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方法文章

放射性标记及通过高效液相色谱-流式闪烁法定量细胞内磷脂酰肌醇磷酸酯水平

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DOI：

10.3791/53529

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2016年1月6日

 ,  , 
1Department of Chemistry and Biology, Program in Molecular Science, Ryerson University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

磷脂酰肌醇是一类信号脂质，其相对丰度会因各种刺激而迅速发生变化。本文介绍了一种通过代谢标记法使用3H-myo-肌醇标记细胞，随后进行提取和去酰化，以测定磷脂酰肌醇丰度的方法。提取的甘油-肌醇脂质随后通过高效液相色谱分离，并通过流动闪烁法进行定量。

摘要

磷脂酰肌醇（PtdInsPs）是一类重要的信号脂质，能够招募特定的效应分子，并赋予细胞器分子特异性和功能。七种不同的PtdInsPs在分布和丰度上各不相同，其水平由特定的激酶和磷酸酶严格调控。PtdInsPs的含量可在多种信号事件发生或调控机制受到干扰时迅速发生变化。为了理解这些事件如何引起PtdInsPs含量的变化及其后续影响，量化信号事件前后或正常与异常条件之间PtdInsPs的水平显得尤为重要。然而，由于PtdInsPs含量极低且结构相似，准确测定每种PtdInsPs的相对含量具有挑战性。本文介绍了一种通过代谢标记法量化PtdInsPs水平的方法：利用3H-myo-肌醇对细胞进行标记，该同位素可被整合入PtdInsPs中。随后沉淀磷脂并进行去酰化处理，生成可溶性的3H-甘油-肌醇衍生物，进一步提取后通过高效液相色谱法（HPLC）分离，并利用流动闪烁检测法进行检测。文中详细描述了酵母样品的标记与处理流程，以及HPLC和流动闪烁检测仪的仪器设置。尽管该方法会丢失有关酰基链组成的信息，但其灵敏度高，且可优化以同时定量细胞中全部七种PtdInsPs。

引言

磷脂酰肌醇磷酸盐（PtdInsPs）是一类重要的信号传导磷脂，可调控多种细胞功能，包括信号转导、膜运输和基因表达，从而进一步调节细胞分裂、细胞器特性及代谢活性等高级细胞行为1-3。PtdInsPs共有七种，均由母体磷脂磷脂酰肌醇（PtdIns）的肌醇头部基团在3、4和/或5位点发生磷酸化而生成。重要的是，这七种PtdInsPs在细胞内的分布并不均匀，每种PtdInsP的局部浓度可在特定亚细胞位点动态升高或降低，并与一组特定的效应蛋白结合，共同决定其所在膜结构的身份与功能3,4。此外，每种PtdInsP的水平必须受到严格调控，因为其浓度变化会显著影响PtdInsP所产生的信号强度。每种PtdInsP的定位和水平取决于多种脂质激酶、磷酸酶和磷脂酶的靶向定位与活性，这些酶共同介导了各PtdInsP的合成与降解3,4。因此，PtdInsP调控机制的失调可能干扰细胞正常功能，导致癌症和退行性疾病等疾病的发生2,5,6。为了全面理解PtdInsPs及其调控机制的功能与作用，研究人员已开发出基于显微镜和生物化学的技术，用于追踪和定量检测PtdInsPs。

在许多情况下，磷脂酰肌醇磷酸盐（PtdInsPs）通过特定的蛋白质结构域与其效应蛋白结合7-9。这些蛋白质模块在与完整蛋白质分离表达时，通常仍能保持其正确的折叠构象和脂质识别特性。这一特性促使研究人员将特定的PtdInsP结合蛋白结构域与荧光蛋白（FP）（如绿色荧光蛋白GFP）融合，从而构建出用于显微镜下亚细胞定位检测PtdInsPs的探针。事实上，已有大量研究利用FP融合的PtdInsP结合蛋白模块，通过活细胞成像技术来鉴定特定PtdInsP分子的定位与动态变化1,10。例如，磷脂酶C δ1（PLCδ1）的Pleckstrin同源（PH）结构域与GFP融合后，可特异性识别质膜上的磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸[PtdIns(4,5)P2]；而早期核内体抗原1（EEA1）FYVE结构域的串联重复拷贝则被用于追踪核内体上的磷脂酰肌醇-3-磷酸（PtdIns3P）10-13。总体而言，基于显微镜的技术在可视化PtdInsP的定位和动态方面具有显著优势，但也存在若干局限性，例如PtdInsP结合结构域可能除了目标PtdInsP分子外还与其他因子相互作用，且无法检测FP探针胞质荧光背景以下的信号变化。

薄层色谱、质谱分析和放射性同位素标记等生化技术也可用于表征和定量各种磷脂酰肌醇磷酸（PtdInsP14-16）的水平。这些方法需要先分离脂质，以检测细胞内PtdInsPs的含量。质谱分析可用于分析脂质提取物中的磷脂，并在确定PtdInsPs酰基链组成方面具有重要价值14,17。然而，质谱分析主要是半定量的，且仍难以分辨并同时定量分子量相同的PtdInsP种类14,17。相比之下，对PtdInsPs进行放射性同位素标记，随后结合高效液相色谱（HPLC）与流动闪烁检测的方法，可用于同时分离和定量全部七种PtdInsPs物种18。使用强阴离子交换（SAX）柱的HPLC可根据分子量、电荷和分子形状实现分离，从而能够对即使具有相同分子量和电荷的去酰基PtdInsPs（Gro-InsPs）进行分馏。将HPLC洗脱液与流动闪烁探测器联用后，可为每种Gro-InsPs物种生成基于放射性的信号峰，其相对于原始的甘油-肌醇（Gro-Ins）前体分子18。这最终对应于细胞中PtdInsPs的相对含量。

PtdInsPs 的放射性标记以及与高效液相色谱联用的流式闪烁检测是一种有效的工具，可用于研究磷脂酰肌醇 3,5-二磷酸 [PtdIns(3,5)P2] 的调控机制与生物学功能，该分子仅占全部磷脂酰肌醇约 0.1–0.3%16,19,20。PtdIns(3,5)P2 的合成由一种磷脂酰肌醇 3-磷酸 5-激酶催化，在酵母中称为 Fab1，在哺乳动物中称为 PIKfyve21。该反应可被一种 PtdIns(3,5)P2 5-磷酸酶所拮抗，在酵母中称为 Fig4，在哺乳动物中称为 mFig4/Sac322–24。有趣的是，PIKfyve/Fab1 和 mFig4/Fig4/Sac3 均存在于同一复合物中，并由支架适配蛋白 Vac14（酵母）或 mVac14/ArPIKfyve（哺乳动物）进行调控25,26。在缺失VAC14的酵母细胞中，Fab1 无法有效发挥作用，导致 PtdIns(3,5)P2 水平下降约 90%27,28。另一方面，Atg18 是一种 PtdIns(3,5)P2 的效应蛋白，可能参与调控液泡分裂29。Atg18 同时也是 PtdIns(3,5)P2 的负调控因子，因为敲除其基因ATG18会导致 PtdIns(3,5)P2 水平升高 10 至 20 倍29,30。总体而言，PtdIns(3,5)P2 水平的变化会严重影响酵母液泡和哺乳动物溶酶体的功能，从而影响膜运输、吞噬体成熟、自噬以及离子转运等生物学过程6,19,21,31。

本文描述了在酵母中使用3H-myo-肌醇对磷脂酰肌醇磷酸（PtdInsPs）进行放射性同位素标记的过程，以检测野生型、vac14Δ 和atg18Δ酵母菌株中PtdIns(3,5)P2的相对水平。以此为例，展示了高效液相色谱（HPLC）分离不同PtdInsPs组分的分辨能力，以及流动闪烁检测法对痕量3H-myo-肌醇检测的灵敏度。我们还详细阐述了如何优化从哺乳动物细胞中提取和分离3H标记的PtdInsPs的方法，因为这些细胞含有全部七种PtdInsPs分子，其样品通常更为复杂。

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方案

注意：以下内容详细描述了一种在酵母中测定磷脂酰肌醇磷酸（PtdInsPs）的方法。该方法提供了用3H-myo-肌醇标记酵母细胞、提取并去酰化脂质，以及通过高效液相色谱（HPLC）洗脱程序分离和定量去酰化PtdInsPs的实验细节。请注意，在哺乳动物细胞中对PtdInsPs进行标记、去酰化、分离和定量需要优化条件，并采用更长的HPLC洗脱梯度。这些细节可参见其他文献，尽管我们将在讨论部分简要介绍其中一些方面。总体而言，本文给出了从酵母中提取脂质、去酰化并提取水溶性甘油肌醇磷酸（Gro-InsPs）的方法，并在图1中进行了图示说明。

1. 酵母中PtdInsPs的标记与分析方案

  1. 细胞培养与放射性标记
    1. 在完全合成培养基中，于30 °C恒定振荡条件下培养20 ml酵母菌株SEY6210的液体培养物，至对数中期，即在600 nm处的光密度（OD600）约为0.6–0.7。
      注意：请勿使用YPD培养基，因其可能影响3H-myo-肌醇的掺入。此培养体积应足以支持2–3次HPLC运行。
    2. 通过在12 ml圆底管中以800 × g离心5分钟，收集总计10–14 OD的酵母细胞（注意：1 ml OD600 = 1的培养液约含~1×107个细胞）。用2 ml无肌醇培养基（IFM）重悬沉淀（IFM成分见表1）。
    3. 重复离心并吸除培养基。用440 µl IFM重悬沉淀，并在室温 孵育15分钟。
    4. 向每个样品中加入60 µl 3H-myo-肌醇（1 µl = 1 µCi），在30 °C培养温度下持续振荡孵育1至3小时。
      注意：3H-myo-肌醇为放射性物质，须经适当培训后方可操作。此外，所有接触含3H材料的耗材均应妥善处理，并标记为放射性废物。
      注意：只要所有待比较菌株均在相同温度下培养，生长温度可根据需要调整。
    5. 将500 µl细胞悬液转移至含有500 µl 9%高氯酸和200 µl酸洗玻璃珠的微量离心管中。颠倒混匀，并在冰上孵育5分钟。
    6. 在最高速度下涡旋震荡10分钟，使用加样枪头将裂解液转移至新的微量离心管中，避免转移玻璃珠。
    7. 在4 °C下以12,000 × g离心10分钟，收集沉淀，并吸除上清液。
    8. 通过水浴超声在1 ml冰冻的100 mM EDTA中重悬沉淀，然后如前再次离心收集沉淀。
  2. 去酰化与提取
    1. 现配5.0 ml去酰化试剂：将2.3 ml甲醇、1.3 ml 40%甲胺、0.55 ml 1-丁醇和0.80 ml水混合，颠倒混匀。
    2. 吸除EDTA溶液，并将沉淀在50 µl水中进行超声处理。
    3. 加入500 µl去酰化试剂，超声混匀，在室温下孵育20分钟。
    4. 在53 °C金属浴中加热脂质50分钟。通过真空离心在3小时或过夜（O/N）内将样品完全干燥。
      1. 确保在真空离心机与真空泵之间安装化学捕集装置，以防止蒸气进入空气。
    5. 通过水浴超声用300 µl水重悬沉淀，在室温下孵育20分钟。通过真空离心干燥样品3小时或过夜（O/N）。重复此步骤一次。
    6. 用450 µl水对沉淀进行超声处理。此为提取过程中的水相。
    7. 现配10 ml提取试剂：加入8.0 ml 1-丁醇、1.6 ml乙醚和0.40 ml甲酸乙酯，颠倒混匀。
    8. 向水相中加入300 µl提取试剂。在最高速度下涡旋震荡5分钟，并以最高速度（18,000 × g）离心2分钟以分离两相。
    9. 收集下层水相至新的微量离心管中，避免接触上层有机相、界面及沉淀。使用新鲜提取试剂对水相再提取两次。
    10. 通过真空离心将收集的水相完全干燥。通过水浴超声将沉淀分散于50 µl水中。
    11. 将每个样品取2 µl加入含4 ml闪烁液的6 ml聚乙烯闪烁瓶中。使用开放窗口的液体闪烁计数法测定各样品的计数（CPM）。
    12. 将样品在-20 °C保存，直至进行HPLC分析。
  3. 通过HPLC分离 3H-甘油-肌醇磷酸酯
    1. 通过瓶顶式0.22 µm真空滤器过滤1 L超纯水制备缓冲液A，随后进行脱气处理。
    2. 通过将1 L水溶液中加入1 M磷酸氢二铵（APS，分子量132.06）并用磷酸调节pH至3.8，制备缓冲液B。使用瓶顶式0.22 µm真空滤器过滤磷酸氢二铵溶液，随后进行脱气处理。
    3. 通过在2 ml小瓶中装配弹簧加载的250 µl小体积插入件组装进样瓶。加入1000万CPM样品，并加水至总体积为55 µl。另准备一个含55 µl水的空白对照瓶。
    4. 使用带有PTFE/硅胶隔垫的螺旋盖密封小瓶（红色面朝向瓶内）。将每个小瓶放入HPLC自动进样盘中，起始为空白对照瓶。
    5. 使用可控制缓冲液流速、缓冲液脱气及样品进样的HPLC系统及其配套软件。使用在线流动闪烁检测器及其配套软件调节闪烁液流速并监测3H衰变信号。
      1. 在HPLC系统中使用尺寸为250 mm × 4.6 mm、填料为5 µm硅胶树脂的SAX液相色谱柱。安装柱保护装置，防止污染物进入色谱柱。
      2. 在流动闪烁检测器中安装适用于3H检测的500 µl流通池。
        注意：分离可使用由Chemstation软件控制的Agilent 1200 infinity系列HPLC系统或其他市售HPLC系统完成。HPLC洗脱液的流动闪烁检测可使用由Laura软件控制的β-RAM流动闪烁检测器或其他市售流动闪烁检测器或兼容软件完成。
    6. 将四元泵初始化为1.0 ml/min流速，使用100%缓冲液A。
    7. 在HPLC上设置平衡程序以控制缓冲液A与B的梯度（称为"程序A平衡"）：1%缓冲液B维持5分钟，1–100% B梯度5分钟，100% B维持5分钟，100–1% B梯度5分钟，1% B维持20分钟。设定压力上限为400 bar，流速1.0 ml/min，运行时间30分钟。
    8. 在HPLC上设置洗脱程序（图2），以控制缓冲液A与B的梯度（称为"程序A"）：1% B维持5分钟，1–20% B梯度40分钟，20–100% B梯度10分钟，100% B维持5分钟，100–1% B梯度20分钟，1% B维持10分钟。设定压力上限为400 bar，流速1.0 ml/min，运行时间90分钟。
    9. 在流动闪烁检测器上设置检测程序（称为"程序A检测"），运行60分钟，闪烁液流速为2.5 ml/min，驻留时间为8.57秒。
    10. 在HPLC上编程自动进样序列，起始为水空白对照，运行"程序A平衡"，随后依次运行各放射性标记样品的"程序A"。准备就绪后启动序列。
    11. 在运行仍处于平衡程序期间，在流动闪烁检测器上创建批次，使用"程序A检测"测量所有样品。每个新样品的进样将触发HPLC启动"程序A"，同时启动流动闪烁检测器执行"程序A检测"。
    12. 所有运行结束后，以1.0 ml/min流速用100%缓冲液A冲洗HPLC系统、色谱柱及流动闪烁检测器30分钟。
  4. 数据分析
    1. 使用Laura软件或任何可量化色谱图谱的软件进行分析。本节所述步骤见图3。
    2. 点击"文件"、"打开"，选择各样品的原始数据文件以打开。
    3. 在"色谱图"标签页中，放大以拉伸各较小峰（约1000计数[y轴]），同时保持时间分辨率。必要时可单独放大每个峰。
    4. 使用"添加ROI"工具标出各峰用于分析。根据洗脱时间识别各峰：亲本Gro-Ins在10分钟，Gro-Ins3P在18分钟，Gro-Ins4P在20分钟，Gro-Ins(3,5)P2在29分钟，Gro-Ins(4,5)P2在32分钟。
    5. 在"区域表格"标签页中，记录各峰的"面积（计数）"。记录各峰的"起始时间（mm:ss）"和"结束时间（mm:ss）"。
    6. 为进行背景扣除，标出与峰相邻且时间跨度相同的区域，从对应峰的计数中减去该区域的计数。
    7. 将各峰面积相对于亲本Gro-Ins进行归一化（表示为"%总PtdIns"）。然后将各实验条件下的各峰相对于对照条件进行归一化（表示为"相对于对照的n倍增加"）。
      注意：各峰也可相对于总计数进行归一化，但由于亲本Gro-Ins远比其他所有PtdInsPs丰富，结果通常相似。
    8. 点击"文件"、"另存为…"，选择"CSV（逗号分隔）"文件格式，导出色谱图数据。在电子表格中绘图并按需呈现结果。

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结果

采用该方法，利用3H-myo-肌醇对酵母磷脂酰肌醇磷酸酯（PtdInsPs）进行代谢标记。标记完成后，用高氯酸沉淀磷酸脂，随后进行磷酸脂去酰基化，并提取水溶性的甘油肌醇磷酸酯（Gro-InsPs）（图1）。在此阶段，必须通过液体闪烁计数对提取出的Gro-InsPs所携带的总放射性信号进行定量，以确保极低丰度的PtdInsPs（如PtdIns(3,5)P2）具有足够的信噪比；总放射性计数应为500万至1000万CPM，方可进样。由于酵母细胞中仅存在四种PtdInsPs，因此采用1小时洗脱法即可实现有效分离（图2）。

本研究中标记并处理了野生型、atg18Δ 和 vac14Δ 酵母突变体，以分析 PtdIns(3,5)P2 的变化情况，后者是酵母中含量最少的磷脂酰肌醇磷酸...

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讨论

本文详细介绍了利用高效液相色谱-流动闪烁计数法测定酵母细胞中磷脂酰肌醇多磷酸（PtdInsPs）水平的实验方案。该方法通过用3H-myo-肌醇对PtdInsPs进行代谢标记，随后进行脂质处理，提取水溶性的3H-甘油肌醇磷酸（Gro-InsPs），再经高效液相色谱（HPLC）分离和分析。利用该方法可定量测定不同条件下细胞中PtdInsPs的相对水平，文中以野生型、vac14D和atg18D酵母细胞中PtdIns(3,5)P2的检测为例进行了展示（图4）。

为优化结果和/或进行故障排除，可采取若干关键步骤和改进措施。实现PtdInsPs可靠定量的最重要参数之一是总放射性信号水平。通常，向高效液相色谱（HPLC）中注入300万至500万计数通常足以可靠地定量较高丰度的PtdInsP种类，例如PtdIns(4,5)P2。然而，对于较低丰度的种类如PtdIns(3,5)P2的定量，可能需要注入高达...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

C.Y.H. 获得了安大略省政府安大略研究生奖学金的资助。本文的研究工作由 R.J.B. 获得加拿大自然科学与工程研究理事会、加拿大研究主席计划以及怀雅逊大学的资助支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1-丁醇BiobasicBC1800试剂级
磷酸氢二铵BioshopAPD001ACS级
硫酸铵BiobasicADB0060超纯级
自动进样器AgilentG1329BAgilent 1260 infinity系列
生物素SigmaB4501
硼酸BiobasicBB0044分子生物学级
氯化钙BiobasicCT1330无水，工业级
泛酸钙SigmaC8731
硫酸铜(II)Sigma451657无水
D-葡萄糖BiobasicGB0219无水，生物技术级
杜尔贝科改良伊格尔培养基Life11995-065含4.5 g/L葡萄糖、110 mg/L丙酮酸钠、L-谷氨酰胺
杜尔贝科改良伊格尔培养基MP biomedicals0916429 含4.5 g/L葡萄糖，不含L-谷氨酰胺，不含肌醇
EDTABiobasicEB0107无酸，超纯级
乙醚Caledon labs1/10/4700无水，试剂级
甲酸乙酯Sigma112682试剂级
胎牛血清Wisent080-450美国来源，优质，热灭活
透析胎牛血清Life26400044美国来源
FlowLogic ULabLogic Systems LtdSG-BXX-05用于流式闪烁计数的闪烁液 
叶酸BiobasicFB0466USP级
HEPES缓冲液Life156300801 M溶液
肌醇, Myo-[2-3H(N)]Perkin ElmerNET114005MC乙醇与水比例为9:1
胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺Life51500056100倍浓缩液
氯化铁(III)Sigma157740试剂级
Laura - 色谱数据采集与分析软件LabLogic Systems Ltd版本 4.2.1.18流式闪烁计数软件
L-谷氨酰胺SigmaG7513200 mM溶液，经无菌过滤，BioXtra，适用于细胞培养
氯化镁SigmaM8266无水
硫酸锰BiobasicMB0334一水合物，ACS级
甲醇Caledon labs6701-7-40HPLC级
甲胺溶液Sigma42646640% (v/v)
磷酸二氢钾BiobasicPB0445无水，ACS级
烟酸BiobasicNB0660试剂级
OpenLAB CSD ChemStation Agilent版本 C.01.03 HPLC软件
对氨基苯甲酸 (PABA)BioshopPAB001.100游离酸
青霉素-链霉素SigmaP4333100倍浓缩液，液体，稳定化处理，经无菌过滤，细胞培养测试合格
高氯酸Sigma244252ACS试剂，70%
PhenoSpher SAX色谱柱Phenomenex00G-315-E05 µm, 80 Å, 250 x 4.6 mm
磷酸Caledon labs1/29/8425试剂级
氯化钾BiobasicPB0440ACS级
碘化钾BiobasicPB0443ACS级
盐酸吡哆辛SigmaP9755
四元泵AgilentG1311CAgilent 1260 infinity系列
核黄素BioshopRIB333.100USP级
氯化钠BiobasicDB0483生物技术级
钼酸钠Sigma243655
温控柱温箱AgilentG1316AAgilent 1260 infinity系列
盐酸硫胺素SigmaT4625试剂级；配制成0.02% (w/v)溶液，形成悬浮液，混合后分装并冷冻
Ultima GoldPerkin Elmer6013321用于液体闪烁计数的闪烁液
硫酸锌BiobasicZB2906七水合物，试剂级
β-RAM 4IN/US systems型号 4流式闪烁计数器 - 500 µl流通池；可选Perkin Elmer的Radiomatic流式闪烁分析仪 

参考文献

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