功能性克隆使用爪卵母细胞表达系统

Summary

我们描述了一种非洲爪蟾卵母细胞和动物帽系统，用于表达克隆能够在感受态外胚层中诱导反应的基因，并讨论了此类基因的后续分析技术。该系统可用于多种基因产物的功能鉴定。

Abstract

鉴定负责胚胎诱导的基因带来了许多挑战;仅举几例，分泌的目标分子可能丰度较低，可能没有分泌但与信号细胞相连，或者可能需要结合伴侣或上游调节分子的存在。因此，在寻找能够在感受态外胚层中引发早期晶状体诱导反应的基因产物时，我们利用了一种表达克隆系统，该系统可以识别旁分泌或近分泌因子以及转录或其他调节蛋白。将 mRNA 池注射到非洲爪蟾卵母细胞中，并将响应组织直接置于卵母细胞上并共培养。根据 ldb1 在晶状体感受态动物帽外胚层中引发早期晶状体平板标记物 foxe3 表达的能力，从神经板期 cDNA 文库中对 ldb1 进行功能克隆后，我们表征了 mRNA 表达模式，并分析了 ldb1 过表达或敲低后的发育进展.该系统适用于使用感受态组织中的功能反应来鉴定诱导剂或其上游调节分子的非常广泛的环境。

Introduction

通过功能或功能丧失来识别目标基因的正向遗传方法^1,2 是理解发育中复杂模式事件不可或缺的一部分。 再加上越来越多的系统和研究人员^3-5 可用的强大反向遗传技术，现在可以识别在通路中具有关键功能作用的基因，然后在细胞水平上阐明该功能以及与其他基因产物的相互作用。 表达克隆是一种功能鉴定目的基因的方法是表达克隆^6,7，过去已经产生了许多关键发现。

我们最近的目标⁸ 是确定早期晶状体诱导因素，因为已经证明脊椎动物晶状体诱导过程的初始步骤早在原肠阶段就发生了。 为此，我们使用非洲爪蟾胚胎的瞬时晶状体能力⁹ 动物帽外胚层（11-11.5¹⁰ 期）作为诱导的反应组织，并使用 VI 期非洲爪蟾卵母细胞作为诱导因子的产生来源。

以下方案建立在 Smith 和 Harland^6,7 的表达克隆和 sib 选择方案的基础上，也被其他人^11-13 成功使用。 在我们的卵母细胞表达系统（Lustig 和 Kirschner¹⁴ 首次用于生产诱导因子）中，选择并鉴定能够直接或间接导致卵母细胞产生在动物帽外胚层中引发晶状体诱导反应的因子的注射转录物库。 由于该系统可用于直接表达分泌的诱导分子（卵母细胞注射的 I....

Protocol

所有的实验程序都经弗吉尼亚机构动物护理和使用委员会的大学。

注意: 图1示出的实验步骤的示意图。

1.准备卵母细胞

1. 前总理X.蟾女性，150ü孕马血清促性腺激素（PMSG）大约提前一个星期的卵母细胞隔离。注射1毫升150单位/毫升PMSG到背部淋巴囊有1毫升无菌注射器用29克针。
2. 准备注入卵母细胞和卵母细胞动物帽检测解决方案。
   1. 制备的Ca ^{++ / Mg} ++的-free OR2（OR2-）:82 mM氯化钠，2.5mM的氯化钾，1.5mM的钠_{2 HPO 4，50mM}的HEPES pH7.2的。
   2. 准备OR 2:OR2-加1毫米氯化钙₂和1毫米氯化镁_2。
   3. 制备OCM:60％的Leibovitz L15，0.4毫克/毫升BSA，100μg/ ml的庆大霉素，pH值7.8。
   4. 预削1×MBS:88 mM氯化钠，1mM的氯化钾，0.7毫米氯化钙_2，1mM的_MgSO 4干燥，5mM的HEPES（pH值7.8），2.5毫_{碳酸氢钠。}

Results

响应于mRNA的注入卵母细胞，响应动物帽组织表达测定为OTX2的表达通过原位杂交（ 图2和表1）; OTX2通过透镜placode表达在推定透镜外胚层（PLE）从神经管闭合增厚^19。然而，由于OTX2也表达于前神经外胚层以及PLE外非神经外胚层头，它与这两个神经和placodal应答有关。使用foxe3筛选文库为能够产生在透镜感受态动物帽外胚层透镜感应响应允许一个更具体的方法来表达克隆的目标基因产物，因为foxe3从神经板中表达的PLE阶段和整个镜头囊泡形成^20，目前在相邻的placodal地区但从neuroectoder缺席米使用表达克隆和同胞选择协议之上和注入库转录的池，能够产生foxe3表达在动物帽的基因分离出来（ 表2）。继克隆的分离，采用卵母细胞注射库笔录179额外的动物帽检测中筛选出的foxe3表达; 50为.......

Discussion

此处描述的基因能够诱导在主管外胚层的响应的功能性克隆的方法可以用于鉴定范围广泛的基因产物。该方法通过将组织诱导试验用表达克隆技术扩展了过去的工作。我们利用爪蟾卵母细胞的代谢途径如生产诱发因素，直接或间接地，以下的RNA注射的来源。此，在与使用已建立的方法进行克隆目的^6,7-使用从cDNA文库或其他集合克隆的产生转录物表达的基因组合，提供了一个有价值的方法为那些寻求鉴定参与胚胎新兴趣的基因感应。此方法的新基因功能鉴定的广泛适用性是一个有益的补充激动人心的新的反向遗传方法，并且也可用于在功能上使用高苏氨酸鉴定测试转录oughput方法（如核糖核酸^-SEQ）21。

控制是在监测在盖测定中使用的卵母细胞的代谢功能的关键。既要保证每一批卵母细胞，并建立该系统能够检测低丰度转录的有用的健康，改变中胚层诱导INHBB测试的mRNA的浓度;这种基因是无 ​​关的透镜诱导途径和是证据充分的独立控制^14。肌肉诱导活性，通过在动物帽外胚层与一百零一分之一十二抗体肌肉特异性抗原的表达测定，观察到与2 - .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
12/101 抗体	开发研究 杂交瘤库	12/101	用于检测肌肉组织的单克隆抗体
ISH	20x SSC 缓冲液	用于	S6639
的抗 Dig-AP
	的 Sigma	A6404
金质粒小量试剂盒	Bio-Rad	732-6400	质粒 DNA 纯化
封闭试剂	用于	ISH
BM 的	Roche	ISH	Roche 11442074001
	Scientific	13-245-121	ISH
Bouin 的解决方案	Sigma	HT10132
OCM	的 Sigma		A9647
CHAPS	Sigma	C3023	用于 ISH
胶原酶 A	氏	10103578001	卵母细胞的去follication
半胱氨酸	Sigma	C121800	Dejelly 胚胎
DEPC-H2O	Fisher Scientific	BP5611	用于 ISH
Dig-RNA 标记混合物	罗氏	11277073910	用于 ISH 探针
Dumont #5 镊子	World Precision Instruments	500233	用于卵黄碱包膜去除
3-氨基苯甲酸乙酯	Sigma	A5040	MS222 麻醉剂
Ficoll PM 400	Sigma	F4375	用于注射剂
甲酰胺	Sigma	F9037	用于 ISH
硫酸庆大霉素	Sigma	G1914	用于 OCM
玻璃毛细管	World Precision Instruments	4878	3.5 英寸长，内径，0.530 毫米
玻璃样品瓶	Fisher Scientific	06-408B	用于 ISH
发环			固定在巴斯德吸管中的头发用于组织作
肝素钠盐	Sigma	H4784	用于
ISH 注射器 Nanoliter 2010	World Precision Instruments	Nanoliter 2010	微处理器控制的显微注射器
Instant Ocean	卡罗来纳	972433	水族馆盐用于青蛙回收
IRBG XGC 非洲爪蟾验证的全长凸轮 cDNA	来源 生物科学	989_IRBG	cDNA文库
LB 琼脂板，含 100 µg/ml 氨苄青霉素	Teknova	L5004	150 mm 预倒 LB-Amp 板，用于同胞选择
LB Luria 肉汤	Teknova	L8650	LB，用于从板中收集同源分列选择的菌落和稀释培养物
磁性 mRNA 分离试剂盒	New England BioLabs	S1550S	用于分离富含聚 A 的 RNA
马来酸	Sigma	M0375	用于 ISH
手动 Microfil 显微作器	World Precision Instruments	M3310R	手动显微作器
章动混合器	Fisher Scientific	22-363-152	用于 ISH
Permoplast	Nasco	SB33495M	用于注射和解剖皿的摇杆
盐缓冲盐水	Sigma	P5368	用于 ISH
PMSG	Sigma	G4877	刺激卵母细胞发育
聚乙烯吡咯烷酮	Sigma	PVP40	用于 ISH
可编程拉拔器	World Precision Instruments	PUL-1000	微量移液器针头拔出器
蛋白酶 K	Sigma	P6556	用于 ISH
pTnT 载体	Promega	L5610	cDNA 文库构建
核糖探针组合系统	Promega	P1450	体外转录
上标全长 cDNA 文库构建试剂盒	cDNA 文库构建的	Life Technologies	18248013
缝合线，3-0 丝	Fisher Scientific	19-037-516	用于卵母细胞取出后的缝合线和针
用于 ISH 的圆环 RNA	Sigma	R3629
ISH
的三乙醇胺 Sigma T1502用于		ISH	P9416
	cDNA 文库构建的	Promega	C4360
非洲爪蟾全 ORF 入门克隆 - ORFeome 合作	来源 Bioscience	5055_XenORFeome	ORFeome 克隆
XL2-Blue 超感受态细胞	Agilent Technologies	200150	细胞，用于转化 cDNA图书馆