注意性设转移认知异常是多种精神疾病的核心特征。本文介绍了一种新型自动化系统，可用于高效研究小鼠的注意性设转移能力、执行功能及其他认知能力，该系统与人类研究具有高度的可转化性。
本文内容
摘要
摘要
执行控制和认知灵活性（如注意力定势转移能力）的改变是多种神经精神疾病的核心特征。目前用于评估人类受试者注意力定势转移能力的最广泛应用的神经心理学测试包括威斯康星卡片分类测验（Wisconsin Card Sorting Test, WCST）和CANTAB系统内的维度内/维度外转换任务（ID/ED）。这些任务已被证实具有重要的临床相关性，并已被修改并成功应用于动物模型的研究中。然而，目前可用于啮齿类动物的任务存在若干局限性，主要源于其基于人工操作的测试流程，这在很大程度上阻碍了精神病学领域的转化研究进展。为了克服这些局限性，并更准确地模拟灵长类动物中的原始版本任务，我们开发了一种新型基于操作式行为的双室维度内/维度外转换“Operon”任务，适用于啮齿类动物。我们验证了该新任务在测量小鼠多种认知灵活性维度方面的有效性，包括注意力定势的形成与转移，以及反转学习能力。此外，我们展示了该任务的高度灵活性，可在三个不同的感知维度上进行操控，且每个维度均可使用大量刺激线索。这种新型的ID/ED Operon任务可成为研究精神疾病中执行功能障碍及相关认知症状的有力临床前工具，适用于药物筛选和/或大规模遗传学筛查。
引言
注意集转移是衡量认知灵活性和执行功能的指标1。它指的是在任意的内部规则（"认知-注意集"）之间进行切换的能力。目前在人类中用于测量注意集转移和认知灵活性应用最广泛的神经心理学任务是威斯康星卡片分类测验（Wisconsin Card Sorting Test, WCST）2，以及一种更新且更精细的版本：剑桥神经心理测验自动化成套系统（Cambridge Neuropsychological Test Automated Battery, CANTAB）中的维度内与维度外注意集转移任务（intra- and extra-dimensional attentional set-shifting, ID/ED）3,4。这些任务已被用于识别多种精神障碍中的特定认知异常，包括自闭症5、精神分裂症6、帕金森病7、强迫症8以及注意缺陷/多动障碍9。由于WCST和ID/ED测验具有明确的临床相关性和严谨的方法学基础，研究者对在临床前研究中开发类似任务产生了浓厚兴趣10,11。这些任务能够在同一个受试个体中选择性地测量多种不同的认知能力，例如辨别学习、反转学习、注意集的形成、在同一维度内的注意力转移（i.e., 维度内转移：IDS）以及在不同感知维度之间的注意力转移（i.e., 维度外转移：EDS）。这一点至关重要，因为不同的脑回路以及神经病理过程可能以不同方式影响这些独立的认知功能。例如，在注意集转移任务中，前额叶皮层（PFC）的外侧区域（在猴子和人类中）/内侧区域（在啮齿类动物中）与眶部区域之间已观察到双重分离或功能特化效应。其中，眶额皮层更多地参与任务的反转阶段，而外侧/内侧PFC区域则主导维度外转移阶段12-14。
这些用于灵长类动物的注意力设定转移测试的啮齿类动物版本已成功建立13-16。然而，这些啮齿类动物版本的某些方面限制了其应用和使用。例如，这些任务需手动操作，因此劳动强度高且难以标准化。此外，刺激物内部存在食物强化物可能导致对动物反应的解释模糊，并在选择行为中引入潜在偏差10。这些特点限制了测试的通量，更重要的是，限制了其在大规模遗传学和/或药物筛选研究中的应用。
为了克服这些局限性，并增强ID/ED转换范式在啮齿类动物中的潜在应用，本文介绍了一种基于操作性条件反射的新型双室任务，用于检测小鼠的认知灵活性。该新型任务 closely mimics 人类和非人灵长类动物中使用的ID/ED任务，并克服了早期啮齿类动物版本存在的问题。
方案
所有实验程序均经意大利卫生部和当地动物使用委员会批准，并遵循欧洲共同体理事会《实验动物护理和使用指南》的规定进行。
注意：图6展示了用于测试ID/ED任务的整个实验方案的时间线。
1. 仪器设备
图1. 双室“Operon”装置。（A）整个装置的俯视图；（B）单个实验舱的前视图，模拟小鼠在测试过程中的视角。1：视觉刺激（LED）；2：食盒；3：鼻触孔；4：触觉刺激（纹理）；5：嗅觉刺激；6：自动滑动门；7：室内照明灯；8：用于门控的红外光束。两个实验舱（16 × 16 × 16 cm3）由一块透明塑料门（6）隔开。红外光束（8）用于追踪动物的运动，并控制自动门的开启与关闭，以允许小鼠在两个舱室之间移动。每个舱室设有两个带红外光束的鼻触孔（3），两孔之间为一个带光束检测的食盒（2），食物颗粒分配器由此提供食物强化。每个食盒上方均设有一个室内照明灯（7）。每个鼻触孔均配备一系列可更换的刺激装置，可在三种不同的感知维度（气味、视觉、触觉）上进行变化。原始发表于《适用于小鼠的终极舱内与舱外注意转移任务》19。 请点击此处查看该图的放大版本。
注意：Operon 装置（图1）由两个相同的腔室组成，腔室壁为聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglas）材质，底部为铝制（每个腔室尺寸为 16 x 16 x 16 cm3）。两个腔室之间由一块透明的聚甲基丙烯酸甲酯隔板门分隔，该门可自动控制，以允许小鼠进入任一腔室。每个腔室设有两个鼻触孔，配有红外光束，两孔之间为一个带光束检测的食物仓，食物颗粒由颗粒分配器送入该仓以提供食物强化。两个食物仓上方各装有一个风扇和一个笼灯。
- 为每个鼻触孔配备多种可更换的刺激装置（表1）在三个不同的感知维度上存在差异（即， 气味、视觉、触觉）。注意：建议在 表1 为避免因回避或偏好造成的混杂因素或偏差，已选择五对示例刺激，使每个维度均可进行被试内测试，并在每次偏移时使用新颖刺激。
- 递送 嗅觉刺激 将气流导入鼻触孔，使用稀释式嗅觉仪，该仪器通过自动干燥、过滤、再水合以及控制成对气味的呈递，调节进入鼻触孔的气流。
- 使用一个嗅觉仪控制两个鼻触孔。通过气泵和真空装置调节气流，以清除鼻触孔中的气味。将气泵连接至嗅觉仪的进气口，将真空装置连接至安装在鼻触装置上的出气口。然后将嗅觉仪的气味输出口分别连接至每个鼻触孔的进气口。调节流速至每分钟1.5 L。
- 将气味样品用矿物油按1:20比例稀释，并注入嗅觉仪的各瓶中。
- 对于 视觉刺激, 将发光二极管（LED）放置在每个鼻触孔的上方，并将其固定在实验舱的金属面板上（详见 图1 和 表1）。将它们连接到输出接口。
- 对于 触觉刺激，在每个鼻触孔前方安装可更换的地板纹理。将不同纹理固定在滑动支架上，并通过地板下方的框架移动，使其与地板上的小开口（3 x 3 cm）对齐呈现2每个鼻触孔前方的地面上
- 递送 嗅觉刺激 将气流导入鼻触孔，使用稀释式嗅觉仪，该仪器通过自动干燥、过滤、再水合以及控制成对气味的呈递，调节进入鼻触孔的气流。
- 根据制造商的说明，使用软件控制刺激的呈现，以便在实验过程中自动改变不同维度的刺激。
- 将摄像头置于装置顶部，以使用行为监测软件记录基础交替行为和运动活动例如., Ethovision, Anymaze)，这有助于剔除存在与认知功能无关问题的动物。
| 气味 | 质地 | 光线 |
| 桃子 vs. 鼠尾草 | 魔术贴 vs. 薄膜 | 开灯 vs. 关灯 |
| 香草 vs. 薰衣草 | 粗砂纸 vs. 细砂纸 | 红色 vs. 绿色 |
| 草莓 vs. 肉桂 | 光滑纸板 vs. 有棱纹纸板 | 蓝色 vs. 黄色 |
| 葡萄柚 vs. 牛至 | 海绵 vs. 光滑塑料 | 橙色 vs. 白色 |
| 柠檬 vs. 杏子 | 蜂窝纸 vs. 铝箔 | 固定灯光 vs. 闪烁灯光 |
表1. ID/ED Operon 任务中使用的示例刺激。 复合辨别基于成对示例的固定组合（示例辨别序列见图2）。来自不同维度的示例对以随机组合方式呈现。各维度的中性刺激为：无气味的气流；白纸；无光刺激。该表格最初发表于《小鼠最完善的维度内与维度间注意性设定转移任务》19。
2. 动物准备
注意：此处报告的代表性结果来自3至7月龄的雄性C57BL/6J小鼠，在光照期进行实验。
- 单只称量小鼠体重，并在三个间隔日每天单独抓取并处理1分钟。
- 在单笼适应一周后，连续三天记录体重和24小时食物摄入量，以确定基础体重和食物摄入量。
- 在测试前1周实施轻微的食物限制方案。在整个实验过程中，每天监测动物体重，同时限制食物摄入，以维持其体重在自由进食基础体重的约90%。在习惯化训练阶段前连续3天，于小鼠的饲养笼内每天提供约20粒食物强化颗粒，这些颗粒将用于后续测试。
注意：食物限制用于提高动物执行任务的动机，但在整个实验过程的任何阶段，体重减轻不得超过10%，否则可能导致小鼠出现异常行为和过度应激，从而影响实验结果。- 或者，为避免单只饲养，可将小鼠以群居方式饲养（每笼2至4只），并提供 随意 在测试后特定时间段内限制食物供给。在整个实验期间，每天监测动物体重，同时限制食物摄入，以维持其体重约为自由进食时基础体重的90%。
3. 习惯化
- 在为期1天、持续40分钟的训练中，让小鼠在无隔板门的装置内自由活动，当小鼠对任一鼻触孔进行鼻触时，食物接收器中即释放一粒食丸。在此阶段，所有不同维度均仅使用中性刺激（表1）（习惯化1）。
- 次日，训练动物进行40分钟的穿梭学习，要求其在每次试验结束后从一个腔室移动到另一个腔室（习惯化2）。所有不同维度仍仅使用中性刺激。在此阶段，小鼠对任一鼻触孔进行鼻触后，食物仓中即释放一粒食丸。当小鼠在食物仓中取回奖励后，降下隔板门，使其能够进入另一腔室以开始下一次试验。
- 第三天（习惯化3），训练动物完成两项简单辨别任务（SD1和SD2；例如，魔术贴 vs. 薄膜；灯光提示开启 vs. 灯光提示关闭；桃色 vs. 鼠尾草色），达到连续10次试验中正确反应8次的标准。在后续测试阶段不得再次使用这些示例刺激。
- 开始时，将小鼠置于一个腔室中，该腔室呈现中性刺激，而另一腔室则开启刺激线索；随后降下隔板门，使小鼠能够进入具有激活刺激线索的腔室。小鼠需学会选择呈现正确刺激的鼻触孔。每次训练持续40分钟。
- 当小鼠在正确的鼻触孔进行鼻触时，给予食丸奖励；当小鼠进入食物仓取回奖励后，降下隔板门，使其能够进入另一腔室以开始下一次试验。若小鼠在错误的鼻触孔进行鼻触，则不予奖励，并开启笼舍灯5秒，随后降下隔板门，使其进入另一腔室进行下一次试验。
- 每个阶段的前10次试验作为塑造性训练：若小鼠选择了错误的鼻触孔，记录一次错误，但不立即终止试验，而是等待其也对正确鼻触孔进行鼻触后才结束该次试验。在后续试验中，若小鼠在错误鼻触孔进行鼻触，则记录一次错误，并关闭所有维度的刺激以终止该次试验。
- 每次训练持续40分钟，或当小鼠连续5分钟无任何反应时即终止训练，以先发生者为准。若小鼠在单次训练中未达到标准，则在次日继续测试。
- 若小鼠在习惯化3阶段的SD1或SD2任务中经过5次训练仍未能达到标准，则停止对该小鼠的测试并将其剔除出研究，因其无法稳定完成基本辨别任务，可能影响后续ID/ED任务的结果。
图2. ID/ED任务示例。 展示了ID/ED任务中“固着于刺激集”和“双维度”范式的示例。改编自《小鼠终极的内维度与外维度注意性设转移任务》19。 请点击此处查看该图的放大版本。
4. “集合内卡住”识别/消退范式操作流程
注意：本实验步骤此前已在灵长类动物和啮齿类动物中使用过7,15,16，需要对每只测试小鼠操控三个不同的感知维度。在适应阶段，所有每日测试会话均通过将小鼠放入两个腔室中的一个来开始，此时所有刺激均为中性刺激。在每次试验开始前，对面腔室中的刺激线索会被开启。随后，分隔门被降下，使小鼠能够进入另一个已开启刺激线索的腔室。
- 为了训练动物形成对某一感知维度（例如，气味、光线或地板质地）的固定反应模式或偏向，按以下顺序向小鼠呈现相应的辨别任务（另见图2中的示例）：
- 在简单辨别（SD）任务中，向小鼠引入一个在所有任务中直至EDS阶段均相关的维度（气味、光线或质地，见图2）。即，该相关维度指示正确反应的位置。以图2的示例为例，呈现两种气味，如香草（O1）和薰衣草（O2），并将O1设为正确反应。
- 在复合辨别（CD）任务中，引入第二个维度，例如光线，该维度为无关维度（即，不指示正确反应的位置）。将两种光线（L1和L2）与气味（O1和O2）同时呈现，从而形成两种可能的辨别组合（见图2示例）。正确与错误的示例与SD阶段相同。
- 在复合辨别反转（CDRe）任务中，保持示例和相关维度不变，但让动物学习原先正确的刺激现变为错误。例如，将薰衣草设为正确反应，香草则变为错误选择。其他反转阶段（即，IDSRe、IDS2Re和EDSRe）也采用相同条件。
- 随后进行维度内转换（IDS），在该阶段中，相关维度和无关维度均使用新的示例（完全更换设计）。例如，使用草莓和肉桂（O3和O4）作为气味，蓝色和黄色光线（L3和L4）作为光线。但需确保受试动物仍依据相同的相关维度来寻找正确反应。其他维度内转换阶段（即，IDS2）也采用相同条件。
- 与前一辨别任务类似，让小鼠执行维度内转换的反转（IDSRe），条件与CDRe相同。
- 在第二次维度内转换（IDS2）中，采用与IDS相同的条件。
- 同样，在第二次维度内转换反转（IDSRe2）中，采用与CDRe相同的条件。
- 在维度间转换（EDS）任务中，让小鼠在呈现一个新的刺激维度后选择正确的孔位。呈现来自新维度的一对刺激，即质地。例如，使用粗砂纸（T1）作为正确反应，细砂纸（T2）作为错误反应，并同时呈现两种新气味，如柠檬和杏子（O7和O8）。原先的相关维度现变为无关维度，不再呈现原先的无关维度。
- 在维度间反转（EDSRe）任务中，采用与CDRe相同的条件。
- 持续测量小鼠的表现，直至其在连续10次试验中达到8次正确选择的标准，以完成每个阶段。设置程序（见材料表）在达到标准后自动进入下一阶段。每日实验会话在持续40分钟后停止，或当小鼠连续5分钟无任何反应时终止会话，并于次日继续在同一阶段进行测试。
- 对每个阶段，记录达到标准所需的时间。若小鼠在一次会话中未达到标准，则累计连续会话中的总耗时。对每次试验，记录从刺激呈现（气味、光线、质地）到鼻触反应之间的时间（反应潜伏期）。
- 每次会话结束后，用70%酒精擦拭仪器表面。
- 始终按照相同的顺序进行各项辨别任务。但应随机更换所使用的刺激维度及示例对，并在实验组内均衡呈现，组间进行交叉平衡。
- 确保在各实验组内部及组间对所使用的感知维度进行均衡交叉平衡，使每种可能的ED转换均被代表（即，光线到气味、光线到质地、气味到光线、气味到质地、质地到光线、质地到气味）。由于示例组合数量过多，无法实现完全交叉平衡；因此，为减少自由度，始终成对使用示例，例如香草与薰衣草等（见表1）。
5. “二维”ID/ED范式操作流程
注意：另一种用于测量注意力转移能力的条件是“双维度”范式，该范式在灵长类动物12,17和啮齿类动物13中均有应用。在此情况下，整个测试过程中仅使用两个感知维度。
- 本方案中，使用与“陷入集合”（stuck-in-set）方案中所述相同的辨别顺序和操作流程，直至EDS阶段（参见图2中的示例）：
- 在SD阶段及后续阶段，使用与“陷入集合”方案中相同的刺激对，直至IDS2Re阶段。如图2示例所示，使用两种气味（O1和O2，以O1作为正确刺激）。
- 在CD阶段，与“陷入集合”方案相同，引入一个新的无关维度（例如光，L1和L2），作为干扰因素。
- CDRe阶段与“陷入集合”方案中的操作类似，即保持原有刺激示例和相关维度不变，但让动物学习此前正确的刺激现变为错误（例如，O1）。
- 在IDS阶段，两个维度均使用全新的刺激对（O3和O4，L3和L4，其中O3为正确刺激）。
- 在IDSRe阶段，让小鼠执行IDS阶段的反转任务。选择在IDS阶段曾为错误的刺激作为当前正确示例（例如，O4）。
- 在IDS2阶段，为两个维度引入新的刺激对（O5和O6，L5和L6）。
- 与之前的反转阶段类似，在IDS2Re阶段，让动物学习此前正确的刺激现变为错误（例如，O5）。
- 在“双维度”（two-dimension）方案的EDS阶段，小鼠需在原本无关的维度转变为相关维度后，选择正确的反应。此时，光成为新的相关维度，指示正确反应。具体而言，红光（L7）为正确反应。相反，此前的相关维度（在本示例中为气味）现变为无关维度。
- 在EDS阶段之后的反转阶段（EDSRe），使用与CDRe相同的条件。相关维度与EDS阶段相同，但正确与错误示例互换。因此，例如，绿光（L8）现为正确反应。
6. 数据分析
- 通过以下指标评估表现：达到标准所需的试验次数；达到标准所需时间（以分钟计）；刺激呈现至鼻触反应之间的时间（反应潜伏期）。
- 对于统计分析，采用重复测量方差分析（ANOVA），以不同阶段（SD、CD、CDRe、IDS、IDSRe、IDS2、IDSRe2、EDS 和 EDSRe）作为组内因子，检验达到标准所需的试验次数、完成各阶段所需时间以及反应潜伏期。进行 事后 使用Newman-Keuls检验进行分析。注意：显著性水平的公认阈值为p<0.05.
结果
图2 展示了ID/ED任务的一个示例。在每个阶段中，随机呈现刺激对（“辨别1”或“辨别2”），小鼠必须在每对刺激中选择正确的刺激。在此示例表格中，正确的样本以粗体标出。在第一阶段（SD，即简单辨别）中，两个鼻触孔中呈现的刺激在三个维度之一上有所不同（例如， O1：香草 vs. O2：薰衣草 小鼠在选择正确的样本时会获得奖励（例如， O1）。当受试者在此阶段达到标准后，将进入下一阶段（CD 或复合辨别阶段），此时相关维度的相同范例会随机叠加第二个无关维度的范例呈现，后者作为混淆因素引入。例如，L1：蓝光 vs. L2：黄光）。此阶段可进行两种不同的辨别任务（“辨别1”或“辨别2”）。在下一阶段（CDRe，即复合辨别反转），奖励的关联性发生反转，但示例刺激和相关维度保持不变：小鼠需学会原先正确的刺激现在变为错误的例如， 薰衣草气味现在会得到奖励）。在下一阶段（IDS，即维度内转换），引入新的示例刺激（包括气味和光刺激），但相关的维度（在此例中为气味）保持不变（例如， 草莓是正确选择）。在下一阶段（IDR，即维度内反转），奖励的关联性发生反转。在第二次维度内转换（IDS2 及其反转）之后，引入新的示例以测试维度外转换（EDS），此时相关的维度发生改变。在“固着于原有维度”的 EDS 任务中，小鼠必须将注意力集中到新的维度上例如， 质地，T1：粗砂纸 与 T2：细砂纸），而先前相关的维度（在此为气味）变为无关维度。在“双维度”EDS中，先前无关的维度（在此为光线）变为相关维度。在最后阶段（EDSRe或跨维度反转），奖励的对应关系被反转。
为了获得可靠的结果，任务中使用的刺激维度应具有相近的学习程度。如图3所示，在该新型装置中，视觉、触觉和嗅觉辨别达到标准所需的时间（F(2,64)=0.36；p=0.69）和试验次数（F(2,64)=0.059；p=0.94）相似，表明动物能够不受所呈现维度的影响，完成简单的辨别任务。
如果在任务的测试阶段已建立起可靠的注意力定势，正常野生型小鼠在EDS阶段的表现应比之前和之后的阶段更差，这与之前在啮齿类和灵长类动物研究中报道的结果一致12,13。特别是与IDS阶段相比，EDS阶段达到标准所需的时间和试验次数应出现显著增加。如图4所示，在采用“固着于定势”（stuck-in-set）方案的实验中，对小鼠行为表现的分析显示，在达到标准所需的试验次数（F(8,168)=9.23；p<0.0001）和时间（F(8,168)=8.62；p<0.0001）方面均存在显著的辨别效应。实际上，小鼠在EDS阶段所需的试验次数和时间均显著多于CD、IDS、IDS2和EDSRe阶段（p<0.05；图4A-B）。类似地，采用“双维度”（two-dimension）方案进行测试的表现分析（图5）也显示，在达到标准所需的试验次数（F(8,72)=3.66；p<0.005）和时间（F(8,72)=4.65；p<0.0005）方面存在显著的辨别效应。结果显示，与CD、IDS、IDS2和EDSRe阶段相比，小鼠在EDS阶段需要更多的试验次数（p<0.05）和更长的时间（p<0.05）（图5A-B）。在不同维度下测试的小鼠，其转换能力不应表现出差异。
在正常的野生型小鼠中，第一次逆转学习（即，CDRe）比初始辨别学习（即，CD）更为困难。与此一致，从图4和图5中可以明显看出，小鼠完成这一阶段所需的试验次数更多（p<0.05；图4-5A）且耗时更长（p<0.05；图4-5B）。此外，随着任务的进行，逆转学习的表现应从CDRe到IDSRe再到IDS2Re逐步改善，这一点我们在“固着于刺激集”和“双维度”两种实验方案中均得到了验证。这些结果进一步强化了任务过程中注意力集形成的确凿证据。
在整个任务过程中，小鼠的反应速度应随着阶段的推进而逐渐提高。相应地，对反应潜伏期的分析显示存在显著的辨别效应（F(8,200)=42.59；p<0.0001）。特别是，如图4C所示，小鼠在IDS2阶段的探鼻潜伏期相较于IDS、CD和SD阶段明显缩短（p<0.0005）。此外，在EDS阶段的反应潜伏期相较于前一阶段IDS2和IDS2Re以及后续的EDSRe阶段均有所增加（p<0.05）。与上述结果一致，在“双维度”任务中对反应潜伏期的分析也显示出辨别效应具有显著性（F(7,63)=9.98；p<0.0005）。如图5C所示，在EDS阶段做出选择的潜伏期相较于之前的IDS2和IDS2Re阶段以及后续的EDSRe阶段均有所延长（p<0.05）。由于反应潜伏期已被视为决策加工的一个指标18，这些结果进一步提示小鼠在EDS阶段处理新的辨别规则时遇到了一定困难。基于野生型小鼠的行为表现（图4-5），我们通过R语言功效分析确定每个实验组所需的最小样本量应为8只。
图 3. 光、气味和质地的简单辨别能力相当。（A）仅使用光、气味或质地刺激进行简单辨别任务时，达到标准所需的试验次数；（B）所需时间。所有图 2-4中的数值均表示为均值 ± 标准误（SEM）。数据最初发表于'小鼠最完善的内外维度注意集转移任务'19。
图 4. 野生型 C57BL6J 雄性小鼠在“固着于规则集”（stuck-in-set）ID/ED Operon 任务中的表现。（A）在 ID/ED Operon 任务的不同阶段达到标准所需的试验次数；（B）在不同阶段达到标准所需的时间（分钟）及天数，采用“固着于规则集”ID/ED 范式；（C）任务各阶段中，隔板门打开至小鼠发生鼻触反应之间经过的时间（反应潜伏期，单位为秒）。共测试了 26 只小鼠，其中 4 只因在训练期间未能稳定进行鼻触以获取食物强化，或无法完成全部实验流程而被剔除。A：*p <0.05，与 CD、IDS、IDS2、IDS2Re 和 EDSRe 组相比；B：*p <0.05，与 CD、IDS2、IDS2Re 和 EDSRe 组相比。A 和 B：#p<0.05，##p<0.005，与 CD、IDSRe 和 IDS2Re 组相比。C：*p <0.05，与 IDS2、IDS2Re 和 EDSRe 组相比。请注意，在本研究报道的所有实验中，小鼠均能在 5–9 天内完成整个任务（见图 3–4）。数据最初发表于《小鼠最完善的内外维度注意力转移任务》19。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5．野生型 C57BL6J 雄性小鼠在“二维”ID/ED Operon 任务中的表现。（A）各阶段完成所需试验次数，（B）在ID/ED Operon任务的不同阶段达到标准所需的时间（分钟）及天数，采用二维范式进行测试。（C）任务各阶段中，隔板门打开至小鼠发生鼻触反应之间所经过的时间（反应潜伏期，单位为秒）。共测试了13只小鼠；其中3只因在训练期间未能稳定进行鼻触以获取食物强化，或无法完成整个实验流程而被剔除。A和B：#p<0.05 与 CD 和 IDS2Re 组比较，*p <0.05 与 CD、IDS、IDS2、EDSRe 组比较。C：*p <0.05 与 IDS2、IDS2Re 和 EDSRe 组比较。数据最初发表于《小鼠最优化的内外维度注意性设定转移任务》19。 请点击此处查看该图的放大版本。
图6. 测试ID/ED任务整个实验流程的时间线。
| 阶段 | 描述 | 附加说明 | 参考文献 |
| 简单辨别（SD） | |||
| 复合辨别（CD） | 刺激在两个感知维度上变化，例如在人类任务中的视觉刺激涉及颜色和形状，或在啮齿类动物中涉及质地和气味刺激 | ||
| 逆转学习（CDRe – IDSRe – IDS2Re – EDSRe） | 在某一感知维度内的两个示例刺激的强化条件发生逆转，即原先正确的选择变为错误，而原先错误的选择变为正确 | 在序列性逆转学习中，随着连续的组内逆转，表现会逐步改善。因此，逆转学习阶段（i.e., CDRe、IDSRe、IDS2Re）不仅用于评估不同皮层区域的功能，还具有以下两个作用：1）形成在EDS阶段受到挑战的认知-注意定势；2）防止对刺激中非预期特征产生迷信性条件反射 | - 小鼠（Bissonette 等, 2008）和猴子（Dias 等, 1996）的眶额叶皮层损伤会损害逆转学习 - 在执行逆转学习任务期间的fMRI研究显示眶额叶皮层被激活（Hampshire 和 Owen, 2006） |
| 维度内转换（IDS – IDS2） | 引入新的示例刺激，但强化的维度保持不变 | IDS阶段作为关键的内部对照（i.e., EDS应比IDS更困难），同时也参与认知-注意定势的形成 | 前额叶皮层（PFC）多巴胺耗竭会损害注意定势的形成（Robbins 和 Roberts, 2007）。6-OHDA损毁的猴子未表现出从第一个（IDS1）到最后一个（IDS5）辨别任务中错误率的经典性下降，而这种下降本应反映注意定势的建立 |
| 维度间转换（EDS） | “固着于定势”（stuck-in-set）范式：原先无关的刺激维度被一个全新的、立即变为相关的刺激维度所替代 | 无法转向新的相关维度不能归因于对该维度的先前学习经验，因为该维度此前从未出现过。因此，这种失败反映了对先前相关维度的持续固着（perseveration） | - mPFC损伤已被证明会损害小鼠（Bissonette 等, 2008）和猴子（Dias 等, 1996）的EDS表现 - 额叶损伤患者在“固着于定势”（perseveration）条件下表现受损，但在“双维度”（two dimension）条件下则不受影响（Owen 等, 1993） - mPFC中的多巴胺调节小鼠（Papaleo 等, 2008；Scheggia 等, 2014）和大鼠（Tunbridge 等, 2004）的EDS表现 |
| “双维度”（two dimensions）范式：强化原先无关的维度 | 表面上的注意定势转换失败可能源于：受试者能够将注意力从原先相关的维度转移开（当该维度变为无关时），但却无法将注意力重新聚焦到新出现的相关维度上 | - 大鼠mPFC损伤（Birrell 和 Brown, 2000）会损害EDS转换能力 - 在执行EDS任务期间的fMRI研究显示腹外侧前额叶皮层（ventro-lateral PFC）被激活（Hampshire 和 Owen, 2006） |
表2：ID/ED操作任务的阶段 Operon 任务。 描述任务的各个阶段，包括有关脑区在任务中测试的不同认知构念中作用的损毁和药理学研究的参考文献。
讨论
本研究介绍了一种新型的自动化双室ID/ED "Operon" 任务，可用于小鼠认知灵活性的可靠测量，涵盖逆转学习、注意集的形成与转换。该范式类似于在人类和非人灵长类中常用的WCST及ID/ED任务，克服了以往啮齿类动物版本的主要局限性。Operon 范式可作为研究小鼠认知（障碍）功能相关药物和/或遗传大规模筛选的新有效工具，对转化医学具有高度相关性。
与先前用于啮齿类动物的ID/ED任务相比，这种自动化任务具有以下优势：（1）相比手动操作版本，其操作更为省力（例如，软件控制任务的所有阶段，极大减少了实验人员的干预）；（2）消除了测量参数中任何主观性来源（例如， 无需实验人员判断动物是否真正做出了选择性反应）；（3）排除了小鼠可能依据与强化相关的线索来做出反应的可能性（即，奖励始终自动递送至中央食盒）；（4）避免了任意环境条件的影响（例如， 使用不同尺寸/材料的迷宫和装置、手动制备的线索刺激）；（5）可根据临床环境中使用的人类等效任务，对三个不同维度进行调控，并提供大量不同的刺激。本文仅展示来自小鼠的数据，但大鼠也可能获得类似的优势。
任务中存在若干关键步骤，这些步骤是内部结构效度参数，可用于识别可靠的注意力转移表现：i) 在EDS阶段的表现较之前阶段更差；ii) 从IDS到IDS2阶段整体表现有所提升；iii) 在连续的反转阶段中表现出特定的改善，即动物在组内反转训练越多，其后续组内反转的表现应越好20；iv) 在EDSRe阶段的表现优于EDS阶段。这种新型的ID/ED操作子任务具备上述所有特征，与先前在灵长类动物中使用CANTAB ID/ED任务以及在啮齿类动物中使用手动"挖掘"版本的研究结果一致12,13。此外，无论所使用的相关/无关维度（i.e., 气味、质地和光）如何，该自动化任务的每个阶段均在相当数量的试验中被学会19。这表明所使用的所有刺激具有相似的显著性，适用于注意力集的形成和/或转移。我们的实验表明，EDS阶段解决难度的增加也体现在反应潜伏期的延长上。在更困难的辨别任务中，处理时间增加以维持最佳准确性21。因此，将反应潜伏期视为信息加工速度、决策和问题解决能力的指标18，EDS阶段较慢的潜伏期可能反映了为应对注意力转移困难而采取的一种策略。
我们已证明，我们的新型装置可有效应用于更“经典”的注意集转移范式，该范式在整个测试过程中仅使用两个维度。即， 二维）或与 卡在设定中 范式，意味着使用三维空间。根据所关注的认知领域，可以选择最合适的实验方案。这两种范式此前已在人类、灵长类动物和啮齿类动物中应用。7,12-17。然而， 卡在设定中 该方法能够区分集合转换的不同组分，是对人类患者额叶功能更为特异的测量指标7,22此外，可能出现的一个问题是 二维 范式是 习得性无关 可能会使结果产生偏倚。习得性无关性固着指的是个体无法关注并学习那些先前被认为无关的信息7. 这种情况可能出现在EDS阶段的 二维 范式中，被试需要将注意力转向先前无关的维度。在这种情况下，基本无法辨别EDS缺陷是源于无法将注意力从先前相关的维度转移开，和/或无法将注意力转向先前无关的维度。这种损害可能仅仅反映了对先前因与强化反馈随机关联而被判定为无关的维度进行反应的主动抑制。相比之下，在 卡在设定中 条件，无法转向新的相关维度不能归因于对该维度的先前学习，因为该维度此前未被经历。因此，这种失败反映了对先前相关维度的持续固着。总之，即使在正常的野生型小鼠中，“固着于类别”和“双维度”注意性集合转移范式可能产生相似的结果，但基于上述讨论的原因，我们明确倾向于使用“固着于类别”的持续行为范式。
披露
作者声明不存在任何经济利益冲突。
致谢
我们感谢 G. Pruzzo 提供的出色技术支持，以及 IIT 机械车间在搭建新设备过程中给予的帮助。本研究得到了意大利技术研究院（Istituto Italiano di Tecnologia）、玛丽·居里第七框架计划再整合基金（FP7-Reintegration-Grant）N°268247，以及意大利卫生部青年研究人员基金（GR-2010-2315883）的资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 有机玻璃壁和铝制底板 | 定制 | （每个舱室尺寸为 16 x 16 x 16 cm） | |
| 有机玻璃门 | 定制 | ||
| 计算机（PC） | Dell Inc. | ||
| MED-PC IV 软件 | (Med Associates, St. Albans, VT, USA) | 定制 | 使用操作性编码以自动控制刺激的呈现及各阶段的顺序 |
| 鼻触孔 | Med Associates, St. Albans, VT, USA) | ENV-314M | |
| 食物仓 | Med Associates, St. Albans, VT, USA) | ENV-303M | |
| 用于食物强化的颗粒分配器 | Med Associates, St. Albans, VT, USA) | ENV-203-14P | |
| 舱内照明灯 | Med Associates, St. Albans, VT, USA) | ENV-315M | |
| 稀释式嗅觉仪 | (Med Associates, St. Albans, VT, USA) | PHM-275 | |
| 液态气味剂 | (Sigma Aldrich, Dorset, UK) | （见表1） | |
| 矿物油 | (Sigma Aldrich, Dorset, UK) | M5904 | |
| 气泵和真空装置 | (Med Associates, St. Albans, VT, USA) | PHM-280 | 建议在每次试验结束后使用真空装置清除气味 |
| 发光二极管（LED） | 高亮度、透明宝石型，3 mm | ||
| 地面纹理 | 3x3 cm | ||
| 强化颗粒 | TestDiet | 5TUL 14mg | 适用于小鼠 |
参考文献
- Keeler, J. F., Robbins, T. W. Translating cognition from animals to humans. Biochemical pharmacology. 81 (12), 1356-1366 (2011).
- Milner, B. Effects of Different Brain Lesions on Card Sorting. Arch Neurol. 9, 100-110 (1963).
- Roberts, A. C., Robbins, T. W., Everitt, B. J. The effects of intradimensional and extradimensional shifts on visual discrimination learning in humans and non-human primates. The Quarterly journal of experimental psychology. B, Comparative and physiological psychology. 40 (4), 321-341 (1988).
- Barnett, J. H., Robbins, T. W., Leeson, V. C., Sahakian, B. J., Joyce, E. M., Blackwell, A. D. Assessing cognitive function in clinical trials of schizophrenia. Neuroscience and biobehavioral reviews. 34 (8), 1161-1177 (2010).
- Hill, E. L. Executive dysfunction in autism. Trends in Cognitive Sciences. 8 (1), 26-32 (2004).
- Ceaser, A. E., Goldberg, T. E., Egan, M. F., McMahon, R. P., Weinberger, D. R., Gold, J. M. Set-shifting ability and schizophrenia: a marker of clinical illness or an intermediate phenotype. Biological psychiatry. 64 (9), 782-788 (2008).
- Owen, A. M., Roberts, A. C., Hodges, J. R., Robbins, T. W. Contrasting mechanisms of impaired attentional set-shifting in patients with frontal lobe damage or Parkinson's disease. Brain. 116 (5), 1159-1175 (1993).
- Head, D., Bolton, D., Hymas, N. Deficit in cognitive shifting ability in patients with obsessive-compulsive disorder. Biological Psychiatry. 25 (7), 929-937 (1989).
- Chamberlain, S. R., et al. Translational approaches to frontostriatal dysfunction in attention-deficit/hyperactivity disorder using a computerized neuropsychological battery. Biological psychiatry. 69 (12), 1192-1203 (2011).
- Gilmour, G., et al. Measuring the construct of executive control in schizophrenia: Defining and validating translational animal paradigms for discovery research. Neuroscience and biobehavioral reviews. , 1-16 (2012).
- Barch, D. M., Braver, T. S., Carter, C. S., Poldrack, R. A., Robbins, T. W. CNTRICS final task selection: executive control. Schizophrenia bulletin. 35 (1), 115-135 (2009).
- Dias, R., Robbins, T. W., Roberts, A. C. Dissociation in prefrontal cortex of affective and attentional shifts. Nature. 380 (6569), 69-72 (1996).
- Birrell, J. M., Brown, V. J. Medial Frontal Cortex Mediates Perceptual Attentional Set Shifting in the Rat. The Journal of Neuroscience. 20 (11), 4320-4324 (2000).
- Bissonette, G. B., Martins, G. J., Franz, T. M., Harper, E. S., Schoenbaum, G., Powell, E. M. Double dissociation of the effects of medial and orbital prefrontal cortical lesions on attentional and affective shifts in mice. The Journal of Neuroscience. 28 (44), 11124-11130 (2008).
- Papaleo, F., et al. Genetic dissection of the role of catechol-O-methyltransferase in cognition and stress reactivity in mice. The Journal of Neuroscience. 28 (35), 8709-8723 (2008).
- Garner, J. P., Thogerson, C. M., Würbel, H., Murray, J. D., Mench, J. A. Animal neuropsychology: validation of the Intra-Dimensional Extra-Dimensional set shifting task for mice. Behavioural brain research. 173 (1), 53-61 (2006).
- Owen, A. M., Roberts, A. C., Polkey, C. E., Sahakian, B. J., Robbins, T. W. Extra-dimensional versus intra-dimensional set shifting performance following frontal lobe excisions, temporal lobe excisions or amygdalo-hippocampectomy in man. Neuropsychologica. 29 (10), 993-1006 (1991).
- Robbins, T. W. The 5-choice serial reaction time task: behavioural pharmacology and functional neurochemistry. Psychopharmacology. 163 (3-4), 362-380 (2002).
- Scheggia, D., Bebensee, A., Weinberger, D. R., Papaleo, F. The ultimate intra-/extra-dimensional attentional set-shifting task for mice. Biological psychiatry. 75 (8), 660-670 (2014).
- Machkintosh, N. J. The effects of overtraining on a reversal and a nonreversal shift. Journal of Comparative and Physiological Psychology. 55 (4), 555-559 (1962).
- Abraham, N. M., Spors, H., Carleton, A., Margrie, T. W., Kuner, T., Schaefer, A. T. Maintaining accuracy at the expense of speed: stimulus similarity defines odor discrimination time in mice. Neuron. 44 (5), 865-876 (2004).
- Cools, R., Rogers, R., Barker, R. A., Robbins, T. W. Top-down attentional control in Parkinson's disease: salient considerations. Journal of cognitive neuroscience. 22 (5), 848-859 (2010).
重印与许可
