利用共轭聚合物光学调控活细胞的电活动

摘要

一种刺激方法 体外 基于有机半导体聚合物的可见光调控细胞培养电活动的方法被描述。

摘要

有机半导体与活体组织之间的杂化界面代表了一种新型工具 体外 和 体内 应用。特别是，共轭聚合物作为生物系统的基底材料展现出多种理想特性，如良好的生物相容性、优异的机械性能、低廉且易于加工的工艺，以及可在轻质、薄型和柔性基底上沉积的可能性。这些材料已被用于细胞界面，例如神经探针、用于神经活动刺激与记录的晶体管、生物传感器以及药物释放的执行器。最近的实验还证明了利用共轭聚合物实现细胞电活动全光学调控的可能性。多种 体外 已报道的研究案例包括原代神经元网络、星形胶质细胞及次生细胞系。此外，由有机聚合物介导的信号光转导已被证实可恢复退化视网膜的光敏感性，提示此类器件未来可能用于人工视网膜假体。总之，光敏共轭聚合物代表了一种调控细胞活动的新型光学调控方法。

在本研究中，描述了构建用于活细胞光学刺激的生物聚合物界面所需的全部步骤。该活性界面的功能是将光刺激转化为细胞膜电位的调制。作为研究案例，该方法适用于 体外 研究中采用聚噻吩薄膜作为功能性光吸收层，并使用人胚胎肾（HEK-293）细胞作为界面的生物组分。文中提供了通过不同持续时间的光脉冲刺激成功调控细胞膜电位的实际示例。特别地，结果表明，根据光刺激持续时间的不同，可实现细胞膜的去极化或超极化效应。所报道的实验方案具有普遍适用性，可直接推广至其他生物样本。

引言

以精确的空间和时间分辨率调控细胞活性的可能性，是神经科学研究以及神经系统和精神疾病治疗中的关键策略。¹ 传统方法基于使用电极对细胞进行电刺激，电极被放置在目标系统附近或与其直接接触，² 目标系统可具有不同复杂程度（单个细胞、细胞网络、脑切片、in-vivo 脑组织）。在过去的一个世纪中，膜片钳、金属电极和基底集成电极的应用，已为单个神经元的生理与病理生理特性以及神经网络功能机制提供了详尽的认识。然而，电刺激存在重要局限性。其一是由于电极的物理尺寸及其固定几何形状，通常导致空间分辨率较差，难以适应生物组织等结构复杂的系统。此外，电极阻抗以及刺激与记录系统之间的串扰问题，可能降低最终测量结果的信噪比。³ 相比之下，利用光进行刺激有望克服电刺激方法的诸多局限。首先，光刺激可提供前所未有的空间分辨率（< 1 µm）和时间分辨率（< 1 msec），从而能够靶向特定类型的细胞甚至亚细胞区室。此外，该方法具有高度非侵入性，无需与目标组织发生物理接触，并可将刺激与记录过程分离。同时，光强和波长均可被精确调控，因此可实施多种不同的刺激方案。^3,4

然而，绝大多数动物细胞并不表现出对光的特异性敏感性。因此，人们提出了多种光学刺激策略，这些策略要么利用细胞附近或内部的光敏分子媒介，要么使用放置在细胞外部附近的光活性装置。前一类策略涉及内源性机制，例如通过可见光或红外光（IR）进行刺激，以及使用光异构化/光裂解化合物或表达光敏分子效应器的基因技术（即光遗传学）。后一类则包括利用无机纳米/微米颗粒或光电导硅基底实现外源性刺激的技术。⁵ 然而，所有这些系统都各有优势与局限性。特别是，细胞在可见光范围内的内源性吸收较弱且不可靠，同时可能产生活性氧物种，对细胞造成损害。通常，红外光因水分子的吸收而被用于诱导局部热加热，但水的消光系数较小，因此需要较强的红外光（从数十到数百 W/mm²），这难以通过标准显微镜光学系统有效传递，并可能在体内应用中引发安全问题。另一方面，光可切换的笼锁化合物作用时间有限，且通常需要紫外光激发，而紫外光由于组织穿透能力有限，难以有效递送。此外，在光照区域之外，光解后激活的化合物还存在扩散问题。最后，光遗传学工具使科学家能够靶向特定的细胞亚群和亚细胞区室，正迅速成为神经科学研究中的关键技术之一。然而，通过病毒载体插入外源DNA片段会引发重要的安全性问题，尤其是在考虑将其应用于人类患者时尤为突出。^5,6 正因如此，开发新型材料和装置以实现细胞光学操控的研究成为一个极为热门的领域。

最近，一种基于光敏共轭聚合物的新方法被提出，该方法能够高效地将光刺激转化为对细胞电活动的调控。这种聚合物光激发细胞刺激（Cell Stimulation by Polymer Photoexcitation, CSPP）技术利用了有机半导体所特有的多种关键优势：它们在可见光范围内具有本征光敏感性；⁷ 它们具有生物相容性，质地柔软且可贴合，其机械柔韧性可与组织形成紧密的界面 体外 和 体内^8-10此外，它们可被 facile 地功能化，以更好地适应与活细胞的界面，并实现特异性激发、探测和传感功能。^11,12 此外，它们支持电子和离子传导，使其成为电子学与生物学结合的理想材料。^13,14 有趣的是，它们可以在光伏模式下工作，从而无需施加外部偏压即可实现高效的细胞光刺激。¹⁵

CSPP 技术的可靠性已在包括原代神经元在内的多个系统中得到证实，^15,16 星形胶质细胞,¹⁷ 继代细胞系¹⁸ 以及移植后取出的视网膜组织。¹⁶ 在此工作中，制造光敏生物聚合物界面所需的全部步骤¹⁹ 用于光刺激 体外 详细描述了这些系统。以一个原型有机光伏共混体系为例，其中使用区域规整的聚(3-己基噻吩)（rr-P3HT）作为电子给体，苯基-C61-丁酸甲酯（PCBM）作为电子受体。生物系统则采用人胚胎肾（HEK-293）细胞。提供了一个光刺激实验方案示例，并通过电生理测量记录细胞活动。

然而，所描述的平台具有普遍适用性，可轻松扩展应用于其他共轭聚合物（通过适当调整溶液制备过程和沉积参数）、不同类型的细胞（通过适当改变细胞培养方案、铺板程序以及细胞接种和增殖所需时间）和不同的刺激方案（光波长、刺激频率和持续时间、光激发密度）。

方案

1. 光敏基底的制备

1. 在氯苯中配制P3HT:PCBM溶液（1:1 w/w），使P3HT浓度为20 g/L。在60 °C下使用磁力搅拌器搅拌至少4小时。每块待制备的基底考虑使用150 µl溶液。
2. 使用超声波清洗仪依次用去离子水、丙酮和异丙醇清洗ITO镀膜玻璃片（R_s = 10 Ω/sq，18x18 mm²，厚度170 µm）（每步10分钟）。用氮气枪吹干盖玻片。将样品置于等离子清洗仪中，在100 W功率下处理10分钟。
3. 通过旋涂法在清洁的基底上沉积一层活性层薄膜。
   1. 使用金刚石笔将显微镜玻璃片（厚度≈1 mm）切割成与ITO镀膜基底相同的横向尺寸。将P3HT:PCBM溶液从加热板上取下，并冷却至室温。
   2. 设置两步旋涂程序：i）800 rpm转速下旋涂30秒；ii）1600 rpm转速下旋涂30秒。将玻璃片放置在旋涂仪卡盘上，并启动真空固定。在玻璃片上滴加一滴丙酮，然后将已清洗的基底（ITO面朝上）放置其上。启动旋涂仪旋转，以去除多余的丙酮。
   3. 在基底上滴加150 µl的P3HT:PCBM溶液，再次启动旋涂仪（采用与1.3.2中所述相同的程序）。
   4. 旋涂完成后，取出样品，小心地将镀膜基底从玻璃片上剥离。用浸有丙酮的洁净室棉签清洁基底背面。
      注意：光敏基底可在避光盒中存放数天，以备后续使用。若需更长时间保存，应将其置于充满惰性气体的手套箱中。

2. 细胞培养基与电生理溶液的制备

1. 为HEK-293细胞配制完全生长培养基（CGM）：Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM），添加10%未灭活的胎牛血清（FBS）、100 U/ml青霉素和100 µg/ml链霉素。使用0.2 µm过滤系统对培养基进行灭菌，并在4 °C下保存。
2. 使用超纯水配制细胞外溶液（浓度单位为mM）：135 NaCl、5.4 KCl、5 HEPES、10葡萄糖、1.8 CaCl₂、1 MgCl₂。用NaOH调节pH至7.4。使用0.2 µm过滤系统对溶液进行灭菌，并在4 °C下保存。
3. 使用超纯水配制细胞内溶液（浓度单位为mM）：12 KCl、125 K-葡萄糖酸盐、1 MgCl₂、0.1 CaCl₂、10 EGTA、10 HEPES、10 ATP-Na₂。注意ATP-Na₂对热敏感，应最后加入。用NaOH调节pH至7.4。使用0.2 µm过滤系统对溶液进行灭菌，分装至1 ml离心管中，并在-20 °C下保存。

3. 在活性基质上接种 HEK-293 细胞

1. 将光敏基底放入玻璃烧杯中，用铝箔覆盖或置于密闭的培养皿内，然后在120 °C的烘箱中加热2小时以进行灭菌。自此之后，所有操作均需在无菌条件下进行。将样品放入无菌操作台中，使其冷却。
2. 在光敏基底上涂覆一层黏附层，以降低表面疏水性并促进细胞黏附。
   1. 将活性基底放入P35培养皿或6孔板中。由于共轭聚合物层具有疏水性，需制作聚二甲基硅氧烷（PDMS）围堰以固定样品并限制溶液扩散。
      1. 用玻璃棒按10:1的比例混合PDMS与催化剂，得到黏稠的浆液。
      2. 将浆液倒入6孔板中，每孔加入足够覆盖孔底一半面积的量。
      3. 在室温下静置，等待PDMS完成聚合。
      4. 将固化的PDMS从中间切割，获得与聚合物样品尺寸相同的方形结构。
      5. 通过将PDMS围堰浸入70%乙醇-水混合液中至少30分钟进行灭菌。
   2. 若使用PDMS围堰，需用尖头镊子沿围堰边缘轻轻刮擦光敏层一周，以防止在细胞培养后移除PDMS围堰时整个功能层脱落。
   3. 用纤连蛋白溶液（2 mg/L，溶于PBS）覆盖每个样品的整个表面。若使用PDMS围堰，每个样品通常加入500–750 µl即可（围堰暴露面积：15×15 mm²）；若不使用PDMS围堰，则需约2 ml纤连蛋白溶液以完全浸没样品；加液时注意避免基底漂浮。将样品在37 °C下孵育至少1小时。
   4. 用玻璃移液管吸除纤连蛋白溶液，并用2 ml PBS洗涤一次。
3. 在经纤连蛋白处理的样品上接种HEK-293细胞，接种密度为15,000个细胞/cm²，使用完全生长培养基（CGM）。若使用PDMS围堰，每个样品加入750–1,000 µl CGM；否则需加入2–3 ml CGM。将细胞在37 °C、5% CO₂条件下孵育24–48小时。

4. 光刺激方案与电生理学测量

1. 将细胞外溶液置于37 °C水浴中预热；解冻细胞内溶液，将其吸入一支1 ml注射器中，并装上34号针头，然后将注射器置于冰上以防止ATP降解。
2. 从培养箱中取出带有细胞的基底材料，如有PDMS小室，需小心移除。用玻璃移液管吸除培养基，并用细胞外溶液冲洗样品。操作应缓慢进行，以避免细胞脱落。
3. 将装置放入电生理记录系统的样品槽中，加入细胞外溶液并放置参比电极。使用拉制仪制备新鲜的玻璃微电极用于膜片钳实验（理想电阻范围为2–4 MΩ）。将微电极约一半体积填充细胞内溶液，并将其安装至显微操作器上。
4. 在装置上寻找一个状态良好的细胞进行封接。为避免意外激发光敏性基底材料，成像时应使用红外照明，并在显微镜光源前放置长波通滤光片（例如，对于在可见光区吸收的聚合物，可选用截止波长λ = 750 nm的滤光片）。
5. 对选定细胞进行膜片钳记录，并通过显微镜的荧光激发光路向样品施加所需的光学刺激（图1）。详细的膜片钳操作流程可参见文献20。
   1. 使用微米级操作器将膜片钳电极移至靠近细胞膜的位置。在定位过程中，对电极施加正压，以防止杂质附着于尖端。电极应位于细胞上方几微米处。
   2. 开始缓慢将电极向细胞膜下移，同时在膜片钳控制软件中监测电极电阻。当电极电阻升高约1 MΩ时，撤去正压并施加轻微负压，以在电极与细胞膜之间形成吉欧封接（即，测得的电阻应升高至大于1 GΩ）。
   3. 对电极施加接近预期细胞静息电位的负电位（对于HEK293细胞，可使用-40 mV的电位），以帮助稳定封接。使用膜片钳放大器或膜片钳控制软件中的相应指令补偿由电极电容引起的容性瞬变。
   4. 通过向电极施加短暂而强烈的负压脉冲击破细胞膜，从而实现对细胞胞浆的电学通路。将膜片钳放大器设置为电流钳模式（I = 0，即不向细胞注入电流），以记录细胞膜电位。等待数分钟，观察细胞电位是否稳定。
   5. 对细胞施加所需的光照刺激方案，并记录其对膜电位的影响。
      注意：根据显微镜结构，光照可从样品底部或顶部导入。
      1. 选择一个能被活性材料有效吸收的激发波长；对于P3HT:PCBM混合物，可使用450–600 nm范围内的波长。适宜的光激发密度范围为10–100 mW/mm²。
         注意：短光脉冲（低于10–20毫秒）会引起细胞短暂去极化，而长时间光照（数百毫秒或更长脉冲）则会导致持续性超极化，直至光照关闭。

结果

只要沉积适当的黏附层（如本方案步骤3.2中使用的纤连蛋白），细胞即可在P3HT:PCBM基底上轻松培养。P3HT:PCBM在可见光谱的绿色区域具有光学吸收峰；然而，也可根据所需的光刺激波长范围选择其他光敏共轭聚合物（图2）。这些基底的生物相容性不仅已在HEK-293等细胞系^18,21中得到证实，也在原代培养的神经元¹⁵和星形胶质细胞¹⁷中得到验证。在P3HT:PCBM薄膜上培养的健康HEK-293细胞的典型显微图像如图3所示。通过光敏基底介导的细胞光学刺激可对细胞膜产生多种不同效应，具体取决于光刺激的持续时间¹⁸。在光脉冲开始时，可在细胞膜电位记录中观察到一个快速的电位尖峰（强度约为3 mV，持续时间约为1毫秒）（图4）。该信号源于活性材料中电荷生成时聚合物/电解质界面的电容性充电。

讨论

所报道方案的关键步骤 体外 细胞的光刺激主要涉及光敏聚合物的选择、热灭菌参数、光刺激强度及持续时间。本文选用了P3HT:PCBM薄膜，因其具有良好的时间稳定性和电化学稳定性。但需注意，并非所有光敏聚合物均能提供类似性能。²² 更具体地说是在光照条件下。此外，在本案例中，所选的热灭菌参数不会对聚合物的光电特性造成显著降解；但需注意，若改变灭菌方法或热处理参数，则应对可能对聚合物性能造成的影响进行仔细评估。已知例如，紫外线照射会因共轭结构的丧失而导致聚合物迅速发生不可逆的漂白和降解。此外，不同的退火温度和持续时间可能导致聚合物表面形貌有序性的差异，从而对电荷传输性能产生不利影响。光激发方案的参数也应仔细评估：激发密度超过100 mW/cm²时²，和/或长时间刺激，均可能轻易导致聚合物降解并使光刺激方案失败。本方案中的另一个关键步骤是使用蛋白黏附层，这是因为P3HT:PCBM表面具有高度疏水性。若在构建生物-聚合物界面时未使用黏附层，则细胞接种与增殖可能会受到严重影响。

然而，在上述关键步骤和限制条件下，可根据具体的实验需求和...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
rr-P3HT	Sigma Aldrich	698989-5G
ITO 涂层基底	Nano-CS	IT10300100
纤连蛋白	Sigma Aldrich	F1141
氯苯	Sigma Aldrich	319996
PCBM	Nano-C	Nano-CPCBM-BF
丙酮	Sigma Aldrich	270725
异丙醇	Sigma Aldrich	563935
HEK 细胞	LGC standards srl	ATCC-CRL-1573
HEPES	Sigma Aldrich	H0887
PBS	Sigma Aldrich	P5244
E-MEM	LGC standards srl	ATCC-30-2003
EDTA	Sigma Aldrich	E8008-
FBS	LGC standards srl	ATCC-30-2020