我们介绍了两种互补的方法，利用荧光泛素化细胞周期指示剂（FUCCI）结合图像分析或流式细胞术，以鉴定并分离三维球状体中处于内层G1期阻滞和外层增殖区域的细胞。
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方法文章
基于成像和流式细胞术的三维黑色素瘤球体中细胞位置与细胞周期的分析
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
三维（3D）肿瘤球体在癌症研究中被用作更准确的模型 体内 肿瘤微环境，相较于传统的二维（2D）细胞培养模型，具有更高的生理相关性。球形体模型能够模拟细胞间相互作用、缺氧与营养剥夺以及药物渗透等效应。该模型的一个特征是形成坏死核心，其周围环绕着处于G1期阻滞的细胞环，而外层则为增殖活跃的细胞。在癌症研究领域，人们尤为关注球形体不同区域对药物治疗以及遗传或环境干预的响应差异。本文介绍了荧光泛素化细胞周期指示系统（FUCCI）结合流式细胞术及商业软件进行图像分析的方法，用于表征黑色素瘤球形体内部细胞所处位置与其细胞周期状态之间的关系。这些方法可用于在不同时间和实验条件下，追踪肿瘤球形体不同亚区域中细胞周期状态、基因/蛋白表达或细胞活力的动态变化。
引言
多细胞三维球体作为肿瘤模型已为人所知数十年，但直到最近才开始被更广泛地用作一种 体外 许多实体癌的模型。它们正越来越多地被用于高通量药物筛选，作为复杂、昂贵且耗时的 体内 模型以及简单、低成本的二维单层模型 1-6二维培养研究通常难以重复 体内多种癌症的球状体模型能够模拟实际肿瘤的生长特性、药物敏感性、药物渗透性、细胞间相互作用、氧气和营养物质的受限供应以及坏死的形成 体内 在实体瘤中 6-11类球体形成坏死核心，核心周围为静止期或G1期阻滞区域，类球体边缘则为增殖细胞 7这些区域的发育可能因细胞密度、增殖速率以及球体大小的不同而有所差异 12已有假说认为，这些不同亚区域中观察到的细胞异质性可能与癌症治疗耐药性有关 13,14因此，能够分别分析这些区域中的细胞对于理解肿瘤对药物的反应至关重要。
荧光泛素化细胞周期指示系统（FUCCI）基于对Cdt1和geminin分别进行红色（Kusabira Orange – KO）和绿色（Azami Green – AG）荧光标记，这两种蛋白在细胞周期的不同阶段被降解15。因此，细胞核在G1期呈红色，在早期S期呈黄色，在S/G2/M期呈绿色。本文描述了两种互补的方法，均利用FUCCI系统来识别细胞周期，并结合成像软件或染料扩散流式细胞术检....
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方案
1. FUCCI 转导与细胞培养
- FUCCI 转导
- 使用慢病毒共转导，建立稳定表达 FUCCI 构建体 mKO2-hCdt1 (30-120) 和 mAG-hGem (1-100) 的细胞系15，方法如前所述7。
注意：FUCCI 系统现已商业化提供。 - 通过单细胞分选获得荧光强表达的亚克隆。使用荧光激活细胞分选技术，将同时表达 AG 和 KO（呈黄色）的单细胞分选至 96 孔板中，方法如前所述7,16。
- 使用慢病毒共转导，建立稳定表达 FUCCI 构建体 mKO2-hCdt1 (30-120) 和 mAG-hGem (1-100) 的细胞系15，方法如前所述7。
- 黑色素瘤细胞培养
- 培养 C8161 人黑色素瘤细胞，方法如前所述7,17。
2. 三维球状体形成（如先前所述3,9）
- 琼脂糖平板制备
- 将1.5%琼脂糖（或优质琼脂）溶于100 ml Hank's平衡盐溶液（HBSS）或磷酸盐缓冲液（PBS）中，微波加热煮沸3–5分钟，并不断摇动，确保琼脂糖完全溶解。
- 使用多通道移液器，立即向平底96孔细胞培养板的每个孔中加入100 μl琼脂糖溶液。
注意：琼脂糖在枪头中可能会在短时间内凝固，因此若制备多个琼脂糖平板，需在不同平板之间更换枪头以避免此问题。....
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结果
生成肿瘤球体有多种方法，本方案采用非黏附生长法，即将细胞培养在琼脂或琼脂糖上3,7,9。图1展示了C8161黑色素瘤细胞在琼脂上培养3天后的球体示例。C8161细胞在培养3天后可形成大小均一的球体，直径为500–600 μm（均值=565，标准差=19，n=3）。其他可形成球体的黑色素瘤细胞系包括：WM793、WM983C、WM983B、WM164、1205lu（该细胞系形成的球体形态不规则且密度较低19）。
为了在三维球状模型中观察单个细胞的细胞周期，将C8161黑色素瘤细胞转导了FUCCI系统7,15。由于球状体体积较大（C8161细胞在琼脂糖上培养3天、再在胶原中生长24小时后直径可达1 mm），切片是观察球状体中心区域细胞的最佳选择。虽然完整球状体（活体或固定样本）可通过共聚焦显微镜成像，但共聚焦成像的穿透深度仅约150 μm，因此只有直径小于300 μm的球状体才能获得其中心光学切面。图2A、B和C展示了一.......
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讨论
半自动图像分析可识别类球体内部的G1期阻滞区域以及外层的增殖区域。该方法可用于活体类球体的光学切片，或固定后的类球体切片，以检测这些不同区域中细胞周期的变化，以及标志物表达（通过免疫荧光）、细胞死亡或细胞形态的变化。若结合活细胞共聚焦延时成像及细胞追踪图像分析步骤，还可对不同类球体区域内的细胞运动性进行定量分析。图像分析的关键在于获取高质量的z轴切片共聚焦图像，更高分辨率的图像有助于更准确地识别细胞。图像分析的一个局限性在于，当细胞核过于密集，或红色与绿色荧光强度差异过大时，无法准确识别所有细胞。该图像分析方法无法识别FUCCI阴性细胞（处于早期G1期），仅能识别红色（G1期）、黄色（早期S期）和绿色（S/G2/M期）信号。本文所述基于图像的分析方法另一缺点是未考虑类球体完整的三维结构。尽管Volocity软件可利用z轴堆栈图像进行三维测量，但由于类球体体积较大，共聚焦显微镜难以穿透并成像整个结构。多光子成像可用于获取完整类球体的z轴堆栈图像以实现三维测量7，该技术可穿透至500 μm深度，但某些类球体仍可能过大而无法通过此方法完成全貌成像。另一种对整个类球体进行成像的可选方案是光片显微镜技术，该技术可从多个角度可.......
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披露
PerkinElmer 承担了部分出版费用。
致谢
感谢Danae Sharp女士和Sheena Daignault女士提供的技术协助。感谢日本和光市理化学研究所（RIKEN）的Atsushi Miyawaki博士提供FUCCI载体，感谢美国费城威斯塔研究所（The Wistar Institute）的Meenhard Herlyn博士和Patricia Brafford女士提供细胞系，感谢百年研究所成像与流式细胞术平台提供的卓越技术支持。感谢Chris Johnson先生和Andrew Barlow博士在Volocity软件方面的技术支持。N.K.H. 是澳大利亚黑色素瘤与皮肤癌研究所的Cameron研究员。K.A.B. 是新南威尔士州癌症研究所的研究员（13/ECF/1-39）。W.W. 是新南威尔士州癌症研究所的研究员（11/CDF/3-39）。本研究获得以下项目资助：RG 09-08 和 RG 13-06（新南威尔士州癌症委员会）、570778 和 1051996（优先驱动型合作癌症研究计划/澳大利亚癌症中心/治愈癌症澳大利亚基金会）、08/RFG/1-27（新南威尔士州癌症研究所）以及APP1003637和APP1084893（国家健康与医学研究理事会）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| 低熔点琼脂糖 | Life Technologies | 16520-050 | 用于切片 |
| 高贵琼脂 | Sigma | A5431 | 用于制备球状体 |
| 用于球状体的琼脂糖 | Fisher Scientific | BP1356-100 | 用于制备球状体 |
| 0.05% 胰蛋白酶/EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| HBSS | Life Technologies | 14175-103 | |
| 10% 甲醛 | Sigma | HT5014-1CS | 警告：有害，具有腐蚀性。请使用个人防护装备，操作时务必谨慎 不要吸入蒸气（应在通风橱中打开）。 |
| 活/死 近红外 | Life Technologies | L10119 | |
| 振动切片机 | Technical Products International, Inc | ||
| 培养杯 | 赛默飞世尔科技 | SIE936 | 用于切片球状体的模具 |
| 血细胞计数板 | Sigma | Z359629 | |
| 96孔组织培养板 | 体外 | FAL353072 | |
| 胶原酶 | Sigma | C5138 | |
| 共聚焦显微镜 | Leica | TCS SP5 | |
| 流式细胞仪分析仪 | Becton Dickinson | LSRFortessa | |
| 速度 | PerkinElmer | 成像软件 | |
| FlowJo | Tree Star | 流式细胞术软件 | |
| 真空润滑脂 | Sigma | Z273554 | |
| 封片剂 | Vector Laboratories | H1000 | |
| FUCCI（商业构建体） | Life Technologies | P36238 | 瞬时转染 |
| 70 微米细胞滤网 μm | 体外 | FAL352350 | |
| 圆底5 ml无菌管 | 体外 | FAL352003 | |
| 圆底5 ml非无菌管 | 体外 | FAL352008 |
参考文献
- LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery. Expert opinion on drug discovery. 7, 819-830 (2012).
- Beaumont, K. A., Mohana-Kumaran, N., Haass, N. K. Modeling Melanoma In Vitro and In Vivo. Health....
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重印与许可
