用于微图案化宏观尺度三维细胞结构的模块化水凝胶片构建

摘要

我们介绍一种利用简单工艺制备可自由组装和操作的自支撑微图案化水凝胶片的方法。利用这些模块化水凝胶片，可构建具有可控细胞微环境的简单宏观尺度三维细胞培养系统。

摘要

水凝胶可利用微流控或微图案化技术在微米尺度上进行图案化，以提供一种 体内类三维（3D）组织结构。所构建的基于水凝胶的三维细胞体系已被用作动物实验的替代方案，广泛应用于高级生物学研究、药理学检测以及器官移植等领域。尽管基于水凝胶的微粒和纤维易于制备，但在组织重建过程中对其进行操控仍存在困难。本视频介绍了一种用于制备具有微图案化结构的海藻酸盐水凝胶片的方法，并进一步将其组装成具有可控细胞微环境的宏观尺度三维细胞培养系统。通过使用雾化形式的钙离子交联剂，可便捷地生成厚度为100–200 µm、并具有精确微图案的薄型水凝胶片。随后，细胞可在无支撑条件下借助水凝胶片的几何引导进行培养。此外，可使用末端切割型微量移液器轻松操控这些水凝胶片，并利用图案化的聚二甲基硅氧烷（PDMS）框架将其堆叠组装成多层结构。这种通过简易工艺即可制备的模块化水凝胶片，在三维细胞培养、组织工程及再生医学等领域具有广阔的应用前景。 体外 药物分析与生物学研究，包括微结构与宏观结构的功能研究以及组织重建。

引言

水凝胶是一类极具前景的生物材料，在基础生物学、药理学检测和医学领域具有重要应用潜力。¹ 基于水凝胶的细胞结构生物制造技术被认为有望减少动物实验的使用^2,3，替代可移植组织⁴，并提升基于细胞的检测性能^5,6。含水（hydro-）的黏弹性材料（凝胶）可将大量细胞包封并维持于支架结构中，从而调控三维细胞微环境。结合微流控或微图案化技术的引导，可在细胞尺度上精确控制水凝胶结构的几何形态。迄今为止，多种形态的水凝胶，包括微粒^7-9、纤维^10-12和片层^13-15，已被用作自下而上构建宏观多细胞结构的基本单元。

基于水凝胶的微粒和纤维已可通过微流控装置在流体控制下快速、便捷地制备，用作微尺度的细胞环境。然而，作为工程化组织的基本单元，将其重新排列并扩增为宏观尺度的结构仍较为复杂¹⁶。相比制备微米尺度的基本模块，实现宏观尺度的构建更具挑战性。通过简单的组装工艺，可利用片状的水凝胶结构单元来增加支架的体积。因此，堆叠的水凝胶片层不仅实现了体积的增加，还实现了三维空间中的几何延展。

我们此前已报道过一种制备微图案化水凝胶片的方法

方案

   1. 微图案化模具与水凝胶的制备

1. 使用 SU-8 光刻胶通过标准的两步光刻技术在硅片表面制备所需的微尺度图案^15,17 用于浇铸PDMS模具。所示示例采用类似肝小叶的网状图案（图1).
2. 称取 PDMS 和固化剂溶液，比例为 1:5（即，12.5 g PDMS 和 2.5 g 固化剂）。
3. 将15 g溶液充分混合，在真空腔中脱除气泡，然后将混合溶液均匀涂布于硅片的微图案化表面，置于铝箔铸型皿中。
4. 将硅片置于65 °C 将 PDMS 在平坦表面上置于加热板上加热 90 分钟以使其固化。
5. 将固化后的聚二甲基硅氧烷（PDMS）从浇铸皿和硅晶片上取下。
6. 将PDMS的边缘裁剪后，放置于直径为100 mm的培养皿中，微图案面朝上。
7. 用70%乙醇和蒸馏水清洗培养皿中已固化并带有微图案的PDMS，进行初步灭菌。然后将PDMS置于65 °C烘箱中完全干燥10分钟。 °C.
8. 过夜溶解并混合 3 g 非离子表面活性剂粉末溶于 100 ml 蒸馏水中，配制成 3% (w/v) 的包被溶液。
9. 将微图案化PDMS模具放入等离子清洗仪中，以85 W、0.73 mbar的条件处理1分钟，使其表面变为亲水性，以便于后续添加水相液体。随后，将100 ml表面活性....

结果

我们描述了游离细胞水凝胶片的制备与操作方法。如图1所示，我们制备了具有微图案的PDMS模具，并将含有细胞的水凝胶加载到这些模具的亲水表面，通过加湿器产生凝胶剂的气溶胶雾进行交联，从而形成水凝胶片。从模具上释放后，将HepG2细胞在具有不同图案的游离水凝胶片中进行培养（图2）。因此，这种薄的水凝胶片提供了三维细胞培养环境。此外，可通过使用末端切割的移液管头和PDMS框架层层叠加模块化水凝胶片，实现三维宏观尺度的细胞培养（图3）。

图1.

讨论

本方案提供了一种简便的方法，用于制备模块化水凝胶片，并将其组装成三维细胞支架。

为了在短时间内构建出清晰明确的海藻酸盐图案化结构，我们需要确定一种交联过程，该过程既能形成足够刚性的结构以保留模具中的复杂微图案，又能维持细胞的活力和代谢活性。我们开发了一种包含溶胶-凝胶转变的交联方法，利用加湿器以雾化形式喷洒交联试剂。若无此交联过程，则无法在扩散深度有限（100 - 200 µm）的薄型水凝胶结构中形成微尺度图案，而此类结构对代谢物和营养物质具有较高的扩散通透性。此外，与现有依赖扩散的方法（需30 - 60分钟）¹⁸⁻²⁰相比，该交联过程所需时间较短（3 - 5分钟）。

此外，操作这些薄水凝胶片也具有挑战性，因为它们仅在液体环境中才具有机械稳定性。如图1所示，通过使用末端切割的常规移液枪头，可在不同培养条件下简单且稳定地转移和操作薄水凝胶结构。利用该制备与操作技术，我们不仅能够提供以漂浮形式存在的单层水凝胶片，用于潜在的药物检测应.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Sylgard 184 硅酮弹性体试剂盒	Dow Corning Corporation	000000000001064291
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443	粉末状非离子表面活性剂
海藻酸钠盐，低黏度	Alfa Aesar	B25266
二水合氯化钙	Sigma-Aldrich	C7902
超声波加湿器	MediHeim	MH-2800	改装设备，最大喷雾速率：250 ml/hr
尼龙网滤膜，亲水性，180 μm	EMD Millipore	NY8H04700
聚碳酸酯模具			定制模具，用于制备 PDMS 框架图案