Method Article

单元位置的Imaging-和流式细胞仪为基础的分析和3D球体黑色素瘤细胞周期

DOI:

10.3791/53486

⸱

December 28th, 2015

 ,  ,  ,  , 
1The Centenary Institute, 2Sydney Medical School, University of Sydney, 3The University of Queensland Diamantina Institute, Translational Research Institute, The University of Queensland, 4Department of Dermatology, Royal Prince Alfred Hospital, 5Discipline of Dermatology, University of Sydney

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们描述了两种互补方法，使用荧光泛素化细胞周期指示剂 （FUCCI） 和图像分析或流式细胞术来识别和分离 3D 球体内部 G1 期停滞和外部增殖区域中的细胞。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

与传统的二维 （2D） 细胞培养相比，三维 （3D） 肿瘤球体在癌症研究中被用作更准确的体内肿瘤微环境模型。球状体模型能够模拟细胞间相互作用、缺氧和营养剥夺以及药物渗透的影响。该模型的一个特征是坏死核心的发展，周围环绕着一圈 G1 阻滞细胞，球体的外层有增殖细胞。癌症领域感兴趣的是球体的不同区域如何对药物治疗以及遗传或环境作做出反应。我们在这里描述了荧光泛素化细胞周期指示剂 （FUCCI） 系统的使用以及使用商业软件的细胞术和图像分析来表征细胞相对于它们在黑色素瘤球体内的位置的细胞周期状态。这些方法可用于跟踪肿瘤球体不同亚区的细胞周期状态、基因/蛋白表达或细胞活力随时间和不同条件下的变化。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

多细胞三维球状体已被被称为肿瘤模型数十年，但它只是在最近，他们已进入更常见的用法作为体外模型对许多实体癌症。它们越来越多地被用于高通量药物发现屏幕作为中间之间的复杂，昂贵和费时的体内模型和简单的，低成本的2D单层模型1-6。研究在2D培养往往无法在体内被复制。许多类型的癌症的球体模型是能够模仿的生长特性，药物敏感性，药物渗透，细胞-细胞相互作用，氧和营养物和坏死的发展是见于体内实体肿瘤6-11的有限的可及。球状体开发出坏死核心，包围芯静止或G 1被捕区域，并在球体7的周边增殖细胞。这些区域的发展可根据细胞密度，增殖率和球体12的尺寸而变化。据推测，见于这些不同子区的细胞异质性可能会导致癌症治疗电阻13,14。因此，分析细胞在这些区域中的能力分别是至关重要的理解肿瘤药物反应。

荧光泛素细胞周期指示符（FUCCI）系统是基于红色（Kusabira橙色-正）和绿色（Azami格林- AG）CDT1和geminin的荧光标记，这是降解的细胞周期15的不同阶段。因此细胞核出现红色于G1，黄S中的早期和绿色中的S / G2 / M期。我们在这里描述两个互补方法均使用FUCCI来识别细胞周期，随着使用成像软件或染料扩散流式细胞仪测定的，以确定细胞是否驻留在G1被捕中心或外细胞增生克环，和个....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. FUCCI转导和细胞培养

  1. FUCCI转导
    1. 创建细胞系稳定表达FUCCI使用慢病毒共转导如前所述7构造mKO2-hCdt1（30-120）和MAG-hGem（1-100）15。
      注:FUCCI系统现在市售的。
    2. 生成子的克隆与明亮的荧光由单细胞分选。排序单阳性细胞都AG和KO（黄色）通过荧光激活细胞分选入96孔板如前所述7,16。
  2. 黑色素细胞培植
    1. 培养C8161人黑素瘤细胞如前所述7,17。

2.三维球体的形成（如前所述3,9）

  1. 琼脂糖板的准备
    1. 溶解1.5％琼脂糖（或稀有琼脂）在100毫升的Hank氏平衡盐溶液（HBSS）或磷酸盐buffereð盐水（PBS）通过在微波中3-5分钟旋流沸腾。确保琼脂糖完全溶解。
    2. 立即用多通道移液器分配每孔100μl的琼脂糖溶液至平底96孔组织培养板。
      注意:琼脂糖可以以提示固化后的短时间内，为了克服这个问题，必须提示板之间改变，如果使多个琼脂糖平板。
    3. 留在平坦表面上96孔板硬化琼脂糖至少1小时。
  2. 电池的制备和覆盖到琼脂糖
    1. 生长细胞到约80％汇合的T75....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

有产生肿瘤球状体的几种方法，该协议使用非贴壁生长的方法，其中细胞在琼脂或琼脂糖3,7,9中培养。 图1示出 C8161黑素瘤球体的后琼脂上3天的例子。 C8161球状体形成正常尺寸的球体的直径为500 - 600微米（平均值= 565，标准差= 19中，n = 3）后3天。其他黑素瘤细胞系，将形成球状体包括:WM793，WM983C，WM983B，WM164，1205LU（用该细胞系形成的球状体是不规则的，较不密集19）。

为了可视化三维球体模型内的各个细胞的细胞周期，C8161黑素瘤细胞转导的FUCCI系统7,15。由于球体的大尺寸（高达1毫米，直径在3天后在琼脂糖和24小时的生长在胶原为C8161），切片是在旋转椭圆体的中心可视化细胞的最佳选择。整个球状​​体（活的或固定的）可以通过共聚焦显微镜成像，但是共焦成像是仅能够穿透到大约150微米，因此球体的中间光学片只能在球状体的直径小于300微米的小而获得。 图2A，B和C

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

半自动化图像分析，鉴定球体内G1被捕区域，和增殖外层。这种方法可以在活球状体用光学部分被使用，或在固定的球体部分，以识别变化不仅在细胞周期但标记表达（通过免疫荧光），细胞死亡，或细胞形态在这些不同的区域。不同球状体区域内的细胞运动性，也可以定量 - 如果连同一个细胞跟踪图像分析​​步骤的现场共焦时间推移成像溶液。关键的图像分析是，高品质的Z-切片的共聚焦图像获得更高分辨率的图像可以更好地识别细胞。一个限制与图像分析是，它是不可能正确找到每个细胞如果核是过于密集，或者如果在红色和绿色强度太大变化。 FUCCI阴性细胞（早期G1）不能够将与此图像分析方法，只有红（G1）发现，黄色（早S期）和绿色（S / G2 / M）。此处所描述的基于图像的分析方法的一个其它的缺点是，它不考虑球体的完整三维性质。虽然Volocity软件可以执行使用Z堆叠图像三维测量，共聚焦显微镜无法渗透和图像通过整个球体由于大尺寸。多光子成像可以使用，以获得Z堆叠整个球体的对三维测量7作为这种技术允许高达500微米的渗透，尽管有些球体可能仍然过大，无法通过此方法的图像整个球体。用于成像的整个球体的另一个选择是光片基显微镜，它允许从多个角度旋转椭圆体的.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

珀金埃尔默贡献了出版费用。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢 Danae Sharp 女士和 Sheena Daignault 女士提供的技术帮助。我们感谢日本和光市 RIKEN 的 Atsushi Miyawaki 博士提供 FUCCI 构建体，感谢费城 Wistar 研究所的 Meenhard Herlyn 博士和 Patricia Brafford 女士提供细胞系，感谢百年研究所的成像和流式细胞术设施提供出色的技术支持。我们感谢 Chris Johnson 先生和 Andrew Barlow 博士为 Volocity 软件提供的技术支持。NKH 是澳大利亚黑色素瘤和皮肤癌研究所的 Cameron 研究员。KAB 是新南威尔士州癌症研究所的研究员 （13/ECF/1-39）。W.W. 是新南威尔士州癌症研究所的研究员 （11/CDF/3-39）。这项工作得到了项目赠款 RG 09-08 和 RG 13-06（新南威尔士州癌症委员会）、570778 和 1051996（优先驱动的合作癌症研究计划/澳大利亚癌症/治愈澳大利亚癌症基金会）、08/RFG/1-27（新南威尔士州癌症研究所）和 APP1003637 和 APP1084893（国家健康与医学研究委员会）。

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Hoechst 33342Life TechnologiesH3570
琼脂糖 低熔点Life Technologies16520-050用于切片
贵族琼脂 SigmaA5431用于制造球状体 用于球
琼脂糖Fisher ScientificBP1356-100用于制造球状体
0.05% 胰蛋白酶/EDTALife Technologies25300-054
HBSSLife Technologies14175-103
10% 福尔马林SigmaHT5014-1CS注意： 有害，有腐蚀性。使用个人防护设备，做到  不呼吸烟雾（在通风柜中打开）。
IR 附近活/死Life TechnologiesL10119
振动切片机Technical Products International， Inc
粘胶杯Thermo-Fisher ScientificSIE936用于切片球体的模具
血球计数器SigmaZ359629
96 孔组织培养板体外FAL353072
胶原酶SigmaC5138 
共聚焦显微镜LeicaTCS SP5
流式细胞仪分析仪Becton DickinsonLSR细胞
计数度PerkinElmer成像软件
flowjoTree Star流式细胞术软件
真空润滑脂SigmaZ273554
封固剂载体实验室H1000
FUCCI（商业构建体）Life TechnologiesP36238仅瞬时转染
细胞过滤器 70 μm体外FAL352350
圆底 5 ml 试管（无菌）体外FAL352003
圆底 5 ml 试管（非无菌）体外FAL352008
状体的

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery. Expert opinion on drug discovery. 7, 819-830 (2012).
  2. Beaumont, K. A., Mohana-Kumaran, N., Haass, N. K. Modeling Melanoma In Vitro and In Vivo. Health....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

3D Melanoma SpheroidsCell Cycle AnalysisFlow CytometryFUCCI SystemConfocal ImagingImage AnalysisCell Position TrackingSpheroid SectioningNecrotic CoreProliferating Cells

Related Articles