A-7888	用于动物细胞培养，pH 7.6
庆大霉素	GIBCO	15751-045	抗生素
牛血清白蛋白	SIGMA	A7906	用于微珠制备