使用 Xenopus 卵母细胞表达系统进行功能克隆

摘要

我们描述了一种利用Xenopus卵母细胞和动物帽系统进行基因表达克隆的方法，可用于筛选能够诱导有反应能力的外胚层产生应答的基因，并讨论了对这些基因进行后续分析的技术。该系统在多种基因产物的功能鉴定中具有重要应用价值。

摘要

鉴定负责胚胎诱导的基因面临诸多挑战：例如，感兴趣的分泌分子可能丰度较低，或并非真正分泌而是与信号细胞相连，或需要结合伴侣分子或上游调控分子的存在。因此，在寻找能够引发具有诱导能力的外胚层产生早期晶状体诱导反应的基因产物时，我们采用了一种表达克隆系统，该系统可用于鉴定旁分泌或邻近分泌因子，以及转录因子或其他调控蛋白。我们将mRNA混合物注入Xenopus卵母细胞，并将反应组织直接置于卵母细胞上进行共培养。基于从神经板期cDNA文库中克隆出的ldb1能够诱导具有晶状体诱导能力的动物帽外胚层表达早期晶状体原基标志物foxe3的功能，我们进一步表征了ldb1的mRNA表达模式，并检测了其过表达或敲低后对发育进程的影响。该系统适用于多种研究场景，尤其适用于在具有诱导能力的组织中通过功能性反应来鉴定诱导因子或其上游调控分子的研究。

引言

通过基因的功能或功能缺失来鉴定目的基因的正向遗传学方法^1,2，是理解发育过程中复杂图式形成事件的重要组成部分。结合日益广泛适用于各类系统和研究者的强大反向遗传学技术^3-5，目前已有可能识别出在特定通路中具有关键功能作用的基因，并进一步在细胞水平上阐明该基因的功能及其与其他基因产物的相互作用。过去曾用于功能鉴定目的基因并取得诸多关键发现的一种方法是表达克隆^6,7。

我们近期的目标⁸ 旨在鉴定早期晶状体诱导因子，因为已有研究表明，脊椎动物晶状体诱导过程的初始步骤早在原肠胚阶段即已发生。为此，我们采用了短暂具备晶状体诱导能力的⁹ 动物帽外胚层（阶段11-11.5）¹⁰的 非洲爪蟾 胚胎作为诱导反应组织，以及VI期 非洲爪蟾 卵母细胞作为诱导因子的产生来源。

以下实验方案基于 Smith 和 Harland 的表达克隆与姐妹选择方案^6,7，该方案也已被其他研究者成功应用^11-13。在我们的卵母细胞表达系统中（最初由 Lustig 和 Kirschner 用于诱导因子的生产¹⁴），我们筛选并鉴定了那些注射后能够直接或间接促使卵母细胞产生可诱导动物帽外胚层发生晶状体诱导反应的因子的转录本池。由于该系统适....

方案

所有实验程序均经弗吉尼亚大学机构动物护理和使用委员会批准。

注意：图1展示了实验步骤的示意图。

1. 卵母细胞的制备

1. 在卵母细胞分离前约一周，使用 150 U 孕马血清促性腺激素（PMSG）对雌性 X. laevis 进行预促排处理。用带有 29 G 针头的 1 ml 无菌注射器，向背侧淋巴囊注射 1 ml 浓度为 150 U/ml 的 PMSG。
2. 准备用于卵母细胞注射及卵母细胞-动物帽实验的溶液。
   1. 制备无 Ca⁺⁺/Mg⁺⁺ 的 OR2 溶液（OR2-）：82 mM NaCl、2.5 mM KCl、1.5 mM Na₂HPO₄、50 mM HEPES，pH 7.2。
   2. 制备 OR2 溶液：在 OR2- 基础上添加 1 mM CaCl₂ 和 1 mM MgCl₂。
   3. 制备 OCM 溶液：60% Leibovitz L15 培养基、0.4 mg/ml BSA、100 μg/ml 庆大霉素，pH 7.8。
   4. 制备 1x MBS 溶液：88 mM NaCl、1 mM KCl、0.7 mM....

结果

在将mRNA注射到卵母细胞中后，检测反应性动物帽组织中相关基因的表达情况 otx2 由 原位 杂交图2 和 表1); otx2 在神经管闭合至晶状体基板增厚期间，于预定晶状体外胚层（PLE）中表达¹⁹。然而，由于 otx2 也在前部神经外胚层以及位于 PLE 之外的非神经头部外胚层中表达，因此与神经和生基板反应均相关。使用 foxe3 筛选文库以获得能够在晶状体具备感应能力的动物帽外胚层中产生晶状体诱导反应的基因产物，使得表达克隆的目标实现更为特异的方法成为可能，因为 foxe3 从神经板阶段开始，在晶状体板（PLE）中表达，并持续贯穿晶状体泡形成过程²⁰，存在于相邻的 placodal 区域，但在神经外胚层中缺失。利用上述表达克隆和同胞选择方案，并注射文库转录本的混合物，可鉴定出一个能够产生该表型的基因 foxe3 动物帽中的表达被分离（表 2

讨论

本文所述的功能性基因克隆方法可用于筛选能够诱导感受态外胚层产生反应的基因，从而鉴定多种多样的基因产物。该方法在以往研究的基础上进行了拓展，将组织诱导实验与表达克隆技术相结合。我们利用非洲爪蟾（Xenopus）卵母细胞的代谢途径，在RNA注射后直接或间接地产生诱导因子。结合使用已建立的基因克隆方法^6,7——通过cDNA文库或其他克隆集合所生成的转录本进行表达——该策略为致力于发现参与胚胎诱导的新基因的研究者提供了一种有价值的途径。该方法在新基因功能鉴定方面具有广泛的适用性，可作为当前蓬勃发展的反向遗传学方法的有力补充，也可用于对高通量技术（如RNA-seq）²¹所鉴定出的转录本进行功能性验证。

对照组对于监测用于帽状结构检测实验的卵母细胞的代谢功能至关重要。为了确保每批卵母细胞的健康状态，并验证该系统检测低丰度转录本的能力，实验测试了中胚层诱导因子INHBB mRNA 的不同浓度；该基因与晶状体诱导通路无关，是已有充分文献记录的独立对照¹⁴。使用 12/101 抗体检测动物帽外胚层中.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
12/101 抗体	发育研究杂交瘤库	12/101	用于肌肉组织检测的单克隆抗体
20x SSC 缓冲液	Sigma	S6639	用于原位杂交（ISH）
乙酸酐	Sigma	A6404	用于原位杂交（ISH）
Anti-Dig-AP	Roche	11093274910	用于原位杂交（ISH）
Aurum 质粒小量提取试剂盒	Bio-Rad	732-6400	质粒DNA纯化
封闭试剂	Roche	11096176001	用于原位杂交（ISH）
BM Purple	Roche	11442074001	用于原位杂交（ISH）
Boekel 杂交炉	Fisher Scientific	13-245-121	用于原位杂交（ISH）
Bouin's 溶液	Sigma	HT10132	用于原位杂交（ISH）
BSA	Sigma	A9647	用于OCM
CHAPS	Sigma	C3023	用于原位杂交（ISH）
胶原酶A	Roche	10103578001	卵母细胞去滤泡
半胱氨酸	Sigma	C121800	去除胚胎胶膜
DEPC-H2O	Fisher Scientific	BP5611	用于原位杂交（ISH）
Dig-RNA 标记混合物	Roche	11277073910	用于原位杂交探针
Dumont #5 镊子	World Precision Instruments	500233	用于去除卵黄膜
乙基-3-氨基苯甲酸酯	Sigma	A5040	MS222 麻醉剂
Ficoll PM 400	Sigma	F4375	用于注射介质
甲酰胺	Sigma	F9037	用于原位杂交（ISH）
硫酸庆大霉素	Sigma	G1914	用于OCM
玻璃毛细管	World Precision Instruments	4878	长3.5"，内径0.530 mm
玻璃样品瓶	Fisher Scientific	06-408B	用于原位杂交（ISH）
毛发环			固定在巴斯德移液管上的毛发，用于组织操作
肝素钠盐	Sigma	H4784	用于原位杂交（ISH）
纳升注射器 2010	World Precision Instruments	Nanoliter 2010	微处理器控制的微量注射器
Instant Ocean	Carolina	972433	蛙类恢复用的水族馆盐
IRBG XGC Xenopus 验证全长 cam cDNA	Source Bioscience	989_IRBG	cDNA文库
含100 µg/ml 氨苄青霉素的LB琼脂平板	Teknova	L5004	150 mm 预制LB-Amp平板，用于同胞筛选
LB 营养肉汤	Teknova	L8650	用于从平板上收集菌落及培养物稀释的LB培养基
磁性mRNA分离试剂盒	New England BioLabs	S1550S	用于分离富含poly(A)的RNA
马来酸	Sigma	M0375	用于原位杂交（ISH）
手动Microfil显微操作器	World Precision Instruments	M3310R	手动显微操作器
旋转混合仪	Fisher Scientific	22-363-152	用于原位杂交的摇床
Permoplast	Nasco	SB33495M	用于注射和解剖皿的黏土
磷酸盐缓冲液	Sigma	P5368	用于原位杂交（ISH）
PMSG	Sigma	G4877	用于刺激卵母细胞发育
聚乙烯吡咯烷酮	Sigma	PVP40	用于原位杂交（ISH）
程序化拉针仪	World Precision Instruments	PUL-1000	微移液管针头拉制仪
蛋白酶K	Sigma	P6556	用于原位杂交（ISH）
pTnT 载体	Promega	L5610	cDNA文库构建
核糖探针组合系统	Promega	P1450	体外转录
Superscript 全长cDNA文库构建试剂盒	Life Technologies	18248013	cDNA文库构建试剂盒
缝合线，3-0 丝线	Fisher Scientific	19-037-516	卵母细胞取出后使用的缝合线和缝合针
酵母RNA	Sigma	R3629	用于原位杂交（ISH）
三乙醇胺	Sigma	T1502	用于原位杂交（ISH）
Tween 20	Sigma	P9416	用于原位杂交（ISH）
通用RiboClone cDNA合成系统	Promega	C4360	cDNA文库构建的替代试剂盒
Xenopus 全长ORF入门克隆 - ORFeome协作项目	Source Bioscience	5055_XenORFeome	ORFeome克隆
XL2-Blue 超感受态细胞	Agilent Technologies	200150	用于cDNA文库转化的细胞