放射性标记及通过高效液相色谱-流式闪烁法定量细胞内磷脂酰肌醇磷酸酯水平

摘要

磷脂酰肌醇是一类信号脂质，其相对丰度会因各种刺激而迅速发生变化。本文介绍了一种通过代谢标记法使用³H-myo-肌醇标记细胞，随后进行提取和去酰化，以测定磷脂酰肌醇丰度的方法。提取的甘油-肌醇脂质随后通过高效液相色谱分离，并通过流动闪烁法进行定量。

摘要

磷脂酰肌醇（PtdInsPs）是一类重要的信号脂质，能够招募特定的效应分子，并赋予细胞器分子特异性和功能。七种不同的PtdInsPs在分布和丰度上各不相同，其水平由特定的激酶和磷酸酶严格调控。PtdInsPs的含量可在多种信号事件发生或调控机制受到干扰时迅速发生变化。为了理解这些事件如何引起PtdInsPs含量的变化及其后续影响，量化信号事件前后或正常与异常条件之间PtdInsPs的水平显得尤为重要。然而，由于PtdInsPs含量极低且结构相似，准确测定每种PtdInsPs的相对含量具有挑战性。本文介绍了一种通过代谢标记法量化PtdInsPs水平的方法：利用³H-myo-肌醇对细胞进行标记，该同位素可被整合入PtdInsPs中。随后沉淀磷脂并进行去酰化处理，生成可溶性的³H-甘油-肌醇衍生物，进一步提取后通过高效液相色谱法（HPLC）分离，并利用流动闪烁检测法进行检测。文中详细描述了酵母样品的标记与处理流程，以及HPLC和流动闪烁检测仪的仪器设置。尽管该方法会丢失有关酰基链组成的信息，但其灵敏度高，且可优化以同时定量细胞中全部七种PtdInsPs。

引言

磷脂酰肌醇磷酸盐（PtdInsPs）是一类重要的信号传导磷脂，可调控多种细胞功能，包括信号转导、膜运输和基因表达，从而进一步调节细胞分裂、细胞器特性及代谢活性等高级细胞行为^1-3。PtdInsPs共有七种，均由母体磷脂磷脂酰肌醇（PtdIns）的肌醇头部基团在3、4和/或5位点发生磷酸化而生成。重要的是，这七种PtdInsPs在细胞内的分布并不均匀，每种PtdInsP的局部浓度可在特定亚细胞位点动态升高或降低，并与一组特定的效应蛋白结合，共同决定其所在膜结构的身份与功能^3,4。此外，每种PtdInsP的水平必须受到严格调控，因为其浓度变化会显著影响PtdInsP所产生的信号强度。每种PtdInsP的定位和水平取决于多种脂质激酶、磷酸酶和磷脂酶的靶向定位与活性，这些酶共同介导了各PtdInsP的合成与降解^3,4。因此，PtdInsP调控机制的失调可能干扰细胞正常功能，导致癌症和退行性疾病等疾病的发生^2,5,6。为了全面理解PtdInsPs及其调控机制的功能与作用，研究人员已开发出基于显微镜和生物化学的技术，用于追踪和定量检测PtdInsPs。

在许多情况下，磷脂酰肌醇磷酸盐（PtdInsPs）通过特定的蛋白质结构域与其效应蛋白结合^7-9。这些蛋白质模块在与完整蛋白质分离表达时，通常仍能保持其正确的折叠构象和脂质识别特性。这一特性促使研究人员将特定的PtdInsP结合蛋白....

方案

注意：以下内容详细描述了一种在酵母中测定磷脂酰肌醇磷酸（PtdInsPs）的方法。该方法提供了用³H-myo-肌醇标记酵母细胞、提取并去酰化脂质，以及通过高效液相色谱（HPLC）洗脱程序分离和定量去酰化PtdInsPs的实验细节。请注意，在哺乳动物细胞中对PtdInsPs进行标记、去酰化、分离和定量需要优化条件，并采用更长的HPLC洗脱梯度。这些细节可参见其他文献，尽管我们将在讨论部分简要介绍其中一些方面。总体而言，本文给出了从酵母中提取脂质、去酰化并提取水溶性甘油肌醇磷酸（Gro-InsPs）的方法，并在图1中进行了图示说明。

1. 酵母中PtdInsPs的标记与分析方案

1. 细胞培养与放射性标记
   1. 在完全合成培养基中，于30 °C恒定振荡条件下培养20 ml酵母菌株SEY6210的液体培养物，至对数中期，即在600 nm处的光密度（OD₆₀₀）约为0.6–0.7。
      注意：请勿使用YPD培养基，因其可能影响³H-myo-肌醇的掺入。此培养体积应足以支持2–3次HPLC运行。
   2. 通过在12 ml圆底管中以800 × g离心5分钟，收集总计10–14 OD的酵母细胞（注意：1 ml OD₆₀₀ = 1的培养液约含....

结果

采用该方法，利用³H-myo-肌醇对酵母磷脂酰肌醇磷酸酯（PtdInsPs）进行代谢标记。标记完成后，用高氯酸沉淀磷酸脂，随后进行磷酸脂去酰基化，并提取水溶性的甘油肌醇磷酸酯（Gro-InsPs）（图1）。在此阶段，必须通过液体闪烁计数对提取出的Gro-InsPs所携带的总放射性信号进行定量，以确保极低丰度的PtdInsPs（如PtdIns(3,5)P₂）具有足够的信噪比；总放射性计数应为500万至1000万CPM，方可进样。由于酵母细胞中仅存在四种PtdInsPs，因此采用1小时洗脱法即可实现有效分离（图2）。

本研究中标记并处理了野生型、atg18Δ 和 vac14Δ 酵母突变体，以分析 PtdIns(3,5)P₂ 的变化情况，后者是酵母中含量最少的磷脂酰肌醇磷酸.......

讨论

本文详细介绍了利用高效液相色谱-流动闪烁计数法测定酵母细胞中磷脂酰肌醇多磷酸（PtdInsPs）水平的实验方案。该方法通过用³H-myo-肌醇对PtdInsPs进行代谢标记，随后进行脂质处理，提取水溶性的³H-甘油肌醇磷酸（Gro-InsPs），再经高效液相色谱（HPLC）分离和分析。利用该方法可定量测定不同条件下细胞中PtdInsPs的相对水平，文中以野生型、vac14D和atg18D酵母细胞中PtdIns(3,5)P₂的检测为例进行了展示（图4）。

为优化结果和/或进行故障排除，可采取若干关键步骤和改进措施。实现PtdInsPs可靠定量的最重要参数之一是总放射性信号水平。通常，向高效液相色谱（HPLC）中注入300万至500万计数通常足以可靠地定量较高丰度的PtdInsP种类，例如PtdIns(4,5)P₂。然而，对于较低丰度的种类如PtdIns(3,5)P₂的定量，可能需要注入高达.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1-丁醇	Biobasic	BC1800	试剂级
磷酸氢二铵	Bioshop	APD001	ACS级
硫酸铵	Biobasic	ADB0060	超纯级
自动进样器	Agilent	G1329B	Agilent 1260 infinity系列
生物素	Sigma	B4501
硼酸	Biobasic	BB0044	分子生物学级
氯化钙	Biobasic	CT1330	无水，工业级
泛酸钙	Sigma	C8731
硫酸铜(II)	Sigma	451657	无水
D-葡萄糖	Biobasic	GB0219	无水，生物技术级
杜尔贝科改良伊格尔培养基	Life	11995-065	含4.5 g/L葡萄糖、110 mg/L丙酮酸钠、L-谷氨酰胺
杜尔贝科改良伊格尔培养基	MP biomedicals	0916429	含4.5 g/L葡萄糖，不含L-谷氨酰胺，不含肌醇
EDTA	Biobasic	EB0107	无酸，超纯级
乙醚	Caledon labs	1/10/4700	无水，试剂级
甲酸乙酯	Sigma	112682	试剂级
胎牛血清	Wisent	080-450	美国来源，优质，热灭活
透析胎牛血清	Life	26400044	美国来源
FlowLogic U	LabLogic Systems Ltd	SG-BXX-05	用于流式闪烁计数的闪烁液
叶酸	Biobasic	FB0466	USP级
HEPES缓冲液	Life	15630080	1 M溶液
肌醇, Myo-[2-3H(N)]	Perkin Elmer	NET114005MC	乙醇与水比例为9:1
胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺	Life	51500056	100倍浓缩液
氯化铁(III)	Sigma	157740	试剂级
Laura - 色谱数据采集与分析软件	LabLogic Systems Ltd	版本 4.2.1.18	流式闪烁计数软件
L-谷氨酰胺	Sigma	G7513	200 mM溶液，经无菌过滤，BioXtra，适用于细胞培养
氯化镁	Sigma	M8266	无水
硫酸锰	Biobasic	MB0334	一水合物，ACS级
甲醇	Caledon labs	6701-7-40	HPLC级
甲胺溶液	Sigma	426466	40% (v/v)
磷酸二氢钾	Biobasic	PB0445	无水，ACS级
烟酸	Biobasic	NB0660	试剂级
OpenLAB CSD ChemStation	Agilent	版本 C.01.03	HPLC软件
对氨基苯甲酸 (PABA)	Bioshop	PAB001.100	游离酸
青霉素-链霉素	Sigma	P4333	100倍浓缩液，液体，稳定化处理，经无菌过滤，细胞培养测试合格
高氯酸	Sigma	244252	ACS试剂，70%
PhenoSpher SAX色谱柱	Phenomenex	00G-315-E0	5 µm, 80 Å, 250 x 4.6 mm
磷酸	Caledon labs	1/29/8425	试剂级
氯化钾	Biobasic	PB0440	ACS级
碘化钾	Biobasic	PB0443	ACS级
盐酸吡哆辛	Sigma	P9755
四元泵	Agilent	G1311C	Agilent 1260 infinity系列
核黄素	Bioshop	RIB333.100	USP级
氯化钠	Biobasic	DB0483	生物技术级
钼酸钠	Sigma	243655
温控柱温箱	Agilent	G1316A	Agilent 1260 infinity系列
盐酸硫胺素	Sigma	T4625	试剂级；配制成0.02% (w/v)溶液，形成悬浮液，混合后分装并冷冻
Ultima Gold	Perkin Elmer	6013321	用于液体闪烁计数的闪烁液
硫酸锌	Biobasic	ZB2906	七水合物，试剂级
β-RAM 4	IN/US systems	型号 4	流式闪烁计数器 - 500 µl流通池；可选Perkin Elmer的Radiomatic流式闪烁分析仪