使用毛细管收集大鼠乳汁及通过奶油离心法估测乳脂含量

摘要

乳汁是新生儿的主要营养来源。分析乳汁成分可能有助于了解影响子代健康的母体因素。本方案描述了一种从哺乳期大鼠手动采集乳汁样本的方法，所获样本可用于后续的下游分析。

摘要

乳汁作为新生哺乳动物唯一的营养来源，为子代的生长和发育提供必需的营养物质和能量。乳汁还含有大量生物活性化合物，对新生儿的发育产生重要影响。分析乳汁成分有助于阐明将母体代谢与健康同子代生长发育联系起来的关键因素。实验室大鼠是母体研究中常用的一种模式生物，通过大鼠乳汁可研究各种母体生理、营养及药理干预对乳汁成分的影响，进而影响子代健康。本文介绍一种由单名研究人员即可手动采集哺乳期大鼠乳汁的简便方法，该方法无需特殊的真空或抽吸设备，且可获得足量乳汁用于后续下游分析。同时介绍了一种通过测定乳汁样本中乳脂所占百分比（称为乳脂比容，creamatocrit）来估算乳汁脂肪含量的方法。这些方法最终可用于加深对母婴健康关系的理解，并揭示参与子代正常生长发育的母体因素。

引言

乳汁是新生哺乳动物唯一的营养来源，为婴儿的生长和发育提供能量和营养物质^1,2尽管牛奶主要由细胞、脂质和蛋白质组成¹，它还含有大量可调节子代早期生命发育的生物活性物质，包括酶、碳水化合物、激素、抗体、生长因子、细胞因子、外泌体、微囊泡以及小分子RNA（如microRNA）^1,2母乳在子代免疫和肠道健康建立中的基础性作用³，加之证据表明母乳喂养的婴儿对疾病的易感性较低²，强调了识别与生命早期疾病过程相关的乳汁成分及其作用分子机制的重要性。发育中的大鼠是研究各种营养、生理和化学干预对生命早期发育影响的常用模型。⁴因此，对大鼠乳汁的分析可能为母体及子代健康提供新的见解。

当前的科学进展为深入研究特定乳汁成分对健康和疾病的影响提供了越来越多的机会。例如，乳汁中细菌谱的测序阐明了其在婴儿肠道早期定植中的作用⁵，对乳汁寡糖的质谱分析揭示了母体饮食对乳汁寡糖谱改变的影响⁶，而对母乳脂肪球中分泌的微小RNA（microRNA）进行深度测序，则凸显了其在基因转录、代谢和免疫功能中的潜在作用⁷。

大鼠模型是母体研究中常用的最受欢迎的模式生物之一^8,9。其优势之一在于妊娠期和哺乳期均较短，各持续约21天；因此从妊娠开始到哺乳结束的总时间较短，可在短时间内获取有价值的实验数据。与小鼠相比，大鼠体型较大，在乳汁采集方面可能具有显著优势，可获得更多的乳汁量且采集更为方便；例如，小鼠的乳汁产量似乎与总体重相关，体重较大的小鼠产乳量更高¹⁰。

本文提供了从哺乳期大鼠手动采集乳汁的一般性描述。该方案所需设备极少，具有非侵入性、成本低廉的优点，可采集到足量乳汁用于后续分析。简言之，首先使用异氟烷对母鼠进行麻醉，随后通过催产素刺激乳汁分泌，再经手动挤压乳腺将乳汁收集至毛细管中。最后，鉴于乳汁的主要成分包括脂肪和蛋白质，本文简要介绍了利用奶油离心法（creamatocrit）测定乳脂含量，以及采用标准蛋白检测方法定量总蛋白浓度的操作流程¹¹。

方案

本方案已获卡尔加里大学动物护理委员会批准，并符合 实验动物护理和使用的指南.

1. 将母鼠与幼崽分离

1. 在挤奶前，将母鼠与其后代分离至少 5 分钟¹²。
   注意：母鼠可在分离后 5–6 小时内进行挤奶^1,6,13，但分离时间超过 4 小时可能会影响乳汁成分¹⁴。尽管分离时间似乎不影响乳汁采集量¹²，建议在整个研究过程中保持一致的分离时间。乳汁成分可能在泌乳期间发生变化¹⁵，因此应尽量保持乳汁采集时间一致。最大乳汁产量通常出现在泌乳第 14 天¹²。
2. 使用保温箱，确保幼鼠在挤奶过程中母鼠不在时仍能维持正常体温。
   注意：在下述研究中，挤奶操作在断奶时进行，此时母鼠约 22 周龄，幼鼠为 21 日龄，因此未使用保温箱。

2. 设置与准备

1. 收集挤奶操作所需的所有材料。
   注意：所有材料均可在材料与设备表中找到。
2. 在进行挤奶操作的实验台上放置加热垫，并用吸水性实验台垫覆盖加热垫。
3. 设置麻醉系统。确保系统在开始前有足够的氧气和异氟烷。将用于初始麻醉诱导的麻醉面罩连接至仪器。如果维持麻醉所用面罩与初始不同，则将其放置在附近备用。
4. 采用无菌技术，将25 G针头连接至1 ml注射器，用于催产素注射。
5. 打开加热垫，以在挤奶过程中维持母体体温。 注意：监测加热垫温度，确保其不会过热导致烫伤。也可使用可设定特定温度的热源，例如加热手术台。 

3. 使用异氟烷对母鼠进行麻醉

1. 打开氧气瓶，将流量调节至每分钟1升（1,000毫升）。开启异氟烷气流，并将其浓度设为5%。注意：避免直接吸入麻醉气体，并防止麻醉蒸气积聚。
2. 对母鼠实施麻醉。
3. 如有需要，切换至维持麻醉面罩，将母鼠仰卧于吸水实验台垫上。通过检查足底反射是否消失来确认麻醉效果。
4. 将异氟烷流量降低至2–3%，以维持麻醉状态。在整个操作过程中持续监测母鼠，确保不会发生呼吸抑制。 注意：一旦母鼠进入麻醉状态，应使用无菌眼用润滑剂保护其眼睛，以防眼睛干涩或受到刮伤。 

4. 催产素注射

1. 确保催产素（20 USP 单位/毫升）未过期。使用无菌酒精棉片或酒精消毒垫对催产素小瓶进行消毒。
2. 采用无菌技术，将2 IU（0.1 ml）催产素抽入注射器中。每头待挤奶母畜均须使用新的针头和注射器。
   注意：催产素剂量通常为单次注射 1 至 5 IU^1,6,12,16或者，可使用每公斤体重4 IU的剂量¹²单次剂量为2 IU，若挤奶困难，可重复给药一次。
3. 将催产素进行腹腔注射。将针头插入腹部右下象限，针尖朝向头部方向，与皮肤呈15–30°角，进针深度约为0.5 cm。
4. 回拉注射器活塞，以确保注射前存在负压。如果出现任何液体（血液、尿液、肠内容物， 等等。用注射器抽取后，若无液体被吸入，应移除针头，并使用新的针头和注射器重新尝试注射。若仍未抽吸到液体，则注射催产素，并立即将针头和注射器丢弃至生物危害容器中。
5. 等待约5-15分钟，使催产素刺激乳汁排出。

5. 挤奶部位的准备

1. 选择采集乳汁的部位/乳头。可以从任意乳头采集乳汁¹²。
2. 使用修毛器轻轻去除待挤奶乳头周围的毛发，因为毛发可能通过毛细作用吸收乳汁，从而影响样本采集。操作时应轻柔——乳头周围的皮肤极为敏感，可能较为干燥，容易产生划伤或撕裂。
3. 乳头无需灭菌，但可在去除毛发后选择用温水清洁乳头。至少准备两个采样部位，因可能需要多个部位进行乳汁采集。
   注意：如果乳汁分析包括微生物谱检测，则可能需要用碘对乳头区域进行灭菌⁵。

6. 乳汁采集

1. 轻轻挤压乳头基部，手动挤出乳汁用于收集。
   注意：如果乳汁分析包括微生物谱分析，应弃去最初的几滴乳汁。
2. 将乳汁液滴滴入毛细管中，填满毛细管。使用可容纳较大体积（例如，50 µl）的毛细管可使操作更简便。
   注意：若收集乳汁困难，可给予第二剂催产素。建议总剂量不超过 4 IU。
3. 将毛细管中乳汁转移至无菌微量离心管中，方法是将曾插入乳头吸取乳汁的毛细管末端接触微量离心管内壁，观察乳汁通过毛细作用被吸入离心管中。
   注意：使用连接1 ml注射器的18 G针头，将未被吸入离心管的残留乳汁“吹出”。
4. 持续监测母体是否出现疼痛或呼吸抑制的迹象，并相应调整异氟烷的流量。
5. 按照本节所述方法继续收集乳汁，直至获得足够量的乳汁用于所选分析。如需进行下文所述的乳脂含量（creamatocrit）和蛋白质浓度测定，请收集 0.25 ml 乳汁。
   注意：若乳汁排出减慢，或选定部位排乳不足，应更换挤奶部位。每只动物最多可收集约 2.5 ml 乳汁¹⁷，或每乳头最多 0.5 ml。作者建议麻醉总时间应控制在约 45–60 分钟内，或挤奶时间不超过 45 分钟。
6. 将乳汁收集至微血细胞比容管中，用于新鲜乳汁样本的乳脂含量测定，并用黏土密封剂封住管端。用母体编号标记微血细胞比容管，并将乳汁样本直立存放。
7. 挤奶完成后，关闭异氟烷和氧气气流。取下母体的面罩，并持续监测直至其清醒。 建议在恢复期间，若母体尚未完全清醒，应将其置于吸水性实验台垫上，而非直接放在笼内垫料上，以防止垫料被吸入或在恢复过程中刮伤母体眼睛。 
   注意：在母体恢复至能够维持胸卧位意识水平之前，不得无人看护。
8. 若无需进一步分析，应将乳汁在 -80 °C 冷冻保存。其他研究者建议乳汁可在 4 °C 保存最多 3 小时，或在 -20 °C 保存长达 5 个月¹⁸。

7. 奶油离心法测定

1. 通过计算乳脂率（乳脂在牛奶样本中所占的百分比）来估算牛奶中的脂肪含量¹⁹。
   注意：使用人乳进行的测量表明，新鲜或冷冻的乳汁均可用于乳脂率测定，但新鲜乳汁与脂质浓度的相关性更高（r = 0.92，对比 r = 0.90）¹¹。在整个研究过程中应保持使用新鲜或冷冻乳汁的一致性，因为解冻后的乳汁乳脂率值会略有下降¹¹。
2. 对于新鲜乳汁，从乳头采集乳样至微量压积管中，填充至少¾满（约15–20 µl）。或者，将充分混匀后的收集样本用毛细管吸取。用黏土密封剂封住管端。
3. 将毛细管放入血细胞比容离心机中，密封端朝外，并确保离心机已平衡。
4. 启动血细胞比容离心（13,700 × g，120秒）。
   注意：离心时间或速度可能因所用离心机型号不同而有所调整。
5. 离心结束后，从离心机中取出毛细管，进行乳脂率计算所需的测量。观察样本是否分离为乳脂层和透明层。
6. 使用游标卡尺或直尺测量并记录管内液体总长度以及脂肪（乳脂）层的长度。
   注意：乳脂率以乳脂层占乳样总体积的百分比表示¹⁹，计算公式为（乳脂层长度 / 牛奶柱总长度）× 100（图1A）。根据乳脂率测量值计算脂肪浓度和能量值如下：脂肪浓度（g/L）=（乳脂率（%）− 0.59）/ 0.146（图1B）¹⁹；能量值（kcal/L）= 290 +（66.8 × 乳脂率（%））（图1C）¹⁹。

8. 蛋白质浓度测定

1. 使用牛血清白蛋白作为蛋白质标准品，采用标准蛋白质测定方法（如Lowry蛋白质测定法）测定总乳蛋白浓度⁶。
   注意：为使乳蛋白测定值落在测定方法的标准曲线范围内，可能需要对乳样进行稀释。

结果

乳汁采集自断奶期的Wistar大鼠母鼠（约22周龄，体重350至400 g），这些母鼠在妊娠期和哺乳期分别摄入对照饮食（AIN-93G，n = 5）、高蛋白饮食（40%酪蛋白，wt/wt，n = 5）或高益生元纤维饮食（21.6% wt/wt，低聚果糖与菊粉1:1比例，n = 4）。催产素剂量为2 IU。使用毛细管采集乳汁，其中一根毛细管经微量压积离心机离心以测定乳脂压积值（图1A），并据此估算脂肪浓度和能量值，计算公式如下：脂肪浓度（g/L）=（乳脂压积值（%）-0.59）/0.146（图1B）；能量值（kcal/L）= 290 +（66.8 × 乳脂压积值（%））（图1C）¹⁹。乳汁蛋白浓度采用Bio-Rad DC蛋白检测试剂盒测定（图2）。基于母体饮食的不同，乳脂压积值（p = 0.674）、脂肪浓度（p = 0.674）、能量值（p = 0.674）及蛋白浓度（p = 0.127）均无显著差异（单因素方差分析）。

讨论

随着对生命早期发育研究的兴趣日益增加，针对母乳成分的研究也不断增多。在新生儿时期，母乳是唯一的营养来源，其中的生物活性化合物对理想的生长和发育至关重要，尤其是在肠道和免疫健康方面³。本文介绍的方法是一种简单、非侵入性的技术，可用于从哺乳期大鼠收集足量乳汁，以满足后续分析（如寡糖谱分析⁶）的需求。该方法无需使用特殊的真空设备，且可由单人操作完成。

尽管本方案旨在哺乳期的单个时间点使用，但其他研究者已在研究过程中进行了一系列的乳汁采集^12,15。然而，由于连续挤奶可能影响乳汁成分¹⁷，建议研究人员根据所关注的研究结局，确定最适合其研究的采奶频率和次数。此外，尽管其他研究在大鼠挤奶过程中使用了注射性麻醉剂^14,17，但本方案采用异氟烷对大鼠进行麻醉。异氟烷是一种吸入性麻醉剂，其优点包括诱导和恢复速度快²⁰，以及能够方便地调节动物麻醉时间。然而，在小鼠中，与注射性麻醉剂相比，使用异氟烷可能导致乳汁产量降低¹⁰，尽管这一现象似乎尚未在大鼠中...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
设备——挤奶
1 ml 注射器	BD-加拿大	309602
25 G针头	BD-加拿大	305122
18 G 针头	BD-加拿大	305196
50 μl 微量移液毛细管	Fisher Scientific	21-169D
催产素（20 USP 单位/毫升）	Bimeda-MTC	1OXY015
PPC Vet 异氟烷吸入麻醉剂，250 ml	Fresenius Kabi	M60302	由兽医指示使用
无菌酒精消毒垫	Dukal	853
吸水性实验台垫	VWR	82020-845
Maxi-Therm 高温/低温治疗毯	辛辛那提子零	274
啮齿类动物麻醉机（带蒸发器）	Benson Medical Industries Inc.		根据各实验室的具体需求
动物面具	Benson Medical Industries Inc.	50100/50102
微量离心管	Axygen	MCT-060-C
ChroMini Professional Trimmer	Wahl
设备——乳脂浓度测定法
StatSpin SafeCrit 塑料微量血细胞比容管（未处理）	Fisher Scientific	22-274-914
Critoseal 毛细管密封剂托盘	VWR	470161-478
StatSpin CritSpin 微量血细胞比容离心机	Beckman Coulter, Inc	X00-004999-001