乳汁是新生儿的主要营养来源。分析乳汁成分可能有助于了解影响子代健康的母体因素。本方案描述了一种从哺乳期大鼠手动采集乳汁样本的方法，所获样本可用于后续的下游分析。
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本文内容
摘要
摘要
乳汁作为新生哺乳动物唯一的营养来源，为子代的生长和发育提供必需的营养物质和能量。乳汁还含有大量生物活性化合物，对新生儿的发育产生重要影响。分析乳汁成分有助于阐明将母体代谢与健康同子代生长发育联系起来的关键因素。实验室大鼠是母体研究中常用的一种模式生物，通过大鼠乳汁可研究各种母体生理、营养及药理干预对乳汁成分的影响，进而影响子代健康。本文介绍一种由单名研究人员即可手动采集哺乳期大鼠乳汁的简便方法，该方法无需特殊的真空或抽吸设备，且可获得足量乳汁用于后续下游分析。同时介绍了一种通过测定乳汁样本中乳脂所占百分比（称为乳脂比容，creamatocrit）来估算乳汁脂肪含量的方法。这些方法最终可用于加深对母婴健康关系的理解，并揭示参与子代正常生长发育的母体因素。
引言
乳汁是新生哺乳动物唯一的营养来源，为婴儿的生长和发育提供能量和营养物质1,2尽管牛奶主要由细胞、脂质和蛋白质组成1，它还含有大量可调节子代早期生命发育的生物活性物质，包括酶、碳水化合物、激素、抗体、生长因子、细胞因子、外泌体、微囊泡以及小分子RNA（如microRNA）1,2母乳在子代免疫和肠道健康建立中的基础性作用3，加之证据表明母乳喂养的婴儿对疾病的易感性较低2，强调了识别与生命早期疾病过程相关的乳汁成分及其作用分子机制的重要性。发育中的大鼠是研究各种营养、生理和化学干预对生命早期发育影响的常用模型。4因此，对大鼠乳汁的分析可能为母体及子代健康提供新的见解。
当前的科学进展为深入研究特定乳汁成分对健康和疾病的影响提供了越来越多的机会。例如，乳汁中细菌谱的测序阐明了其在婴儿肠道早期定植中的作用5，对乳汁寡糖的质谱分析揭示了母体饮食对乳汁寡糖谱改变的影响6，而对母乳脂肪球中分泌的微小RNA（microRNA）进行深度测序，则凸显了其在基因转录、代谢和免疫功能中的潜在作用7。
大鼠模型是母体研究中常用的最受欢迎的模式生物之一8,9。其优势之一在于妊娠期和哺乳期均较短，各持续约21天；因此从妊娠开始到哺乳结束....
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方案
本方案已获卡尔加里大学动物护理委员会批准，并符合 实验动物护理和使用的指南.
1. 将母鼠与幼崽分离
- 在挤奶前，将母鼠与其后代分离至少 5 分钟12。
注意：母鼠可在分离后 5–6 小时内进行挤奶1,6,13，但分离时间超过 4 小时可能会影响乳汁成分14。尽管分离时间似乎不影响乳汁采集量12，建议在整个研究过程中保持一致的分离时间。乳汁成分可能在泌乳期间发生变化15，因此应尽量保持乳汁采集时间一致。最大乳汁产量通常出现在泌乳第 14 天12。 - 使用保温箱，确保幼鼠在挤奶过程中母鼠不在时仍能维持正常体温。
注意：在下述研究中，挤奶操作在断奶时进行，此时母鼠约 22 周龄，幼鼠为 21 日龄，因此未使用保温箱。
2. 设置与准备
- 收集挤奶操作所需的所有材料。
注意：所有材料均可在材料与设备表中找到。 - 在进行挤奶操作的实验台上放置加热垫，并用吸水性实验台垫覆盖加热垫。
- 设置麻醉系统。确保系统在开始前有足够的氧气和异氟烷。将用于初始麻醉诱导的麻醉面罩连接至仪器。如果维持麻醉所用面罩与初始不同，则将其放置在附近备用。
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结果
乳汁采集自断奶期的Wistar大鼠母鼠（约22周龄，体重350至400 g），这些母鼠在妊娠期和哺乳期分别摄入对照饮食（AIN-93G，n = 5）、高蛋白饮食（40%酪蛋白，wt/wt，n = 5）或高益生元纤维饮食（21.6% wt/wt，低聚果糖与菊粉1:1比例，n = 4）。催产素剂量为2 IU。使用毛细管采集乳汁，其中一根毛细管经微量压积离心机离心以测定乳脂压积值（图1A），并据此估算脂肪浓度和能量值，计算公式如下：脂肪浓度（g/L）=（乳脂压积值（%）-0.59）/0.146（图1B）；能量值（kcal/L）= 290 +（66.8 × 乳脂压积值（%））（图1C）19。乳汁蛋白浓度采用Bio-Rad DC蛋白检测试剂盒测定（图2）。基于母体饮食的不同，乳脂压积值（p = 0.674）、脂肪浓度（p = 0.674）、能量值（p = 0.674）及蛋白浓度（p = 0.127）均无显著差异（单因素方差分析）。
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讨论
随着对生命早期发育研究的兴趣日益增加，针对母乳成分的研究也不断增多。在新生儿时期，母乳是唯一的营养来源，其中的生物活性化合物对理想的生长和发育至关重要，尤其是在肠道和免疫健康方面3。本文介绍的方法是一种简单、非侵入性的技术，可用于从哺乳期大鼠收集足量乳汁，以满足后续分析（如寡糖谱分析6）的需求。该方法无需使用特殊的真空设备，且可由单人操作完成。
尽管本方案旨在哺乳期的单个时间点使用，但其他研究者已在研究过程中进行了一系列的乳汁采集12,15。然而，由于连续挤奶可能影响乳汁成分17，建议研究人员根据所关注的研究结局，确定最适合其研究的采奶频率和次数。此外，尽管其他研究在大鼠挤奶过程中使用了注射性麻醉剂14,17，但本方案采用异氟烷对大鼠进行麻醉。异氟烷是一种吸入性麻醉剂，其优点包括诱导和恢复速度快20，以及能够方便地调节动物麻醉时间。然而，在小鼠中，与注射性麻醉剂相比，使用异氟烷可能导致乳汁产量降低10，尽管这一现象似乎尚未在大鼠中.......
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披露
作者声明无利益冲突。所有动物实验均按照加拿大实验动物管理委员会（CCAC）批准的方案进行。
致谢
本研究得到了加拿大自然科学与工程研究理事会（RGPIN 238382-2011）和加拿大卫生研究院（MOP115076）资助项目的资助。Heather Paul 获得了加拿大自然科学与工程研究理事会研究生奖学金以及阿尔伯塔创新健康解决方案奖学金的支持。Megan Hallam 获得了加拿大自然科学与工程研究理事会研究生奖学金、弗雷德里克·班廷与查尔斯·贝斯特加拿大研究生奖学金，以及阿尔伯塔儿童医院研究所遗传学、儿童发育与健康培训奖的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 设备——挤奶 | |||
| 1 ml 注射器 | BD-加拿大 | 309602 | |
| 25 G针头 | BD-加拿大 | 305122 | |
| 18 G 针头 | BD-加拿大 | 305196 | |
| 50 μl 微量移液毛细管 | Fisher Scientific | 21-169D | |
| 催产素（20 USP 单位/毫升） | Bimeda-MTC | 1OXY015 | |
| PPC Vet 异氟烷吸入麻醉剂，250 ml | Fresenius Kabi | M60302 | 由兽医指示使用 |
| 无菌酒精消毒垫 | Dukal | 853 | |
| 吸水性实验台垫 | VWR | 82020-845 | |
| Maxi-Therm 高温/低温治疗毯 | 辛辛那提子零 | 274 | |
| 啮齿类动物麻醉机（带蒸发器） | Benson Medical Industries Inc. | 根据各实验室的具体需求 | |
| 动物面具 | Benson Medical Industries Inc. | 50100/50102 | |
| 微量离心管 | Axygen | MCT-060-C | |
| ChroMini Professional Trimmer | Wahl | ||
| 设备——乳脂浓度测定法 | |||
| StatSpin SafeCrit 塑料微量血细胞比容管（未处理） | Fisher Scientific | 22-274-914 | |
| Critoseal 毛细管密封剂托盘 | VWR | 470161-478 | |
| StatSpin CritSpin 微量血细胞比容离心机 | Beckman Coulter, Inc | X00-004999-001 |
参考文献
- Izumi, H., Kosaka, N., Shimizu, T., Sekine, K., Ochiya, T., Takase, M. Time-dependent expression profiles of microRNAs and mRNAs in rat milk whey. PLoS ONE. 9 (2), e0088843(2014).
- Hsieh, C. C., Hernández-Ledesma, B., Fernández-Tomé, S., Weinborn, V., Barile, D., de Moura Bell, J. M.
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重印与许可
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