单元位置的Imaging-和流式细胞仪为基础的分析和3D球体黑色素瘤细胞周期

Summary

我们描述了两种互补方法，使用荧光泛素化细胞周期指示剂 （FUCCI） 和图像分析或流式细胞术来识别和分离 3D 球体内部 G1 期停滞和外部增殖区域中的细胞。

Abstract

与传统的二维 （2D） 细胞培养相比，三维 （3D） 肿瘤球体在癌症研究中被用作更准确的体内肿瘤微环境模型。球状体模型能够模拟细胞间相互作用、缺氧和营养剥夺以及药物渗透的影响。该模型的一个特征是坏死核心的发展，周围环绕着一圈 G1 阻滞细胞，球体的外层有增殖细胞。癌症领域感兴趣的是球体的不同区域如何对药物治疗以及遗传或环境作做出反应。我们在这里描述了荧光泛素化细胞周期指示剂 （FUCCI） 系统的使用以及使用商业软件的细胞术和图像分析来表征细胞相对于它们在黑色素瘤球体内的位置的细胞周期状态。这些方法可用于跟踪肿瘤球体不同亚区的细胞周期状态、基因/蛋白表达或细胞活力随时间和不同条件下的变化。

Introduction

多细胞三维球状体已被被称为肿瘤模型数十年，但它只是在最近，他们已进入更常见的用法作为体外模型对许多实体癌症。它们越来越多地被用于高通量药物发现屏幕作为中间之间的复杂，昂贵和费时的体内模型和简单的，低成本的2D单层模型^1-6。研究在2D培养往往无法在体内被复制。许多类型的癌症的球体模型是能够模仿的生长特性，药物敏感性，药物渗透，细胞-细胞相互作用，氧和营养物和坏死的发展是见于体内实体肿瘤^6-11的有限的可及。球状体开发出坏死核心，包围芯静止或G 1被捕区域，并在球体⁷的周边增殖细胞。这些区域的发展可根据细胞密度，增殖率和球体¹²的尺寸而变化。据推测，见于这些不同子区的细胞异质性可能会导致癌症治疗电阻^13,14。因此，分析细胞在这些区域中的能力分别是至关重要的理解肿瘤药物反应。

荧光泛素细胞周期指示符（FUCCI）系统是基于红色（Kusabira橙色-正）和绿色（Azami格林- AG）CDT1和geminin的荧光标记，这是降解的细胞周期¹⁵的不同阶段。因此细胞核出现红色于G1，黄S中的早期和绿色中的S / G2 / M期。我们在这里描述两个互补方法均使用FUCCI来识别细胞周期，随着使用成像软件或染料扩散流式细胞仪测定的，以确定细胞是否驻留在G1被捕中心或外细胞增生克环，和个体细胞从旋转椭圆体的边缘的距离。这些方法被开发在我们以前的出版物，在这里我们表明，黑色素瘤细胞在低氧区域中的旋转椭圆体的中心和/或在靶向治疗的存在下能够保持在G1期阻滞延长的时间段，并且可以重新在更有利的条件出现⁷进入细胞周期。

Protocol

1. FUCCI转导和细胞培养

1. FUCCI转导
   1. 创建细胞系稳定表达FUCCI使用慢病毒共转导如前所述⁷构造mKO2-hCdt1（30-120）和^{MAG-hGem（1-100）15。}
      注:FUCCI系统现在市售的。
   2. 生成子的克隆与明亮的荧光由单细胞分选。排序单阳性细胞都AG和KO（黄色）通过荧光激活细胞分选入96孔板如前所述^7,16。
2. 黑色素细胞培植
   1. 培养C8161人黑素瘤细胞如前所述^7,17。

2.三维球体的形成（如前所述^3,9）

1. 琼脂糖板的准备
   1. 溶解1.5％琼脂糖（或稀有琼脂）在100毫升的Hank氏平衡盐溶液（HBSS）或磷酸盐buffereð盐水（PBS）通过在微波中3-5分钟旋流沸腾。确保琼脂糖完全溶解。
   2. 立即用多通道移液器分配每孔100μl的琼脂糖溶液至平底96孔组织培养板。
      注意:琼脂糖可以以提示固化后的短时间内，为了克服这个问题，必须提示板之间改变，如果使多个琼脂糖平板。
   3. 留在平坦表面上96孔板硬化琼脂糖至少1小时。
2. 电池的制备和覆盖到琼脂糖
   1. 生长细胞到约80％汇合的T75烧瓶。用10毫升HBSS清洗。
   2. 用1.5毫升的0.05％胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA），重悬在10ml正常培养基分离细胞。
   3. 计数使用血球^18或其他自动计数法的细胞。
   4. 重悬的细胞以在范数25,000个细胞/ ml的终浓度人网上平台。
   5. 覆盖琼脂糖孔用200μl细胞悬浮液为每孔5,000个细胞的终数目。
   6. 回位盘到细胞培养孵化器_（5％CO 2和37℃），以形成球状体在约3天。
      注意:采取以形成球体的时间不同的细胞系之间变化。某些细胞系不形成使用该方法在所有的球状体。
   7. 图像球体形态与使用4X物镜和相衬滤波器倒置显微镜。的细胞系，成功地形成球状体将产生紧凑，大致球状细胞聚集，并且应该有每口井只有一个球体。
      注意:可选:一旦球体形成，它们可以被移植到胶原或其他基质的生长及侵袭^3,7,17 ​​的进一步分析。从胶原除去球体，治疗用500μl的2毫克/毫升胶原酶在37℃下，直至胶原溶解足够的spher的OID来自由入培养基（约30分钟）。轻轻地取出用1毫升吸管球体。
   8. 用于切片/成像修复球状体（无论是分离的由胶原或生长3-5天在琼脂糖）在10％的中性缓冲的福尔马林（小心:福尔马林应在通风橱中使用）至少2小时，在室温（RT） ，或隔夜（O / N）在4℃。球状​​体可以被存储在HBSS在4℃下数天。

3.球体Vibratome切片

1. 溶解5克在100ml的HBSS低熔点琼脂糖在500毫升玻璃瓶中微波炉。使用带有旋转介质热定型。注意:保持盖子松动时沸腾的溶液中，使得该压力可以被释放。使用防护手套，防热处理热玻璃奶瓶时要保护手烫伤。
2. 等到琼脂糖稍微冷却 - 这样的瓶子可以不烧手触摸。
3. 倒approximately 2毫升琼脂糖成Coulter计数器杯或类似塑料模具的底部。立即吸固定球体（见2.2.8）中的液体可能的最小体积使用1ml吸管。加入球体的琼脂糖。几个球体（最多10个）可以每杯加入。
4. 覆盖球体用2毫升更多的琼脂糖。为此快，从而避免琼脂糖硬化的第二层中加入之前。
5. 允许琼脂糖在RT在暗处硬化，至少3小时。在这一点上的杯子可被存储的时间很短，在4℃用2-3毫升的HBSS覆盖，以防止脱水。
6. 从杯子琼脂糖删除。修剪含有球状体，以便它装配在vibratome金属块，和球状体接近琼脂糖顶部的琼脂糖。球状​​体可以被看作是在琼脂糖内小白物体。强力胶琼脂糖块。
7. 装满蒸馏水vibratome并安装在vibratome块。摆好vibratome削减100微米的部分使用低转速（设定2）和高振动（设置8）。设置切刃角至16°。转vibratome上，打开vibratome光并切断从琼脂糖的顶部部分直到100微米的球体部分被切断。将切球体部分为HBSS的24孔板。
8. 选择中间部分的图像分析。山路段上的幻灯片被转移部分平板上使用镊子滑动。填有10毫升注射器筒与真空油脂;为了防止在安装介质从流失滑动的边缘，并且帮助密封盖玻片下的部分添加的细线的周围部的边缘真空润滑脂。覆盖部分与封固剂和盖玻片。密封盖玻片指甲油的边缘。幻灯片保存在4℃前成像。

4.共聚焦图像采集

1. 走中间FUCCI球体部分的使用10X的Z切片图像或20X物镜如前所述^7。确保没有重叠或串扰Kusabira Orange2和Azami绿色之间发生。如果比较多个球体部分的图像分析，保持激光功率和其他设置的样品之间的相同。

5.赫斯特染料扩散分析的流量排序

1. 转移活球状体（琼脂糖播种后3-5天），以15毫升管。让球体重力沉降到管底部。几个球体可以每管被染色。需要大约20球状体来获得足够的细胞数量用于流式细胞术。
2. 删除多余的介质，并加入1毫升10μM赫斯特稀释在普通培养基上。孵育球体在37℃下约1小时。用温柔轻拂孵化过程中一次或两次，悬浮球体。
   注意:培养时间可以变化，以改变多远的Hoechst染料渗入球体。这将有所不同的基础上球体的尺寸，密度和细胞系。对于一些大型/致密的球体可以有最大的染料渗透小于100％。
3. 用5毫升的HBSS利用重力沉降轻轻冲洗球体。
   1. 可选:对于染料渗透成像:在室温或O / N固定球体用10％中性缓冲福尔马林至少2小时，在4℃。制备vibratome部分，如在步骤3和4如上所述安装在滑动和图像上的共焦。
4. 至在37℃下制备的细胞进行流式细胞术，trypsinize球状体用1ml 0.05％胰蛋白酶/ EDTA约30分钟，轻弹每10分钟，打破球体分开。
   注意:球状体是很难得到单细胞悬液，条件可能需要优化。这一过程后C8161 4日龄的球状体生存能力约95％。
5. 染色细胞根据制造商的协议的近红外活/死染色。用HBSS洗涤，然后用1修复毫升10％中性福尔马林缓冲液大约30分钟。细胞可被存储在HBSS在4℃下进行流分析前几天。

赫斯特彩绘FUCCI球体的6流式细胞仪分析

1. 确保单元，不以通过细胞过滤网来成群在一起。重悬的Hoechst以^1-5×10 6个细胞/ ml的浓度染色FUCCI球状体在冰冷的FACS洗涤（PBS中的5％胎牛血清）。转移200μl的样品，以5毫升圆底管中。
2. 准备以下单一颜色对照样品中6.1描述:未染色的黑色素细胞;贴壁黑色素细胞染色用10微米赫斯特1小时; Azami绿色只表达黑色素瘤细胞;和Kusabira橙色仅表达黑色素瘤细胞。
   注:单色控制可固定在福尔马林中并存储在FACS有0.1％的叠氮化钠洗在4℃数周甚至数月。
3. 运行单细胞悬液Ø呐流式细胞分析仪适当的激光和单色/未染色的控制如前所述^7,16。
4. 使用商业软件，流式细胞仪等的FlowJo如下分析内部与外部球体细胞:
   1. 通过门控的主要细胞群的前向散射光（FSC）与侧散射光（SSC）清除杂物。
   2. 通过门控使用FSC（区）与FSC（高）的单细胞移除双峰
   3. 门的活细胞通过门控上的活/死了较低的人口。
   4. 限定Hoechst的高细胞，根据来自用Hoechst贴壁细胞的阳性信号选通，为"外"的细胞。
   5. 定义Hoechst的低或阴性细胞，根据来自未染色的控制信号选通，为"内部"的细胞。
   6. 选通内外种群后，细胞可进一步选通为FUCCI红色（G1），黄色（S早期），绿（S / G2 / M）或负（早期G1）。
      注:C可能需要使用单一的色彩控制ompensation正确定义FUCCI红色，黄色，绿色和阴性群。
5. 一旦测定了优化和通过共焦显微镜Hoechst的渗透验证，而不固定在流动细胞分选，如前所述^7,16为活的细胞亚群的进一步分析运行的细胞。

FUCCI球体部分7.图像分析

1. 打开软件如 。 Volocity，选择定量唯一的配置。
2. 创建新库。从共聚焦拖动原始数据文件到库导入FUCCI球体共聚焦图像文件到软件中。或者，使用文件>导入命令。
3. 去测量标签来建立一个图像分析协议。该协议是通过拖放以正确的顺序相应的命令在协议如下窗口建设。
4. 查找OBJ学分的绿色通道:拖动找对象命令（在'查找'）复制到协议窗口中，选择正确的通道，在找对象protocol.Add一个开放的命令（在'加工'中），然后一个单独的触摸物体命令（在"加工"发现 - 这将分离细胞）。排除由粒径<50微米的对象（在"过滤"发现 - 这将排除小非细胞对象）。
   注意:变量如查找对象的阈值，开放迭代次数，对象的大小要分离和对象的大小，以排除必须手动优化，直到对象掩码匹配图像。
5. 发现在红色通道对象:重复如上的红色通道找对象。绿色和红色协议可能需要单独的调整。
   注:由于细胞核G2是，绿核往往稍大。
6. 确认发现是正确的对象:确认红色和绿色物体匹配红色和绿色的核的图像中通过关闭和绿色和红色通道（使用隐藏或显示信道命令），同时显示由所述协议发现红色和绿色口罩。反馈选项（尺寸>反馈选项）可以用来修改对象口罩的外观。
7. 查找黄色的物体（早期S期细胞）:要找到黄色的单元格，添加一个相交红配绿细胞命令（在"合并"中）。排除按大小的物体（<50微米，在"过滤"中）排除任何非小细胞对象。
8. 查找独家红色物体（G1期细胞）:要找到专门红核，减黄细胞的红细胞（在"合并"中）。按尺寸<50微米，（在'过滤'中）排除对象删除创建的任何非小细胞对象。
9. 查找专门绿色物体（S / G2 / M期细胞）:重复的绿色通道找到专门的绿色。
   没有德:如果仍有剩余的非细胞的目的，一个滤波器人口命令可以加入到异绿色或红色专属的协议（在"筛选"中）仅保留对象在具有形状因子大于0.25。这将删除非圆形物体。
10. 找到球体外形:查找使用查找球体轮廓对象命令中的绿色或红色通道（无论有更多的细胞周围的球体边缘）（在"查找"中）。甲低得多的阈值（在查找中找到的对象的变量）将需要被用来找到球体轮廓相比，个别细胞。
    1. 使用关闭命令加入对象（在'加工'中），然后填写对象孔（在'加工'中），然后用细过滤器（在"过滤"中）从对象去除噪声。最后，通过尺寸排除对象以除去较小的物体<30000微米（根据不同的旋转椭球体的大小）。
       注意:此协议将需要手动优化，直到球体轮廓是准确的。甲明图像，也可以使用 - 但是这通常是不太准确与球体部分，和一个反相命令（在'结合'找到）将需要被使用。
11. 测量核的距离以球体外形:测量距离从黄色，完全绿色和红色的独家人口从小区重心的球体outline.To可视化的最小距离的边缘（在"有关'中），这应该是从小区到最近的球体边缘，打开在反馈选项（尺寸>反馈选项>关系）的关系选项卡显示的距离。
12. 保存的协议。该协议可以被重新应用于使用测量其他图像>恢复协议命令。
13. 创建一个测量项目（测量>进行测量项目）。数据可以使用分析来分析功能。
    1. 转到在测量项目的分析选项卡。转到分析菜单（分析>分析），分析从细胞质心（红色，绿色或黄色）的球体边缘，总结数量和人口组织的最小距离。
    2. 计数在距边缘有一定距离中发现的细胞的数目创建一个过滤器（分析>过滤器）。的过滤器在图2中最小距离是根据Hoechst的渗透（例如最小距离小于80给出了"外"人口）。另外，原始数据导出到电子表格进行进一步的分析。

Results

有产生肿瘤球状体的几种方法，该协议使用非贴壁生长的方法，其中细胞在琼脂或琼脂糖^3,7,9中培养。 图1示出 C8161黑素瘤球体的后琼脂上3天的例子。 C8161球状体形成正常尺寸的球体的直径为500 - 600微米（平均值= 565，标准差= 19中，n = 3）后3天。其他黑素瘤细胞系，将形成球状体包括:WM793，WM983C，WM983B，WM164，1205LU（用该细胞系形成的球状体是不规则的，较不密集^19）。

为了可视化三维球体模型内的各个细胞的细胞周期，C8161黑素瘤细胞转导的FUCCI系统^7,15。由于球体的大尺寸（高达1毫米，直径在3天后在琼脂糖和24小时的生长在胶原为C8161），切片是在旋转椭圆体的中心可视化细胞的最佳选择。整个球状​​体（活的或固定的）可以通过共聚焦显微镜成像，但是共焦成像是仅能够穿透到大约150微米，因此球体的中间光学片只能在球状体的直径小于300微米的小而获得。 图2A，B和C

Discussion

半自动化图像分析，鉴定球体内G1被捕区域，和增殖外层。这种方法可以在活球状体用光学部分被使用，或在固定的球体部分，以识别变化不仅在细胞周期但标记表达（通过免疫荧光），细胞死亡，或细胞形态在这些不同的区域。不同球状体区域内的细胞运动性，也可以定量 - 如果连同一个细胞跟踪图像分析​​步骤的现场共焦时间推移成像溶液。关键的图像分析是，高品质的Z-切片的共聚焦图像获得更高分辨率的图像可以更好地识别细胞。一个限制与图像分析是，它是不可能正确找到每个细胞如果核是过于密集，或者如果在红色和绿色强度太大变化。 FUCCI阴性细胞（早期G1）不能够将与此图像分析方法，只有红（G1）发现，黄色（早S期）和绿色（S / G2 / M）。此处所描述的基于图像的分析方法的一个其它的缺点是，它不考虑球体的完整三维性质。虽然Volocity软件可以执行使用Z堆叠图像三维测量，共聚焦显微镜无法渗透和图像通过整个球体由于大尺寸。多光子成像可以使用，以获得Z堆叠整个球体的对三维测量⁷作为这种技术允许高达500微米的渗透，尽管有些球体可能仍然过大，无法通过此方法的图像整个球体。用于成像的整个球体的另一个选择是光片基显微镜，它允许从多个角度旋转椭圆体的...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570
琼脂糖 低熔点	Life Technologies	16520-050	用于切片
贵族琼脂	Sigma	A5431	用于制造球状体 用于球
琼脂糖	Fisher Scientific	BP1356-100	用于制造球状体
0.05% 胰蛋白酶/EDTA	Life Technologies	25300-054
HBSS	Life Technologies	14175-103
10% 福尔马林	Sigma	HT5014-1CS	注意： 有害，有腐蚀性。使用个人防护设备，做到  不呼吸烟雾（在通风柜中打开）。
IR 附近活/死	Life Technologies	L10119
振动切片机	Technical Products International， Inc
粘胶杯	Thermo-Fisher Scientific	SIE936	用于切片球体的模具
血球计数器	Sigma	Z359629
96 孔组织培养板	体外	FAL353072
胶原酶	Sigma	C5138
共聚焦显微镜	Leica	TCS SP5
流式细胞仪分析仪	Becton Dickinson	LSR细胞
计数度	PerkinElmer		成像软件
flowjo	Tree Star		流式细胞术软件
真空润滑脂	Sigma	Z273554
封固剂	载体实验室	H1000
FUCCI（商业构建体）	Life Technologies	P36238	仅瞬时转染
细胞过滤器 70 μm	体外	FAL352350
圆底 5 ml 试管（无菌）	体外	FAL352003
圆底 5 ml 试管（非无菌）	体外	FAL352008