功能性克隆使用爪卵母细胞表达系统

Summary

我们描述了一种非洲爪蟾卵母细胞和动物帽系统，用于表达克隆能够在感受态外胚层中诱导反应的基因，并讨论了此类基因的后续分析技术。该系统可用于多种基因产物的功能鉴定。

Abstract

鉴定负责胚胎诱导的基因带来了许多挑战;仅举几例，分泌的目标分子可能丰度较低，可能没有分泌但与信号细胞相连，或者可能需要结合伴侣或上游调节分子的存在。因此，在寻找能够在感受态外胚层中引发早期晶状体诱导反应的基因产物时，我们利用了一种表达克隆系统，该系统可以识别旁分泌或近分泌因子以及转录或其他调节蛋白。将 mRNA 池注射到非洲爪蟾卵母细胞中，并将响应组织直接置于卵母细胞上并共培养。根据 ldb1 在晶状体感受态动物帽外胚层中引发早期晶状体平板标记物 foxe3 表达的能力，从神经板期 cDNA 文库中对 ldb1 进行功能克隆后，我们表征了 mRNA 表达模式，并分析了 ldb1 过表达或敲低后的发育进展.该系统适用于使用感受态组织中的功能反应来鉴定诱导剂或其上游调节分子的非常广泛的环境。

Introduction

通过功能或功能丧失来识别目标基因的正向遗传方法^1,2 是理解发育中复杂模式事件不可或缺的一部分。 再加上越来越多的系统和研究人员^3-5 可用的强大反向遗传技术，现在可以识别在通路中具有关键功能作用的基因，然后在细胞水平上阐明该功能以及与其他基因产物的相互作用。 表达克隆是一种功能鉴定目的基因的方法是表达克隆^6,7，过去已经产生了许多关键发现。

我们最近的目标⁸ 是确定早期晶状体诱导因素，因为已经证明脊椎动物晶状体诱导过程的初始步骤早在原肠阶段就发生了。 为此，我们使用非洲爪蟾胚胎的瞬时晶状体能力⁹ 动物帽外胚层（11-11.5¹⁰ 期）作为诱导的反应组织，并使用 VI 期非洲爪蟾卵母细胞作为诱导因子的产生来源。

以下方案建立在 Smith 和 Harland^6,7 的表达克隆和 sib 选择方案的基础上，也被其他人^11-13 成功使用。 在我们的卵母细胞表达系统（Lustig 和 Kirschner¹⁴ 首次用于生产诱导因子）中，选择并鉴定能够直接或间接导致卵母细胞产生在动物帽外胚层中引发晶状体诱导反应的因子的注射转录物库。 由于该系统可用于直接表达分泌的诱导分子（卵母细胞注射的 INHBB mRNA 导致中胚层诱导中胚层感受态动物帽外胚层⁸），我们最初预计筛选程序主要用于识别旁分泌因子。 然而，由于我们在筛选中鉴定出核因子 （ldb1⁸），因此很明显该系统可用于鉴定多种分子，例如转录或翻译调节因子、miRNA、辅因子或近代因子。

Protocol

所有的实验程序都经弗吉尼亚机构动物护理和使用委员会的大学。

注意: 图1示出的实验步骤的示意图。

1.准备卵母细胞

1. 前总理X.蟾女性，150ü孕马血清促性腺激素（PMSG）大约提前一个星期的卵母细胞隔离。注射1毫升150单位/毫升PMSG到背部淋巴囊有1毫升无菌注射器用29克针。
2. 准备注入卵母细胞和卵母细胞动物帽检测解决方案。
   1. 制备的Ca ^{++ / Mg} ++的-free OR2（OR2-）:82 mM氯化钠，2.5mM的氯化钾，1.5mM的钠_{2 HPO 4，50mM}的HEPES pH7.2的。
   2. 准备OR 2:OR2-加1毫米氯化钙₂和1毫米氯化镁_2。
   3. 制备OCM:60％的Leibovitz L15，0.4毫克/毫升BSA，100μg/ ml的庆大霉素，pH值7.8。
   4. 预削1×MBS:88 mM氯化钠，1mM的氯化钾，0.7毫米氯化钙_2，1mM的_MgSO 4干燥，5mM的HEPES（pH值7.8），2.5毫_{碳酸氢钠。}
   5. 准备3％聚蔗糖在1X MBS。
   6. 制备1×NAM:110 mM氯化钠，2mM的氯化钾，1毫米的_Ca（NO 3）2，1mM的_MgSO 4干燥，0.1毫摩尔EDTA，1毫_碳酸氢钠 ，2毫的Na _{3 PO 4，pH} 7.4中。
3. 麻醉雌性在3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐在0.1倍的MBS 0.03％溶液（MS222）通过将蛙在溶液中（第一溶解在10ml 95％乙醇0.3克MS222，然后稀释在1升0.1×MBS） 10 - 15分钟或直到反应迟钝。
   1. 检查麻醉完成后转动麻醉青蛙到它的后面，以确保它不会响应（不完全麻醉的青蛙四肢移动或转动身体以上）。
4. 手术通过穿过皮肤和体壁与手术刀片腹部切口，分离卵巢组织钳分离卵巢片段和剪刀。将卵巢碎片进入OR2-。收身的墙上用3-0丝线在一个24mm弯针，并分别与相同缝合关闭皮肤。允许女性的恢复在1克/升鱼缸盐水。
5. 用细镊子，撕裂卵巢组织成小（10 - 20卵母细胞）件，转移至新鲜OR2-。
6. 在OR2- 2.0毫克/毫升胶原酶甲Defolliculate卵巢片段轻轻搅动在摇床上1小时，转移到新鲜胶原酶和搅拌一小时。
7. 洗卵母细胞的10倍OR 2 [含Ca ^{++ / Mg} ++的]，舍弃小卵母细胞。
8. 在OCM洗卵母细胞的两倍，并转移到新鲜OCM。在目视检查隔离第六阶段的卵母细胞通过尺寸和丢弃未成熟（较小）的卵母细胞:第六阶段的卵母细胞是大于未成熟卵母细胞即使色素沉着动物半球和大约1.2-1.4毫米的直径。
9. 卵母细胞保持在18 - 20°C IñOCM注射前。注意:琼脂糖包被的培养皿中，可以使用最小化的卵母细胞的粘附抛出。

2.注射图书馆成绩单

1. 制备定向cDNA文库¹⁵使用RNA在发展的适当阶段（例如，神经板级14 ^10）萃取。购买的cDNA文库，或者使用下面的四个步骤每概览​​商品化试剂盒构造之一。
   1. 通过使用产品以富集多聚（A）+ RNA（见表材料）和下列制造商的说明分离约5微克的mRNA。注意:要使用的转录物产生的cDNA文库可以被限制为一个诱导的组织（如神经板，以下所需组织的显微切割），或者可以是从全胚胎在特定阶段。
   2. 产生的cDNA用市售试剂盒，按照制造商的指示。
   3. 结扎大约20纳克的cDNA到vectoř附带市售试剂盒或其他合适的载体中。合适的质粒载体包括用于mRNA稳定性如5'β珠蛋白和3多聚（A）序列（PCS2 + pTnT，pCS105）序列。
   4. 转换连接入使用供应商推荐的协议，用于热休克转化能力的细菌细胞。
      注意:可替换地，开放阅读框（ORFeome）克隆的集合是可​​商购，并且可以用于产生转录物用于注射。
2. 制备的¹⁰ 3的质粒的10池¹⁰ 4复杂性^（10 4〜10 ⁵的总的复杂性）。这代表10板的1000 - 每套1殖民地。
   1. 板库培养到10 15厘米LB-氨苄青霉素板，成长12 - 18小时在37℃，并收集从每个用一个玻璃吊具温和的压力菌落在7ml LB.
   2. 从0.5毫升准备甘油股票（添加到0.2毫升无菌甘油并储存在-20℃＃730; C）中，并用剩余的6.5 ml至与标准制备DNA市售的DNA miniprep试剂依照制造商的指示。
3. 线性合并的质粒DNA（1.0 - 2.0微克）用合适的限制性酶消化¹⁶在37℃，1 - 1.5小时。隔离用苯酚/氯仿提取，随后用乙醇沉淀和再悬浮在每所使用的RNA聚合酶试剂盒的规格水的线性化的DNA。合成有义RNA用市售RNA聚合酶试剂盒按照生产商的指示。
4. 制备约20微米的直径的针显微注射（使用针拔出器与玻璃毛细管）;衡量一个复合式显微镜与校准的目镜测微尺针尖。注:针拔出器设置必须根据经验确定生产针用细尖，这样当用细镊子破碎产生期望的针尖大小。
5. 准备（粘土推入在培养皿底部）均匀一层黏土衬里35×10毫米，平行的凹槽显微注射期间举行的地方卵母细胞培养皿中;产生的凹槽与融合在火焰尖端商场探头或巴斯德吸管。作为一种替代粘土，准备做的压痕的弹性^模 17琼脂糖菜肴。转移的卵母细胞用宽口移液管至3％聚蔗糖在1X MBS（约2毫升）中的粘土内衬菜肴行。
6. 用微量注射器，填补针1毫微克/ NL RNA和调整平衡，产生轻微的正压力（以防止制订卵母细胞胞浆内）。
7. 注入的卵母细胞，在赤道区域大约20 NL核糖核酸。允许1小时的注入卵母细胞留在菲-MBS，然后轻轻地转移到1X MBS。在20℃之前动物帽测定24小时 - 孵育8。

3.动物帽化验

1. 准备3/4倍不结盟运动和获得细镊子，发圈​​，弯曲盖玻片碎片，黏土衬里的DISHES杯状凹陷举行的卵母细胞。 （ - 2毫米×2 - 4 mm产品大约1），并穿过火焰直到边缘抛光和下垂，产生弯曲片通过分解盖玻片成小片段，使弯曲盖玻片片段。
2. 施肥X.蟾卵¹⁸通过在体外或自然交配和文化的原肠胚阶段-在0.1倍MBS（10 11小时受精后在室温）之前逐步排序;收集中期原肠胚（阶段11 - ^11.5）10胚胎。
3. 转移到胚的培养皿大约半满与3/4×NAM。使用两对细镊子，从原肠胚取出施肥（卵黄）膜。
4. 卵母细胞转移到3/4倍NAM（约2毫升）的粘土成荫的菜肴和固定在粘土个人的印象，产生的印象，以适应单个胚胎的凹槽中如上所述。
5. 转移胚胎到粘土内衬菜切动物帽关克使用两对细镊子的astrulae。小心分离的动物帽外胚层，而不是只赤道组织^18。
6. 放在每个卵母细胞与动物帽接触卵母细胞的内表面形式的动物用半球动物帽。 8小时或更长的时间 - 通过将弯曲的玻璃盖玻片片段并施加向下的压力施加到玻璃，压扁外胚层作为盖玻片接触粘土（动物帽可以保持与暴露于卵母细胞为6的表面内层开放保持重组体一起）。
   注意:可替换地，将动物帽成粘土压痕与它的内表面朝上，并放置在盖的卵母细胞;保护与粘土的小扩展重组。
7. 文化在20°C，直到控制胚胎达到所需要的阶段检测。
8. 分离重组去除盖玻片/粘土和外胚层分离钳和吹风循环。
9. 修复外胚层片段1小时的MEMFA（3.8％甲醛在MEM [0.1M的MOPS pH为7.4，2mM的EGTA，和1mM _MgSO 4干燥]）。
10. 转移片段（和控制胚胎）从MEMFA成乙醇和储存在-20℃。

反应在外胚层原位杂交4.分析（ISH）

1. 准备ISH的解决方案。
   1. 制备的1×PBS:0.01M磷酸盐缓冲盐水，氯化钠0.138男，pH 7.4的
   2. 制备PBS-吐温（PTW）:1×PBS，0.1％Tween-20的
   3. 准备100X Denhart的解决方案:2％BSA，2％的聚乙烯吡咯烷酮，2％聚蔗糖
   4. 制备杂交缓冲液:50％甲酰胺，5×SSC，1毫克/毫升圆酵母RNA，1微克/毫升肝素，1×Denhart溶液，0.1％吐温-20，0.1％CHAPS，10毫摩尔_{EDTA，DEPC-H} 2 O的
   5. 准备马来酸缓冲器（MAB）:100毫米马来酸，150毫米氯化钠，pH值7.5
   6. 准备MAB +块:MAB，2％封闭试剂（加热至60℃溶解）
   7. 准备碱性磷酸酶（AP）缓冲液:100毫米的TrispH值9.5，50毫米氯化镁_2，100毫米氯化钠，0.1％吐温，卫生署_{2 O}
2. 准备RNA探针。
   1. 用市售RNA聚合酶试剂盒，挖-NTP混合物，添加到1.5ml试管（50微升反应）:25.5微升DEPC-H _{2 O，10}微升5X转录缓冲液，2.5微升10X掏-NTP混合物，5微升100毫DTT，2微升的RNasin，2微升线性DNA模板（约1微克/微升），3μl的核糖核酸聚合酶，孵育37℃90分钟。
   2. 添加2微升的RNA聚合酶，孵育37℃60分钟。
   3. 检查2微升反应的1％琼脂糖凝胶。
   4. 加入1μlRQ1无RNA的DNA酶孵育37℃20分钟。
   5. 通过加入50μlDEPC-H _{2 O，25}微升10μM的乙酸铵和313微升乙醇沉淀探头。储存在-20℃过夜（O / N），然后通过离心分离回收的RNA在13800×g离心20分钟。用500微升75％乙醇洗涤，短暂离心，去掉乙醇并允许沉淀风干。加入50微升_DEPC-H 2 O
   6. 添加杂交缓冲液至0.5微克/微升〜的终浓度。
3. 准备组织进行杂交。除非另有说明，填充小瓶与每个解变化描述（约4毫升）中的顶部。
   1. 除去从小瓶和移植胚乙醇到75％乙醇/ PTW，然后用50％的乙醇/ PTW，每次10分钟，水平方向上的摇杆。
   2. 在PTW每个摇杆上的5分钟洗三次。
   3. 转移到10微克/微升蛋白酶K处理的PTW;岩管垂直15分钟。
   4. 岩管垂直 - 在0.1M三乙醇胺pH值7.8冲洗两次，每次10分钟。
   5. 添加12.5微升乙酸酐到管和岩石竖直5分钟。重复用另外的12.5微升乙酸酐5分钟。
   6. 在PTW 5分钟垂直于摇杆清洗。
   7. Refix在4％多聚甲醛20分钟的摇杆。热杂交缓冲液到60℃。
   8. 在PTW每个摇杆上的5分钟洗三次。
   9. 从各管中取出PTW的所有，但约1毫升加250微升HYB缓冲;轻轻摇动管混匀。岩管竖直5分钟。
   10. 替换60℃HYB缓冲液（0.5毫升）和轻轻搅动在60℃10分钟。更换新鲜HYB缓冲器和搅在60℃两至4小时。
   11. 热探针（1混合物在0.5微克/微升在HYB缓冲液）到60℃（3分钟）。删除HYB缓冲区，并添加探头管。轻轻搅动O / N在60℃。
4. 准备组织的抗体。
   1. 温暖HYB缓冲器和2x SSC + 0.1％Tween-20的溶液至60℃。
   2. 更换HYB缓冲探针溶液（保存探头在-20℃下2 - 3倍重用）。在60℃10分钟洗净。
   3. 在60℃在2×SSC-吐温（每个搅拌20分钟）洗涤三次。
   4. 在60℃在0.2×SSC-吐温（每个搅拌20分钟）洗涤三次。
   5. 在生物圈（RT）搅拌15分钟，各水平上摇杆洗两次。
   6. 加入1毫升MAB +块。在摇杆垂直洗2小时。
   7. 转移至1ml MAB +模块包含一个1 / 2,000抗洋地黄毒苷-AP。垂直岩石在4 CO / N。
5. 准备组织的显色剂。
   1. 更换单克隆抗体的解​​决方案;在人与生物圈洗三次，每次5分钟水平上的摇杆。
   2. 人与生物圈1小时，各水平上的摇杆洗三次。
   3. 在AP缓冲液10分钟，各水平上摇臂洗两次。
   4. 转移组织到多个孔塑料托盘，取出AP缓冲液，并添加BM紫试剂（〜1毫升）中。允许反应进行在黑暗5分钟，O / N。
   5. 在适当的时候染色来实现，组织转移到PTW的小瓶。在摇杆的PTW洗两次，每次10分钟。
   6. 修正了布安的4 CO / N在摇杆的解决方案。
   7. 洗出布安的三个70％乙醇/ 30％PTW洗涤在室温。继续牛逼Ø图像采集使用的外部照明，并在显微镜安装摄像头，漂白如有必要^，18。

5.同胞选择和克隆

1. 最高的活动选择池（外胚层组织中最大的响应）。
2. 滴定（的LB稀释至合适的密度）的甘油原液用于与活性最高的池和积垢10的新板用大约十分之一从（使用协议部2的上方）上一步骤的菌落。
3. 减少池大小，直到活动被追踪到单一的殖民地。
4. 使用标准的引物中的载体得到的DNA序列。

Results

响应于mRNA的注入卵母细胞，响应动物帽组织表达测定为OTX2的表达通过原位杂交（ 图2和表1）; OTX2通过透镜placode表达在推定透镜外胚层（PLE）从神经管闭合增厚^19。然而，由于OTX2也表达于前神经外胚层以及PLE外非神经外胚层头，它与这两个神经和placodal应答有关。使用foxe3筛选文库为能够产生在透镜感受态动物帽外胚层透镜感应响应允许一个更具体的方法来表达克隆的目标基因产物，因为foxe3从神经板中表达的PLE阶段和整个镜头囊泡形成^20，目前在相邻的placodal地区但从neuroectoder缺席米使用表达克隆和同胞选择协议之上和注入库转录的池，能够产生foxe3表达在动物帽的基因分离出来（ 表2）。继克隆的分离，采用卵母细胞注射库笔录179额外的动物帽检测中筛选出的foxe3表达; 50为...

Discussion

此处描述的基因能够诱导在主管外胚层的响应的功能性克隆的方法可以用于鉴定范围广泛的基因产物。该方法通过将组织诱导试验用表达克隆技术扩展了过去的工作。我们利用爪蟾卵母细胞的代谢途径如生产诱发因素，直接或间接地，以下的RNA注射的来源。此，在与使用已建立的方法进行克隆目的^6,7-使用从cDNA文库或其他集合克隆的产生转录物表达的基因组合，提供了一个有价值的方法为那些寻求鉴定参与胚胎新兴趣的基因感应。此方法的新基因功能鉴定的广泛适用性是一个有益的补充激动人心的新的反向遗传方法，并且也可用于在功能上使用高苏氨酸鉴定测试转录oughput方法（如核糖核酸^-SEQ）21。

控制是在监测在盖测定中使用的卵母细胞的代谢功能的关键。既要保证每一批卵母细胞，并建立该系统能够检测低丰度转录的有用的健康，改变中胚层诱导INHBB测试的mRNA的浓度;这种基因是无 ​​关的透镜诱导途径和是证据充分的独立控制^14。肌肉诱导活性，通过在动物帽外胚层与一百零一分之一十二抗体肌肉特异性抗原的表达测定，观察到与2 - ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
12/101 抗体	开发研究 杂交瘤库	12/101	用于检测肌肉组织的单克隆抗体
ISH	20x SSC 缓冲液	用于	S6639
的抗 Dig-AP
	的 Sigma	A6404
金质粒小量试剂盒	Bio-Rad	732-6400	质粒 DNA 纯化
封闭试剂	用于	ISH
BM 的	Roche	ISH	Roche 11442074001
	Scientific	13-245-121	ISH
Bouin 的解决方案	Sigma	HT10132
OCM	的 Sigma		A9647
CHAPS	Sigma	C3023	用于 ISH
胶原酶 A	氏	10103578001	卵母细胞的去follication
半胱氨酸	Sigma	C121800	Dejelly 胚胎
DEPC-H2O	Fisher Scientific	BP5611	用于 ISH
Dig-RNA 标记混合物	罗氏	11277073910	用于 ISH 探针
Dumont #5 镊子	World Precision Instruments	500233	用于卵黄碱包膜去除
3-氨基苯甲酸乙酯	Sigma	A5040	MS222 麻醉剂
Ficoll PM 400	Sigma	F4375	用于注射剂
甲酰胺	Sigma	F9037	用于 ISH
硫酸庆大霉素	Sigma	G1914	用于 OCM
玻璃毛细管	World Precision Instruments	4878	3.5 英寸长，内径，0.530 毫米
玻璃样品瓶	Fisher Scientific	06-408B	用于 ISH
发环			固定在巴斯德吸管中的头发用于组织作
肝素钠盐	Sigma	H4784	用于
ISH 注射器 Nanoliter 2010	World Precision Instruments	Nanoliter 2010	微处理器控制的显微注射器
Instant Ocean	卡罗来纳	972433	水族馆盐用于青蛙回收
IRBG XGC 非洲爪蟾验证的全长凸轮 cDNA	来源 生物科学	989_IRBG	cDNA文库
LB 琼脂板，含 100 µg/ml 氨苄青霉素	Teknova	L5004	150 mm 预倒 LB-Amp 板，用于同胞选择
LB Luria 肉汤	Teknova	L8650	LB，用于从板中收集同源分列选择的菌落和稀释培养物
磁性 mRNA 分离试剂盒	New England BioLabs	S1550S	用于分离富含聚 A 的 RNA
马来酸	Sigma	M0375	用于 ISH
手动 Microfil 显微作器	World Precision Instruments	M3310R	手动显微作器
章动混合器	Fisher Scientific	22-363-152	用于 ISH
Permoplast	Nasco	SB33495M	用于注射和解剖皿的摇杆
盐缓冲盐水	Sigma	P5368	用于 ISH
PMSG	Sigma	G4877	刺激卵母细胞发育
聚乙烯吡咯烷酮	Sigma	PVP40	用于 ISH
可编程拉拔器	World Precision Instruments	PUL-1000	微量移液器针头拔出器
蛋白酶 K	Sigma	P6556	用于 ISH
pTnT 载体	Promega	L5610	cDNA 文库构建
核糖探针组合系统	Promega	P1450	体外转录
上标全长 cDNA 文库构建试剂盒	cDNA 文库构建的	Life Technologies	18248013
缝合线，3-0 丝	Fisher Scientific	19-037-516	用于卵母细胞取出后的缝合线和针
用于 ISH 的圆环 RNA	Sigma	R3629
ISH
的三乙醇胺 Sigma T1502用于		ISH	P9416
	cDNA 文库构建的	Promega	C4360
非洲爪蟾全 ORF 入门克隆 - ORFeome 合作	来源 Bioscience	5055_XenORFeome	ORFeome 克隆
XL2-Blue 超感受态细胞	Agilent Technologies	200150	细胞，用于转化 cDNA图书馆