构建模块化水凝胶片的微模式化宏观缩放3D细胞结构

摘要

我们描述了使用简单工艺制造微图案水凝胶片材的过程，该工艺可以以独立形式组装和作。使用这些模块化水凝胶片，可以在受控的细胞微环境中生成简单的宏观 3D 细胞培养系统。

摘要

水凝胶可以在使用微流体或微图案的技术，以提供在体内样的三维（3D）几何组织微观尺度进行图案化。所得三维水凝胶为基础的蜂窝结构已被引入作为替代动物实验为先进的生物研究，药理学试验和器官移植的应用程序。尽管水凝胶为基础的颗粒和纤维，可以容易地制造，这是很难操纵它们用于组织重建。在这种视频中，我们描述了一种制造方法，微图案化藻酸盐水凝胶片材，以及它们的组件，以形成一个宏观尺度三维细胞培养体系具有受控细胞微环境。 200微米，具有精确的微图案 - 采用钙胶凝剂薄雾形式，薄水凝胶片材易于与厚度在100〜生成。细胞然后可与水凝胶片材在几何指导培养独立的条件。此外，水凝胶片材可以容易地使用微量具有端切割尖端操纵，并且可以通过使用图案化的聚二甲基硅氧烷（PDMS）帧堆叠它们组装成多层结构。这些模块化水凝胶片，其可以使用一个浅显工艺制造，具有的体外药物分析和生物学研究，包括微观和宏观结构和组织重建的功能研究潜在的应用。

引言

水凝胶是特别有前途的生物材料，并且预计将在基础生物学，药理学试验和医学重要¹的水凝胶为基础的蜂窝构造的Biofabrication已经建议减少使用的动物实验中^，2,3-取代移植组织^，4和提高基于细胞的测定^。5,6-含有水（加氢）的粘弹性材料（凝胶）允许进行封装和保持在支架结构，以控制3D细胞微环境的大量细胞。与微流体或微图案的技术的指导组合，该水凝胶结构的几何形状可以精确地在细胞比例控制。迄今为止，多种水凝胶的形状，包括颗粒^{，7 - 9}纤维^{，10 - 12，}片材^{，13 - 15}已经被用作建筑物单元在自下而上的Appro酸痛到宏观规模的多细胞结构的制造。

既基于水凝胶的颗粒和纤维一直容易且迅速地制造为应用程序作为微尺度蜂窝环境中，使用微流体装置的流体控制。然而，如工程化组织的基本单位，它将是复杂的重新排列，并扩大其体积为宏观结构^。16，是更难以实现宏观规模构建体相比，以产生微米级的基本模块。可用于水凝胶基的构建体的片状单元通过简单的组装过程来增加支架的体积。必然，水凝胶片材的堆叠层不仅提供一个容积增加，而且在一个三维空间中的几何延伸。

方案

1.制备微模式化模具和水凝胶的

1. 通过标准的两步光刻技术^15,17用于铸造PDMS模具生产使用的SU-8光致抗蚀剂的硅晶片的表面上所希望的微观图案。示出的例子使用一个肝小叶状网状图案（ 图1）。
2. 称出PDMS和固化剂溶液与1:5的比例（即，12.5克PDMS和2.5克固化剂）。
3. 彻底混合15克的溶液，脱气气泡在真空室中，然后蔓延混合溶液到硅晶片的微图案化表面均匀内的箔铸造菜。
4. 放置在硅晶片上65℃下加热板90分钟在一个平面上以固化的PDMS。
5. 从铸造盘和硅晶片剥离固化的PDMS。
6. 切的PDMS的边缘，并且将其放置到一个100毫米直径的培养皿所述微图案的一面朝上。
7. 使用70％的乙醇和蒸馏水主灭菌培养皿洗涤微图案固化的PDMS。然后，完全进行10分钟干燥后在炉中在65℃。
8. 溶解并混合的O / N 3克在100毫升蒸馏水的粉末状非离子表面活性，产生3％（重量/体积）涂布液。
9. 放置微图案的PDMS模具在等离子体清洁器然后清洁处理1分钟（85瓦，0.73毫巴）以创建一个亲水性表面，以促进加入的含水液体。然后，外套与至少3小时（ORO / N）用实验室摇杆100 ml的表面活性剂溶液与PDMS的表面上。
10. 洗从PDMS模具表面活性剂溶液并完全干燥后在炉中在65℃下进行10分钟。然后，灭菌每个微图....

结果

我们已经描述了制造和操纵独立的细胞水凝胶表。 如图1中，我们制备微图案化的PDMS模具，和包含细胞的水凝胶上样到这些模具的亲水性表面和交联使用增湿以产生胶凝剂的气溶胶雾。以下从模具释放，HepG2细胞都在独立的凝胶片材具有各种图案（图2）中培养。因此，该薄水凝胶片提供了一种三维培养环境。此外，模块化的水凝胶片材可以通过层叠片材使用具有端切断尖端微量移，并使用PDMS帧，这使得3D宏观尺度细胞培养物（ 图3）进行组装。

图1.流量 查RT显示水凝胶板和多层水凝胶片的制作。

讨论

这个协议提供了一种制造模块化的水凝胶片，并把它们组装，以形成三维的细胞支架的一个简单方法。

为了构建在短时间内鲜明图案化藻酸盐的结构，我们应确定一个交联的过程，可以创造足够刚性的结构，以从模具保持复杂微图案，以及维持细胞活力和新陈代谢。我们已经开发出一种交联方法，包括溶胶 - 凝胶转变，喷使用以雾状形式的加湿器的交联试剂。如果没有这种交联过程中，微规模图案不能在薄水凝胶的形式产生构造与有限扩散深度（100 - 200微米），它具有高扩散渗透率到的代谢物和营养物质。 60分钟^{，18 - - 20}交联剂钛此外，与现有的扩散为基础的方法，这需要30相比我是相对较短（3 - 5分钟）。

此外，也有人有挑战性操纵薄水凝胶片材，其中只有在液体介质是机械稳定的。 如图1所示，薄水凝胶结构简单且稳定地处理，并用一个端切断常规叶尖为不同培养条件之间transferal操纵。使用产生和操作技术，我们可以提供不仅在用于药物试验的潜在应用浮动方.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Sylgard 184 有机硅弹性体套件	道康宁公司	000000000001064291
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443	粉末状非离子表面活性剂
海藻酸钠盐，低粘度	Alfa Aesar	B25266
氯化钙二水合	Sigma-Aldrich	C7902
超声波加湿器	MediHeim	MH-2800	改性设备，最大喷涂速率：250 ml/hr
尼龙网过滤器 水利性，180 &μ;m	EMD Millipore	NY8H04700
聚碳酸酯模具			用于制造 PDMS 框架模型的定制模具