为了研究满足多种检测需求的简易制备方法，我们开发了一种由棉质材料制成的吸液通道系统。该装置被用于构建多指标检测平台，并解决了常影响基于侧向流动的生物医学设备的污染问题，实现了对亚硝酸盐、总蛋白和尿胆原的临床尿液分析。
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摘要
摘要
一种坚固、低成本的分析装置应当具备用户友好、快速且经济实惠的特点。此类装置还应能够使用微量样本进行操作，并为后续治疗提供信息支持。本文展示了基于棉纤维的尿液分析（即 亚硝酸盐、总蛋白和尿胆原检测）分析装置的开发，该装置采用侧向流动模式，具有成本低、易于制备、检测快速等优点，且可在无交叉污染风险的情况下同时进行多项检测。棉纤维由具有天然吸附性能的纤维素纤维构成，可被用于基于流动的分析。本研究详细描述了这种基于棉纤维的分析装置简单而精巧的制备过程。棉结构与检测垫的布局充分利用了各材料的疏水性与吸附强度。由于这些物理特性，比色结果能够持续稳定地附着在检测垫上。该装置可使临床医生及时获取临床信息，在早期干预方面展现出巨大应用潜力。
引言
开发价格低廉、性能稳定且易于使用的即时检测（POC）诊断设备，对于改善全球健康状况至关重要1,2。特别是由纤维素基质（例如，纸张、丝线和棉花）构成的设备，由于其广泛可得、成本低、使用简便、稳定性好，并能快速提供检测结果，已成为低成本分析领域极具前景的分析平台3-7。
在此，我们介绍一种基于棉质材料的分析装置的开发，该装置采用侧向流动形式用于尿液分析。这种棉质分析装置提供了一种替代性检测方法，具有多项关键优势：i）制备过程所需人力极少；ii）成本低廉；iii）可同时进行多种不同检测，且无需担心交叉污染；iv）装置独立性 即，无需额外设备和/或电力即可运行；以及 v) 快速性（比色法检测可在10分钟内完成）。
这种基于棉花的分析装置的结构可分为四个部分：i）外部具有天然疏水层的棉花，本身具有疏水性；ii）内部具有亲水性、可作为液体毛细传输通道的棉花；iii）用于固定并压缩棉花的覆膜，其上钻有孔洞，用于放置反应/测试垫；以及 iv）色谱纸测试垫，其表面涂覆或嵌入了反应性试剂，置于棉花的外表面（具体位于覆膜上钻出的孔洞位置），作为比色分析（即 亚硝酸盐、总蛋白、pH 和尿胆原检测）的反应区域并显示结果。
该检测方法的基本原理如下。基于棉质材料的分析装置上刻有穿透棉层深度一半的划线，以形成流体通道，使样品液体能够到达所使用的反应垫。将分析装置的吸水边缘浸入目标样品中，溶液即通过毛细作用沿流体通道从吸收端流向检测垫（图1）。由于检测垫的吸水能力强于棉材料，被检测垫吸收的溶液会牢固地保留在检测垫纸内部，不会回流至流体通道中，从而使比色结果稳定地固定在检测垫材料上。反应结束后，通过台式扫描仪记录比色结果，并利用图像分析软件进行分析。
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方案
警告：必须遵守正确的实验室卫生规范。使用此即时检测（POC）设备时，必须佩戴手套并采取普遍预防措施。若未正确执行充分的消毒程序，可能导致结果污染或感染。
1. 准备试纸条装置
- 通过接触角测量确定清洁棉外层的疏水性8 (图3).
- 使用裁纸刀将脱脂棉裁剪成 5.5 cm × 1 cm 的条状，制备棉基分析装置图2A).
- 钻孔（ø 在标准覆膜片材上，以三孔为一行打孔，孔径为 0.5 cm；相邻两孔之间的距离为 1 cm。
注意：使用一张标准尺寸的覆膜片（5.5 cm × 2 cm），最多可制作36条独立的试纸，每条试纸包含三个测试区域图 2B). - 将清洁棉（具有外层疏水、内层亲水的特性）夹在两片覆膜之间， 即，一侧为打孔的覆膜片，另一侧为未打孔的覆膜片（无孔）。将该组件放入覆膜机中进行封装。此步骤可增强装置的机械强度，并提供一层外部不透性保护层。
注意：覆膜后，孔的直径将从 0.5 cm 缩小至约 0.47 cm。每个孔的周边区域，清洁棉与覆膜之间会残留轻微缝隙。这些微小缝隙有助于后续步骤中测试垫圆片的定位放置。 - 使用剪刀从组装件上裁剪出单个尺寸为 5.5 cm × 1 cm 的试纸条装置。 即，钻孔的层压板/棉垫/未钻孔的层压板 "三明治" (图2C共制作 48 个装置，用于后续所述的标准曲线制备（硝酸盐检测用 18 个装置，BSA 检测用 15 个装置，尿胆原检测用 15 个装置）。
- 使用锋利的刀片或剃刀，从每个测试区域（未被覆膜覆盖的部分）的中心开始，穿过测试区域的疏水层，直至纵向装置的亲水层，切割出一条狭缝（作为微流通道），注意切割深度应为夹层装置总厚度的一半图 2D).
- 应用试纸测试垫（ø = 0.5 cm）的方法，将其滑入覆膜上每个孔边缘的间隙中图2E).
2. 准备尿液分析的标准品和指示剂溶液
- 通过将69.0 mg亚硝酸钠溶解于100 ml去离子（DI）水中，配制10.0 mM亚硝酸盐储备液。用去离子水稀释亚硝酸盐储备液，配制一系列亚硝酸盐浓度标准溶液（2,500、1,250、625、312、156和78 µM）（图4A）。
- 通过将415 mg牛血清白蛋白（BSA）溶解于100 ml磷酸盐缓冲液（PBS）（10 M磷酸盐缓冲液、0.0027 M氯化钾和0.137 M氯化钠；pH 7.0）中，配制60 µM牛血清白蛋白（BSA）储备液。用去离子水稀释BSA储备液，配制一系列BSA浓度标准溶液（30、15、7.5、3.75和1.875 µM）（图4B）。
- 通过将2.5 g尿胆原溶解于100 ml去离子水中，配制25 g/L尿胆原储备液。用去离子水稀释尿胆原储备液，配制一系列尿胆原浓度标准溶液（7.8、15.6、31.2、62.5和125 mg/L）（图4C）。
- 配制含50 mM磺胺、330 mM柠檬酸和10 mM N-(1-萘基)乙二胺二盐酸盐的亚硝酸盐指示液。
- 配制含250 mM柠檬酸盐缓冲液（pH 1.8）和3.3 mM四溴酚蓝乙醇溶液（95%乙醇）的BSA指示液。
- 配制含0.1 M 4-二甲氨基苯甲醛的尿胆原指示液。
3. 准备指示垫
- 裁剪三个圆形垫片或圆盘（ø = 0.5 cm）的色谱纸，并将其分别（每个检测对应三联试纸条上的一个检测）插入各个试纸装置中，以建立溶液标准曲线（第4节）。
- 在组件的三个覆膜孔的每一个处，观察裁切孔最边缘处覆膜与棉质测试垫之间存在轻微间隙。注意，覆膜上的孔直径略小于纸质测试垫的孔。
注意：这些特征共同作用，使得试纸测试垫能够贴合在装置的棉质测试垫部分，从而使试纸测试垫的边缘插入前述狭缝间隙中。 即，置于覆膜孔的边缘下方，以固定纸张测试垫。 - 制备设备的亚硝酸盐检测部分。
- 用 4 涂覆亚硝酸盐检测垫 µl 的亚硝酸盐指示剂溶液（在步骤 2.4 中配制），并在室温下使其完全干燥。
- 制备检测装置的总蛋白检测部分。
- 将总蛋白检测垫用 4 µ加入10 µl BSA指示剂溶液（按步骤2.5配制），并在室温下完全干燥。
- 制备检测装置的尿胆原检测部分。
- 用 4 涂覆尿胆原检测垫 µl 尿胆原指示剂（步骤 2.6 中制备）并使其在室温下完全干燥。
4. 为基于棉质的分析装置创建标准曲线
- 每制备一种标准品，将已制备好并预载有检测试剂（参见第3.4节）的装置的吸水端浸入标准溶液中10秒（吸收体积约为200–300 µl）（图2F）。
- 将基于棉纤维的装置置于常温环境中10分钟，以完成比色反应（图2F）。每个实验重复三次。
- 扫描该装置，以分析各检测垫上发生的比色变化（图2G）。将反应后的检测垫放置在台式扫描仪的玻璃板上，以600 dpi的图像分辨率在RGB模式下扫描检测垫。将每幅图像以jpeg格式保存。
- 使用图像分析软件在计算机上分析扫描所得图像，以确定各检测区域相应的颜色强度（图2H）。
- 在 http://imagej.nih.gov/ij/ 下载ImageJ软件。打开扫描得到的图像文件。在菜单命令中选择“Image”，然后选择“Type”，将RGB图像转换为8位灰度图像。
- 使用工具栏中的“Oval”工具选择检测垫的分析区域。在菜单命令中选择“Analyze”，然后选择“Measure”以分析颜色强度。记录平均强度结果。
- 建立亚硝酸盐、总蛋白和尿胆原检测的标准曲线（图2I）。
- 使用统计软件，在二维坐标系中标注不同浓度的亚硝酸盐、总蛋白和尿胆原标准溶液及其对应的平均强度结果。
- 采用二次模型拟合亚硝酸盐检测的标准曲线，采用线性回归模型拟合总蛋白和尿胆原检测的标准曲线。
5. 使用已建立的标准曲线值确定未知样品浓度
- 为测定未知溶液中亚硝酸盐、总蛋白和尿胆原的浓度，可使用该设备按照测定标准溶液浓度的方法进行操作，并将亚硝酸盐、总蛋白和尿胆原检测测得的强度结果代入步骤2中建立的模型方程中。
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结果
我们成功展示了利用市售清洁棉开发基于棉纤维的分析装置，该清洁棉具有亲水性（内部区域）和疏水性（外部区域）的特性（图1A）。图3展示了接触角测量的结果，外部棉纤维的疏水界面接触角为127.35° ± 4.73°。从用户友好的角度出发，本研究中采用的比色分析法可直接通过肉眼观察，并可通过颜色强度分析进行进一步定量（图2F）。正常个体尿液中的总蛋白含量应低于150 mg/dL（4 µM）。尿液中亚硝酸盐离子的水平与尿路感染或细菌感染相关，因此在开发用于亚硝酸盐检测的分析装置时，其检测灵敏度应尽可能低。尿胆原经粪便排出后通过肠肝循环被重新吸收，但尿液中仍可检测到一定水平的尿胆原，约为1–4 mg/天。图4A–C展示了我们为每种检测目标物建立标准曲线的实验结果。这些标准曲线通过分析比色反应的平均强度，并将其与已知标准浓度进行比较而建立，从而可评估各检测方法的检测限（LODs）。在缓冲体系中，亚硝酸盐、BSA和尿胆原...
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讨论
本方案中的关键步骤包括确定合适的棉质材料（具有不同的疏水性/亲水性）与滤纸（层析滤纸或定量滤纸）的组合。经过周密设计并正确实施的装置结构，可使比色分析达到最佳性能。根据我们的比色分析结果，本文所展示的基于棉质材料的分析装置在多种疾病检测方面展现出巨大的应用潜力。
目前大多数基于侧向层析的产品（例如，妊娠检测）仅能提供单一的检测功能14。尽管某些试纸条可进行多生物标志物检测15，但其使用存在样品交叉污染的风险，因为检测试剂会直接接触样本。我们的装置克服了这一障碍，能够在单一的基于侧向层析的通道装置中实现多种比色检测。
该方法仅受目标分析物分子大小的限制。亚硝酸盐的 R2 值和检出限（LOD）远高于其他检测物（BSA 和尿胆原），表明我们的装置更适用于小分子分析5（图 4）。
为了提高该设备在临床实践中的实用性，可能仍需...
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。S.C.L.、C.M.K.、F.G.T. 和 C.M.C. 是基于本论文所报道工作的专利（专利号：US 8691162 B1）的发明人，该专利由台湾清华大学拥有。S.C.L.、C.M.K.、F.G.T. 和 C.M.C. 在中国台湾和中国大陆基于本论文所报道的工作有正在申请的专利。M.Y.H. 声明不存在潜在的利益冲突。
致谢
本工作部分得到了中国台湾科技部（MOST 104-2628-E-007-001-MY3（CMC））和台中荣民总医院（TCVGH-1056904C (MYH)）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich, US | No. 9048468 | ≥ 99% |
| 亚硝酸盐 | Sigma-Aldrich, US | No. 7632000 | ≥ 99% |
| 尿胆原 | Santa Cruz Bio, US | No. SC-296690 | |
| 柠檬酸盐 | Sigma-Aldrich U.S | No. 6132043 | ≥ 99% |
| 四溴酚蓝 | Sigma-Aldrich U.S | No. 4430255 | ≥ 99% |
| 磺胺嘧啶 | Sigma-Aldrich U.S | No. 63741 | ≥ 99% |
| 柠檬酸 | Sigma-Aldrich U.S | No. 77929 | ≥ 99.5% |
| N-(1-萘基)乙二胺二盐酸盐 | Sigma-Aldrich U.S | No. 1465254 | ≥ 98% |
| 4-(二甲氨基)苯甲醛 | AlfaAesar, U.S | No. A11712 | ≥ 98% |
| 甲基红钠盐 | sigma, U.S | No. 114502 | ≥95% |
| 溴甲酚蓝 | sigma, U.S | No. 114413 | ≥95% |
| 资生堂化妆棉 | 资生堂, 日本 | No. 79014 | |
| 层析滤纸 | GE Healthcare Whatman, Springfield Mill, UK | No. 30306132 | |
| 塑料基材 | 覆膜胶片, MAS | A4 | 216 mm x 303 mm |
| 扫描仪 | microtek scanmaker | i2400 | |
| 切纸机 | Life 切纸机 | No.306 | |
| 覆膜机 | AURORA | LM4231H | |
| 覆膜机用膜 | UNI LAMI | 4A |
参考文献
- Yager, P., Domingo, G. J., Gerdes, J. Point-of-care diagnostics for global health. Annu. Rev. Biomed. Eng. 10, 107-144 (2008).
- Chin, C. D., Linder, V., Sia, S. K. Commercialization of microfluidic point-of-care diagnostic devices. Lab Chip. 12, 2118-2134 (2012).
- Lu, Y., Shi, W., Jiang, L., Qin, J., Lin, B. Rapid prototyping of paper-based microfluidics with wax for low-cost, portable bioassay. Electrophoresis. 30 (9), 1497-1500 (2009).
- Ballerini, D. R., Li, X., Shen, W. Flow control concepts for thread-based microfluidic devices. Biomicrofluidics. 5 (1), 014105(2011).
- Lin, S., et al. Cotton-based Diagnostic Devices. Scientific reports. 4, 6976-6976 (2013).
- Hsu, M. Y., et al. Monitoring the VEGF level in aqueous humor of patients with ophthalmologically relevant diseases via ultrahigh sensitive paper-based ELISA. Biomaterials. 35 (12), 3729-3735 (2014).
- Hsu, M. Y., et al. Monitoring VEGF levels with low-volume sampling in major vision-threatening diseases: age-related macular degeneration and diabetic retinopathy. Lab Chip. 15 (11), 2357-2363 (2015).
- Kwok, D., Neumann, A. Contact angle measurement and contact angle interpretation. Adv. Colloid Interface Sci. 81 (3), 167-249 (1999).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Butte, M. J., Whitesides, G. M. Patterned paper as a platform for inexpensive, low-volume, portable bioassays. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 46 (8), 1318-1320 (2007).
- Li, X., Tian, J. F., Shen, W. Quantitative biomarker assay with microfluidic paper-based analytical devices. Anal. Bioanal. Chem. 396 (1), 495-501 (2010).
- Coad, S., Friedman, B., Geoffrion, R. Understanding Urinalysis. medscape. 7 (3), 269-279 (2012).
- Kupka, T., et al. Accuracy of urine urobilinogen and bilirubin assays in predicting liver function test abnormalities. Ann. Emerg. Med. 16 (11), 1231-1235 (1987).
- Binder, L., et al. Failure of prediction of liver function test abnormalities with the urine urobilinogen and urine bilirubin assays. Arch. Pathol. Lab. Med. 113 (1), 73-76 (1989).
- Gubala, V., et al. Point of care diagnostics: status and future. Anal. chem. 84 (2), 487-515 (2011).
- Vaidya, V. S., et al. Urinary biomarkers for sensitive and specific detection of acute kidney injury in humans. Clin. Transl. Sci. 1 (3), 200-208 (2008).
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