在Xenopus胚胎中，囊胚腔顶壁的细胞具有多能性，可被诱导分化为多种组织。本文介绍了利用两栖类囊胚腔顶壁外植体作为实验体系，研究早期神经发育关键体内和体外特征的实验方案。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
理解神经发育背后的遗传程序是发育生物学和干细胞生物学的重要目标。在两栖动物囊胚中，囊胚腔顶壁的细胞具有多能性。这些细胞可以被分离，并通过调控基因表达或形态发生素诱导，被编程以生成各种组织。本文描述了利用非洲爪蟾（Xenopus laevis）囊胚腔顶壁外植体作为实验系统，研究早期神经发育关键体内和体外特征的操作方案。这些方案可用于研究细胞命运的获得、细胞迁移行为以及细胞自主性和非自主性特性。囊胚腔顶壁外植体可在无血清的确定培养基中培养，并移植到宿主胚胎中。这种胚胎内的移植可用来研究移植细胞的长期谱系承诺、诱导特性及其在体内的行为。这些实验体系可用于探究神经发育背后的分子机制、细胞过程以及基因调控网络。在再生医学背景下，这些方法提供了一种在体外生成神经来源细胞类型的手段，可用于药物筛选。
引言
脊椎动物的神经系统起源于神经板，由一层均质的神经上皮细胞发育而来。目前，发育生物学的一个主要目标是理解发育程序在神经板区域化过程中是如何被诱导、编码和建立的。与其他系统相比，实验操作便利的Xenopus胚胎是研究神经发育早期阶段的首选模型1,2。该系统易于获得大量胚胎，且其体外发育特性使得研究者能够观察神经胚形成的最初阶段3。目前已有多种工具可用于实验性地操控Xenopus laevis（X. laevis）胚胎的发育过程。通过显微注射mRNA或吗啉环寡核苷酸（MO，包括可诱导型MO），结合生物化学与药理学手段，可实现对基因功能的可控性获得（GOF）与缺失（LOF），并特异性地调控信号通路4,5。位于囊胚或极早期原肠胚动物极周围的囊胚腔顶外胚层，被称为“动物帽”（Animal Cap, AC），是一类具有多能性的细胞来源，可在制备外植体前通过调控基因表达对其进行编程。本文详细描述了利用X. laevis AC外植体在体外（in vitro）和体内（in vivo）检测神经发育相关分子机制与细胞过程的实验方案。
一种技术被提出，可实现对基因表达模式的精细观察 非洲爪蟾 蝌蚪神经管，作为鉴定命运决定信号的初步步骤。尽管扁平封片组织的观察在鸡胚研究中常用6，尚未被准确描述....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
实验遵守国家和欧洲关于保护用于科学目的动物的法规，以及国际公认的替代、减少和优化原则。
1. 平铺固定 非洲爪蟾 蝌蚪整体标本的前部神经管 原位 杂交
- 根据标准操作流程获取 X. laevis 胚胎4，并培养至神经胚期26期及更晚期（依据Nieuwkoop和Faber发育表17）。
- 通过将 X. laevis 蝌蚪置于4%多聚甲醛（PFA）溶液中孵育来固定样本，在2 ml玻璃小瓶中于室温下轻轻摇动并旋转孵育，26期至38期胚胎孵育1至1.5小时，更晚期胚胎孵育2小时 。
警告：PFA接触有毒，且为疑似致癌物，应在通风橱中操作。
注意：通常一批 X. laevis 胚胎使用一个2 ml玻璃小瓶固定，但也可使用更大的玻璃小瓶。 - 在同一小瓶中用含0.1% Tween的1x PBS（PBT）清洗胚胎，室温下每次3分钟，共清洗两次。
注意：除非另有说明，所用PBS可含或不含钙和镁。 - 在同一小瓶中用100%甲醇（MeOH）对胚胎进行脱水处理，室温下至少12小时。在通风橱中使用塑料移液枪头至少更换两次100% MeOH。
注意：随着脂质溶解，MeOH会略微变黄。注意MeOH吸入有毒，应在通风橱中操作。 ....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
根据对不同物种的形态学观察、胚胎操作以及调控基因表达模式的研究，一种概念模型认为，神经板被划分为横向和纵向的节段，形成一个发育网格，从而产生不同的组织发生区域。在神经板中，前脑、中脑、后脑和脊髓的原基在原肠胚形成期间已沿前后（AP）轴建立（综述见23-25）。在神经管形成过程中，组织发生区域可表现为基因表达的空间限制性结构域。根据调控基因的表达模式，前脑原基被划分为六个横向节段，每个节段产生称为前脑节（p）的不同组织发生区域。每个前脑节进一步分为腹侧（基板）和背侧（翼板）两部分（综述见26,27）。在两栖类中，前脑节2（p2）发育为上丘脑和丘脑，并形成其组织中心——丘脑内界带（Zona Limitans Intrathalamica，ZLI）8（综述见28,29）。
在图1中展示了经全胚胎原位杂交（WM-DISH）.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
神经发育由细胞内在发育程序与周围组织信号之间的复杂相互作用所调控（综述见3,31,32）。本文介绍了一套可用于 X. laevis 胚胎以研究神经命运决定和神经形态发生过程中涉及的外在与内在因素 体外 和 体内这些方案可直接用于 X. tropicalis 胚胎，然而 X. tropicalis 胚胎的体积仅为四分之一 X. laevis 胚胎。所使用的镊子和钨针都需要更精细。在可能的情况下，使用 X. laevis.
精确可视化 X. laevis 和 X. tropicalis 通过WM-ISH分离的神经管进行组织学平铺包埋，可实现神经组织发生区域的观察。该技术已成功应用于 X. laevis 26期至45期的胚胎（图1以及在 X. tropicalis 30期至45期的胚胎8,33较老的胚胎比年轻的胚胎更.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢 Hugo Juraver-Geslin、Marion Wassef 和 Anne Hélène Monsoro-Burq 提供的帮助与建议，以及感谢居里研究所动物实验中心的支持。作者感谢 Paul Johnson 对手稿的编辑工作。本研究得到了法国国家科学研究中心（CNRS UMR8197，INSERM U1024）、“癌症研究协会”（ARC 4972 和 ARC 5115；FRC DOC20120605233 和 LABEX Memolife）以及皮埃尔·吉勒·德热纳基金会（FPGG0039）的资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 多聚甲醛 | VWR | 20909.290 | 有毒 |
| 阴离子交换树脂微珠 | Biorad | 140- 1231 | |
| 牛血清白蛋白 | SIGMA | A-7888 | 用于动物细胞培养，pH 7.6 |
| 庆大霉素 | GIBCO | 15751-045 | 抗生素 |
| 牛血清白蛋白 | SIGMA | A7906 | 用于微珠制备 |
参考文献
- Nieuwkoop, P. D. IIB, Pattern formation in the developing central nervous system (CNS) of the amphibians and birds (English). Proceedings of the Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen. 94, 121-127 (1991).
- Nieuwkoop, P. D.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
