具体的基因组区域及相关分子鉴定enChIP隔离

摘要

需要鉴定与感兴趣的特定基因组区域相关的分子，以了解这些区域功能的调节机制。该协议描述了执行工程 DNA 结合分子介导的染色质 imunoprecipitation （enChIP） 以鉴定与特定基因组区域相关的蛋白质和 RNA 的程序。

摘要

需要鉴定与感兴趣的特定基因组区域相关的分子，以了解这些区域功能的调节机制。为了能够无偏倚地识别与特定感兴趣的基因组区域相互作用的分子，我们最近开发了工程化 DNA 结合分子介导的染色质免疫沉淀 （enChIP） 技术。在这里，我们描述了如何使用 enChIP 分离特定的基因组区域并鉴定相关的蛋白质和 RNA。首先，用转录激活因子样 （TAL） 蛋白或由催化失活形式的 Cas9 和向导 RNA 组成的成簇规则间隔短回文重复序列 （CRISPR） 复合物标记感兴趣的基因组区域。随后，染色质通过超声处理交联并碎裂。然后对标记的基因座进行免疫沉淀并逆转交联。最后，分别对与分离的染色质相关的蛋白质或 RNA 进行质谱或 RNA 测序分析。这种方法可以成功鉴定与感兴趣的基因组区域相关的蛋白质和 RNA。

引言

与感兴趣的特定基因组区域相关联的分子的识别，需要理解的基因组功能，例如转录和表观遗传调控调节的机制。虽然几种技术已经开发了用于特定的基因组区域^1-7中的生化分析，它们没有被广泛使用，因为其固有的问题，如有限的应用程序（例如，只对于高拷贝数或基因座基因座与重复），并在此阶段太多的时间和努力需要。

为了容易地执行特定的基因组区域的生化分析，我们已经开发了两种基因座特异性染色质免疫沉淀技术，即插入的ChIP（Internet控制器^）8-13和工程化DNA结合分子介导的^{ChIP（enChIP）14-17} 。在Internet控制器，感兴趣的基因座是由标记的外源DNA结合蛋白如莱克斯插入识别序列答轨迹然后通过使用标记的DNA结合蛋白的亲和纯化分离。在enChIP，工程化DNA结合分子，如锌指蛋白，转录激活物状（TAL）的蛋白质，和群集定期相互间隔短回文重复序列（CRISPR）配合物，用于标记的感兴趣位点（ 图1）。随后，将基因组区域被标记的DNA结合分子的亲和纯化分离。

之一的enChIP过Internet控制器的一个优点是，插入的外源DNA结合蛋白的识别序列是没有必要的。靶向使用CRISPR络合物选自Cas9（dCas9）的无催化活性的形式的和导向的RNA（gRNA）位点比这些区域通过Internet控制器或enChIP使用TAL和锌指蛋白靶向容易得多。这里，我们描述了一步一步的协议enChIP与质谱联用和RNA测序（RNA片段）识别位点Associa大泰德蛋白质和RNA的分别。

方案

工程DNA结合分子认识到目标轨迹的1.设计

1. 对于使用CRISPR复合enChIP，使用CRISPRdirect网络工具（http://crispr.dbcls.jp），以确定所关注形容为先前¹⁸的基因组区域的候选gRNA靶序列。此Web工具将返回表格23 bp的基因组位点_5'-N 20 NGG-3'的目标区域内。
2. 合成一个gBlock包括U6启动子序列和5'- _N 20中_5'-N 20 NGG-3'使用商业服务的序列（ 见图 ^2）19,20。用于亚克隆的目的，包括gBlock以外适当的限制性酶位点。
3. 插入gBlock到适当的载体如先前所述^16。对于gBlocks几个逆转录病毒载体（请参阅材料 ）。
4. 对于使用TAL蛋白enChIP，设计TAL蛋白识别TARG等位点。生成质粒编码使用商业服务TAL蛋白。产生含有稠合有一个或多个标记，如3×FLAG如前所述¹⁵的TAL蛋白质的表达载体。

2.建立细胞的enChIP分析

1. 表达3×FLAG-dCas9和gRNA（CRISPR基于程序）或3×FLAG-TAL（TAL蛋白质基过程）在细胞中被如先前所描述的^14-17进行分析。
   1. 使用瞬时转染，如果转染效率是高的。可含有3×FLAG-dCas9和CMV启动子的表达载体（ 见材料）。
   2. 考虑建立稳定的转化使用常规方法，如果瞬时转染效率是低的。除了 ​​为gBlock上述逆转录病毒载体，是3×FLAG-dCas9的反转录病毒载体可用（ 参见材料）。
2. 通过使用如先前^14-17描述的抗FLAG抗体（抗体）免疫印迹分析确认3XFLAG-dCas9或3XFLAG-TAL蛋白在转染细胞中的表达。
   注意:这些标记的蛋白质的表达，也可以通过细​​胞内染色用抗FLAG-FITC和随后的FACS分析证实。一种协议，用于细胞内染色可以从我们的主页（http://www.biken.osaka-u.ac.jp/lab/microimm/fujii/iChIP_protocols/english.html）下载。
3. 确认gRNA通过标准的RT-PCR法表达。
4. 蛋白质与感兴趣的基因组区域相互作用的定量识别，可以考虑使用稳定同位素标记的通过在细胞培养物（SILAC）分析结合enChIP（enChIP-SILAC）氨基酸。
   注:媒体的SILAC分析，可以从商业供应商处购买。 SILAC是在检测特异性相互作用强大。
   1. 培养细胞SILAC重介质。准备细胞文化前进红色在SILAC光介质作为阴性对照。使用至少5×10 7个细胞的每个SILAC介质（重或轻）。为有效的标记，同时添加L-赖氨酸2HCl的，13 C 6和L-精氨酸盐酸，在SILAC重媒体13 C 6，15 N 4。注:至少有五细胞分裂所必需的标签蛋白。
      1. 例如，培养人纤维肉瘤HT1080细胞稳定表达3XFLAG-dCas9和gRNA在37℃和_5％的CO 2在DMEM培养基SILAC和透析的胎牛血清与赖氨酸2HCl的加L-精氨酸盐酸（光介质）或¹³ _C 6 L-赖氨酸二盐酸盐加^{13 C} ₆ ¹⁵ _N 4 L-精氨酸盐酸（重介质）（ 见材料^）16。添加50毫克轻或重的L-赖氨酸-2HCl的和L-精氨酸盐酸在500毫升培养基中。
      2. Trypsinize和replate细胞才汇合，使细胞保持指数growtH。

3.交联细胞与甲醛

1. 对细胞悬浮培养，转移^2×10 7细胞表达3XFLAG-TAL蛋白质或3XFLAG-dCas9加gRNA和暂停在30ml常规培养基在50ml离心管中。当使用更多的细胞，提高试剂的数量和金额比例。对于SILAC实验，混合在重介质或光介质（各^5×10 7个细胞）培养的细胞和^1×10 8个细胞的总分为5试管含有^2×10 7细胞。
2. 添加810微升37％的甲醛的30毫升细胞悬浮液（最终浓度1％），并在37℃下5分钟。对于贴壁细胞，直接通过加入810微升37％的甲醛至30ml培养基中固定的细胞在培养皿中。
3. 停止交联通过加入3.1毫升1.25M的甘氨酸溶液（最终浓度127毫摩尔），和在室温下孵育10分钟。
4. 通过离心（300×g下5分钟，4℃）收集细胞。小心弃去上清液，包括甲醛，并将其存储在适当的废液瓶。
   1. 对于贴壁细胞，分离细胞用细胞刮刀和收获在50ml管中，并作为本步骤中所述收集细胞。
   2. 对于SILAC实验，混合在重介质或光介质^（5×10 7个细胞每）培养分离的细胞^，1×10 8个细胞的总分为5试管含有^2×10 7细胞，并如在本描述的收集细胞步骤。
5. 每管洗细胞沉淀用30ml的PBS两次。小心弃去上清液，包括甲醛，并根据化学品的安全指导方针将其存储在bottle.Handle甲醛废适当的废物。固定的细胞可以冷冻并储存于-80℃。

4.制备染色质（每2×10^7细胞 ）

1. 暂停固定的细胞在10毫升细胞裂解缓冲液（10mM的Tris（pH 8.0）中，1毫摩尔EDTA，0.5％IGEPAL CA-630，和1×蛋白酶抑制剂），并在冰上孵育10分钟。
2. 离心样品（830×g下在4℃，8分钟），小心弃去上清液。
3. 暂停沉淀在10ml核裂解缓冲液（10毫摩尔Tris（pH值8.0），1mM EDTA中，0.5M氯化钠，1％的Triton X-100，0.5％脱氧胆酸钠，0.5％月桂酰肌氨酸，和1x蛋白酶抑制剂）。冰上孵育10分钟，并涡旋振荡每2-3分钟。
4. 离心样品（830× 在4℃，8分钟g），并小心地弃去上清液。
5. 在10ml PBS中洗涤沉淀。将沉淀（染色质级分）可以储存在-80℃之后在液态氮立即冻结。

5.超声处理的染色质（每^2×10 7细胞）

1. 暂停在800微升的染色质部分改进的裂解缓冲液3（10毫摩尔Tris（pH值8.0），1mM EDTA中，150 mM氯化钠，0.1％脱氧胆酸钠，0.1％SDS中，和1x蛋白酶抑制剂），并转移到1.5ml试管。
2. 超声处理使用超声波仪（参见材料）的染色质和条件如下:输出:3;税:100％（连续）;时间:自由。执行超声处理10-18个循环持续10秒和在冰上冷却20秒。为了避免过热，孵育样品在冰上2分钟，每5-6个周期。为了避免起泡，保持声处理探针0.5厘米管子的底部上方的尖端的位置。
3. 离心样品（16,000×g下在4℃下进行10分钟），将上清转移到1.5ml试管。将超声处理的染色质可以储存在-80℃之后在液态氮立即冻结。

6.评估染色质碎片的

1. 混合10微升片段化的染色质与85微升蒸馏水。
2. 加入4微升和的5 M氯化钠孵育在65℃CO / N。
3. 加入1微升10毫克/毫升RNA酶A和孵育在37℃下45分钟。
4. 加入2微升的0.5M EDTA（pH 8.0）中，4微升的1M Tris（pH6.8）中，和1微升20mg / ml的蛋白酶K，再孵育在45℃下1.5小时。
5. 单独的10微升样品通过电泳中不包含染色染料，如SYBR绿1％琼脂糖凝胶。
6. 染色凝胶来评价零散染色质的长度的分布。产生0.5-2 kbp的（范围0.2-4千碱基对）的平均长度条件，推荐。
7. 纯化通过苯酚-氯仿提取或通过使用DNA提取试剂盒（ 参见材料）从其余样品的DNA。将纯化的DNA可以作为输入的DNA来估计enChIP分析的产率（见8.11）。

7.制备磁珠共轭与抗体（每^2×10 7细胞）

1. 预削2 1.5 ml的管，一个用于使用正常小鼠IgG预澄清，另一个用于孵育抗FLAG抗体。添加150微升蛋白G偶联的磁珠（参见材料），以每管。
2. 将管上的磁体支架，等待3分钟。弃去上清液吹打。
3. 暂停在1ml PBS中含有0.01％Tween-20（PBS-T）的珠。将管上的磁性底座，等待2分钟。弃去上清液吹打，然后重复步骤。
4. 暂停在1ml含有0.1％BSA的PBS-T中的珠子。
5. 加入15微克正常小鼠IgG或抗FLAG抗体和旋转4°CO / N。
6. 后短暂离心，然后将管上的磁体支架，等待3分钟。弃去上清液吹打。
7. 暂停在1ml的PBS-T中的珠子。反转样品几次后短暂离心。将管上的磁体支架，等待3分钟，然后通过移液丢弃上清液。重复洗两次用PBS-T（总共三个洗涤步骤）。

8.染色质免疫沉淀（每^2×10 7细胞）

1. 混合在5.3中制备的分散的染色质）（约800微升）与五分之一体积的（大约200微升含5％的Triton X-100（1％的Triton X-100的最终浓度）改进的裂解缓冲液3）。
2. 添加染色质溶液，以在其中结合有正常小鼠IgG蛋白G偶联的磁珠制备的管。旋转，在4℃下进行1小时。
3. 将管上的磁体支架，等待3分钟。
4. 将上清液转移到在其中结合有抗FLAG抗体蛋白G偶联的磁珠制备的管。旋转，在4°CO / N。
5. 将管上的磁体支架，等待3分钟。弃去上清液吹打。
6. 暂停在1ml的低盐缓冲液（20mM的Tris（pH 8.0）中，2毫摩尔EDTA，150毫摩尔NaCl，1％三珠吨X-100，0.1％SDS中，和1x蛋白酶抑制剂），并旋转，在4℃下5分钟。将管上的磁体支架，等待3分钟。弃上清，吹打，重复清洗步骤。
7. 洗用高盐缓冲液（20mM的Tris（pH 8.0）中，2毫摩尔EDTA，500毫摩尔NaCl，1％的Triton X-100，0.1％SDS中，和1x蛋白酶抑制剂）的两倍珠。
8. 洗用的LiCl缓冲液（10mM的Tris（pH 8.0）中，1毫摩尔EDTA，250毫的LiCl，0.5％IGEPAL CA-630，0.5％脱氧胆酸钠，和1x蛋白酶抑制剂）的两倍珠。
9. 洗用TBS-IGEPAL CA-630（50毫摩尔Tris（pH值7.5），150 mM氯化钠，0.1％IGEPAL CA-630，和1x蛋白酶抑制剂）一旦珠。
10. 暂停在200μl洗脱缓冲液的珠（50毫摩尔Tris（pH值7.5），150 mM氯化钠，0.1％IGEPAL CA-630，1×蛋白酶抑制剂，和500微克/毫升3×FLAG肽）和在37℃下20分钟。将管上的磁体支架，等待3分钟。将上清液转移到一个新的1.5毫升管，并重复ELUT离子一步。
11. 净化洗脱液通过苯酚-氯仿提取或通过使用DNA提取试剂盒的DNA小部分（例如，5％）（见材料）。将纯化的DNA可用于PCR用特定引物集来估计产量enChIP分析由与如先前^14,16所述制备步骤6.7输入的DNA进行比较。

9. SDS-PAGE，染色，质谱分析

1. 混合洗脱物（400微升）用1毫升2-丙醇，加入50μl3M乙酸钠（pH 5.2）和5微升20毫克/毫升糖原。沉淀的染色质在-20℃CO / N。
2. 离心样品（16,000×g下在4℃下30分钟）并弃去上清液。冲洗用1ml 70％乙醇，离心再次的粒料（16,000×g下在4℃下进行10分钟）。吹打完全弃上清。
3. 暂停在40微升2×样品缓冲液（125毫摩尔Tris（pH6.8）中，10％的2-MERC沉淀aptoethanol，4％SDS，10％蔗糖和0.004％溴酚蓝）。涡旋5分钟，以完全溶解沉淀，然后孵育在100℃下30分钟以变性蛋白和逆转交联。
4. 对于SDS-PAGE凝胶上的运行40微升样品直至染料达到1厘米以下的井。注意:我们通常使用4-20％梯度凝胶，但其他％凝胶可以使用。
5. 染色用考马斯亮蓝或银染的凝胶。
6. 切胶成五片（2 mm高）。
7. 如先前^13-16说明进行凝胶消化和质谱分析。
8. 对于SILAC实验用^5×10 7个细胞每（总共^1×10 8个细胞），从最初的5管在40微升2×样品缓冲液（这是没有必要按比例增加）暂停粒料。

10.纯化RNA和RNA测序分析

1. 为了净化enChIP后的RNA，加酶抑制剂的5单位/毫升（SEë材料），以所有的缓冲溶液，除改进的裂解缓冲液3和洗脱缓冲液中，向其中添加RNA酶抑制剂的40单位/毫升。
2. 混合洗脱物（400微升），16微升的5M NaCl和孵育在65℃下2小时。
3. 加入1毫升酸 - 胍 - 酚系试剂（参见材料）到样品中。涡旋15秒，然后在室温下孵育5-15分钟。离心样品15分钟，12000×g下和室温。
4. 上清转移到一个新的1.5毫升管，加入5微升对溴苯甲醚的。涡旋15秒，然后在室温下孵育3-5分钟。离心样品以12,000×克和RT 10分钟。
5. 转移上清液（约1毫升）到新的2ml管中，加入1毫升2-丙醇。倒置该管并在室温下孵育10分钟。装载到混合物中的RNA纯化试剂盒的柱（ 参见材料）。离心列在12000×1分钟 G和RT。
6. 洗用400μl的RNA洗涤缓冲液中的RNA纯化试剂盒（参见材料）的列。
7. 的5微升DNA酶I（1U /微升），8微升10×DNA酶I反应缓冲液，3微升DNA酶/无RNase水，和64微升的RNA洗涤缓冲液中添加80μl的DNA酶I的鸡尾酒（混合物的RNA纯化试剂盒（参见材料））到柱上。孵育样品在37℃下进行15分钟，然后在12000×g下和RT离心30秒。
8. 用400微升RNA预洗缓冲液中的RNA纯化试剂盒（见材料）的两倍洗列。
9. 洗脱用50μlDNA酶/无RNase水的核糖核酸。将洗脱的RNA可用于RNA测序。

结果

总体而言，靶基因组区域的1-30％可使用enChIP纯化。 图3包括代表数据表示enChIP的产率分析靶向端粒和干扰素（IFN）调节因子1（IRF-1）基因的启动子。作为典型的结果，表1列出实施例与在IRF-1启动子中鉴定由enChIP-SILAC， 表一的IFNγ特异性方式相关的蛋白2列出确定enChIP与质谱联用端粒结合蛋白（enChIP-MS） ，和表3列出用确定enChIP-RNA测序端粒相关联的的RNA。

图 enChIP 1.概述 。 enChIP使用CRISPR（A，B）和 TAL（C，D，E 请点击此处查看该图的放大版本。

图2.序列gBlock的。U6启动子（黑色），对G核苷酸b安伏的导向序列（蓝色），引导序列（gRNA间隔物）（红色），所述支架序列（绿色），及终止子序列（橙色）被示出。

图3.产量的代表enChIP分析 。 （A）中的百分比的输入为目标的IRF-1基因座和非靶Sox2的基因座。 （B）的百分比的输入为目标端 ​​粒和非目标γ-卫星。该数字已调整，并从以前的出版物^15,16修改。

分类	蛋白质
转录	DDX1，PARP1，CKAP4，Pescadillo同源，PURβ， 活化的RNA聚合酶II转录激活p15基因， BTF3，Myb的结合蛋白1A
组蛋白脱乙酰化， 辅阻遏物成分	RBBP4，PA2G4，TBL3
乙酰转移酶	蛋白质精氨酸N-甲基转移酶1
DNA拓扑异构酶	DNA拓扑异构酶2α
组蛋白	组蛋白H2A.Z，组蛋白H3.2

表1:用 在确定enChIP-SILAC一个IFNγ特异性方式的人IRF-1的启动子区相关的蛋白质的例子的表已被改编从先前的出版物^16。

分类	蛋白质
哺乳动物端粒结合蛋白	PML，RPA，CDK1，PARP1，PCBP1
端粒碧在酵母nding蛋白质 或其他生物	IMP4
与蛋白质相互作用的端粒结合 蛋白质[相关端粒结合蛋白]	DNA聚合酶α（POLA1）Cdc13p] ARMC6 [TRF2]，CTBP1 [FOXP2-POT1] exportin-5 [叔]，GNL3L [TRF1] exportin-1 [叔]，14-3-3 [叔]
蛋白定位于异	BEND3
蛋白质调控的表观遗传标记	KDM5C
蛋白质的突变影响端粒功能	DNA聚合酶α（POLA1），HAT1，Nup133， CDK7，DPOE1，PRDX1，TYSY， 谷氨酸半胱氨酸连接酶，谷，SMRC1

表2:用 确定enChIP-MS鼠标端粒相关蛋白的例子表已adapted从以前的出版物^15。

分类	RNA的
端粒酶组件	TERC，RMRP
端粒的RNA	TERRAS
scaRNAs	Scarna6，Scarna10，Scarna13，Scarna2
H / ACA 52]形成	Snora23，Snora74a，Snora73b，Snora73a
C / D 52]形成	Snord17，Snord15a，Snord118
lncRNA	Neat1

表3: 具有确定enChIP-RNA的序列表已被改编自先前公布¹⁷ 鼠标端粒相关的RNA的例子 。

讨论

在这里，我们描述了使用工程化DNA结合分子（如CRISPR系统和TAL蛋白）纯化特定基因组区域，以及鉴定与这些基因组区域结合的蛋白质和RNA。工程化 DNA 结合分子与基因组的结合可能会影响染色质结构，包括核小体定位，并可能废除基因组功能，如 CRISPR 干扰实验²¹ 中所述。为了避免这些潜在的异常影响，我们提出了选择目标基因组区域的具体指南。首先，为避免潜在抑制RNA聚合酶和转录因子的募集，以及破坏转录起始位点周围的核小体定位，启动子区域分析的目标区域应为转录起始位点上游（5'）的数百个碱基对。相比之下，在分析具有不同边界的基因组区域（例如增强子和沉默器）时，可以针对与这些区域直接并列的基因组区域，因为工程 DNA 结合分子的结合不太可能影响其功能。此外，最好避免使用不同物种之间保守的靶区，因为重要的DNA结合分子经常与进化保守的区结合，抑制它们的结合可能会破坏靶基因组区的功能。在这方面，始终有必要检查目标基因组区域的功能是否在用于 enChIP 分析的已建立细胞中得到维持。由于可以轻松测试多个 gRNA，并且生成识别不同靶基因组区域的多个版本的 TAL 或锌指蛋白既繁琐又昂贵，因此使用 CRISPR 的 enChIP 比使用其他蛋白质的 enChIP 更具优势。

已经表明，dCas9 与脱靶位点结合，尽管对这些位点的亲和力可能弱于对靶位点的亲和力^22-25。有几种方法可以管理与这些脱靶位点结合的分子的污染。首先，建议使用几种（至少两种）不同的 gRNA。在使用不同 gRNA 的 enChIP 中常见的那些分子将是真阳性。其次，比较 enChIP 的不同条件将有效消除对非特异性分子和与脱靶位点结合的分子的污染。这些比较集的示例是 （i） 刺激 （-） 和 （+），或 （ii） 不同的细胞类型，例如 T 细胞与 B 细胞。最后，应对候选分子的结合进行定量分析，以确认它们与靶位点的特异性结合。优选制备仅表达dCas9而不表达gRNA的细胞作为阴性对照。

使用enChIP分析，我们能够成功鉴定出许多与特定基因组区域相互作用的已知和新型分子（表1-3）^14-17。然而，该技术未能检测到与这些区域相互作用的其他一些已知蛋白质。例如，据报道，STAT1在IFNγ刺激8时与 IRF-1 启动子^结合，但我们的enChIP-SILAC分析没有检测到STAT1作为诱导与该基因组区域相互作用的蛋白质¹⁶。此外，在端粒的 enChIP-MS 分析中，我们没有检测到由 TRF-1 和 TRF-2¹⁵ 组成的庇护蛋白蛋白，这些蛋白已被证明与端粒相互作用²⁶。造成这些差异有几个潜在原因。首先，Stat1 与 IRF-1 启动子结合的化学计量可能非常低。enChIP-MS（包括 enChIP-SILAC）可以检测与靶基因组区域更丰富相关的蛋白质是合理的;因此，可能需要分析更多细胞来检测这些蛋白质。MS仪器灵敏度的提高也有助于有效检测具有低化学计量结合的蛋白质。其次，一些蛋白质，可能包括 Stat1 和庇护所，可能是 MS 分析的困难靶标。第三，在我们对端粒结合蛋白¹⁵ 的分析中，识别端粒的 3×FLAG-TAL 蛋白 （3×FN-Tel-TAL） 可能以竞争性方式阻断了庇护所与端粒的结合。

与使用 enChIP 检测与特定基因组区域结合的转录因子相对困难相比，我们使用 enChIP 分析成功鉴定了表观遗传调节因子，例如组蛋白修饰酶。这项技术的成功可能是由于表观遗传调节因子与广泛的基因组区域结合;因此，每个基因组区域有更多的蛋白质可用于 MS。由于表观遗传调节因子越来越被认为是治疗癌症等疑难杂症药物的重要靶点，因此enChIP将成为鉴定表观遗传药物靶点的有用工具。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
gBlock 合成服务	Life Technologies	基因合成 GeneArt
gBlock 合成服务	IDT （Integrated DNA Technologies）	gBlocks 基因片段
pSIR-neo	Addgene	51128
pSIR-GFP	Addgene	51134
pSIR-DsRed-Express2	Addgene	51135
pSIR-hCD2	Addgene	51143
TAL 合成服务	Life Technologies	GeneArt Precision TAL
3xFLAG-dCas9/pCMV-7.1	Addgene	47948
3×FLAG-dCas9/pMXs-puro	Addgene	51240
3&次;FLAG-dCas9/pMXs-IG	Addgene	51258
3&次;FLAG-dCas9/pMXs-I2	Addgene	51259
3&次;FLAG-dCas9/pMXs-neo	Addgene	51260
抗 FLAG M2 抗体	Sigma-Aldrich	F1804
FITC 偶联的抗 FLAG M2	Sigma-Aldrich	F4049
用于 SILAC	Life Technologies	89985	其他培养基可从 Life Technologies 的
透析 FBS 购买 用于 SILAC	Life Technologies	89986
L-赖氨酸-2HCl用于 SILAC	Life Technologies	89987	用于轻质介质
L-精氨酸-HCl 用于 SILAC	Life Technologies	89989	用于轻质介质
L-赖氨酸-2HCl，13C6 用于 SILAC	Life Technologies	89988	用于重介质
L-精氨酸-HCl，13C6,15N4 用于 SILAC	Life Technologies	89990	用于重介质
完整、迷你、不含 EDTA	的 Roche Diagnostics	4693159
超声波干扰器 UD-201	Tomy Seiko
ChIP DNA Clean &浓缩器	Zymo Research	D5205
Dynabeads-Protein G	Life Technologies	DB10004
RNasin 加 RNase 抑制剂	Promega	N2611
Isogen II	Nippon Gene	311-07361
Direct-zol RNA 小量制备试剂盒	Zymo Research	R2050
LTQ Orbitrap Velos	Thermo Fisher Scientific		用于 MS 分析的 nanoLC-MS/MS 系统的组件
nanoLC	Advance，Michrom Bioresources		MS 分析的 nanoLC-MS/MS 系统组件 用于 MS 分析的
HTC-PAL 自动进样器	CTC 分析		MS 分析的 nanoLC-MS/MS 系统的组件