放射性标记和磷酸肌醇的细胞水平的定量高效液相色谱耦合流动闪烁

磷酸肌醇 （PtdInsPs） 是重要的信号磷脂，有助于调节多种细胞功能，包括信号转导、膜运输和基因表达，然后调节高阶细胞行为，如细胞分裂、细胞器身份和代谢活性^1-3。有 7 种 PtdInsPs 来源于磷脂酰肌醇 （PtdIns） 肌醇头基 （PtdIns） 的 3、4 和/或 5 位的磷酸化。重要的是，这 7 个 PtdInsP 分布不均，每个 PtdInsP 物种的局部浓度可以在特定的亚细胞位点增加或减少，在那里它们与一组不同的蛋白质效应子结合，这共同使每个 PtdInsP 能够控制其宿主膜的身份和功能^3,4。此外，需要严格控制每个 PtdInsP 的水平，因为这会显着影响 PtdInsP 产生的信号强度。每种 PtdInsP 的定位和水平取决于介导每种 PtdInsP 合成和周转的多种脂质激酶、磷酸酶和磷脂酶的靶向和活性^3,4。因此，PtdInsP 调节机制的失调会扰乱细胞功能，导致癌症和退行性疾病等疾病^2,5,6。为了充分了解 PtdInsPs 及其调节机制的作用和功能，已经开发了基于显微镜和基于生化的技术来跟踪和量化 PtdInsPs。

在许多情况下，PtdInsPs 通过特定的蛋白质结构域^7-9 与其蛋白质效应子结合。当与整个蛋白质分开表达时，这些蛋白质模块通常保留其适当的折叠和脂质识别特性。通过将特异性 PtdInsP 结合蛋白结构域与荧光蛋白 （FP） 如绿色荧光蛋白 （GFP） 融合，从而产生 PtdInsP 探针，用于通过显微镜检测 PtdInsPs。事实上，许多研究已经使用 FP 融合的 PtdInsP 结合蛋白模块通过活细胞成像来识别特定 PtdInsP 物种的定位和动力学^1,10。例如，与 GFP 融合的磷脂酶 C δ1 （PLCδ1） 的普列克底物蛋白同源 （PH） 结构域特异性识别质膜上的磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸 [PtdIns（4,5）P₂]，而早期内体抗原 1 （EEA1） 的 FYVE 结构域的串联拷贝已被用于追踪内体^10-13 上的磷脂酰肌醇-3-磷酸 （PtdIns3P）.总体而言，基于显微镜的技术非常适合可视化 PtdInsP 定位和动力学，但有几个注意事项，包括 PtdInsP 结合结构域也可能与目标 PtdInsP 物种以外的其他因子相互作用，并且它们无法检测 FP 探针胞质荧光以下的变化。

生化技术，包括薄层色谱、质谱和放射性同位素标记，也可用于表征和量化每种 PtdInsP^14-16 的水平。这些方法需要分离脂质以检测 PtdInsPs 的细胞水平。质谱法可用于表征脂质提取物中的磷脂，对于确定 PtdInsPs 的酰基链组成^14,17 非常有价值。然而，质谱法大多是半定量的，仍然难以分辨和同时定量相同分子量的 PtdInsP 物质^14,17。相比之下，PtdInsPs 的放射性同位素标记后进行高效液相色谱 （HPLC） 耦合流动闪烁可用于分离和同时定量所有七种 PtdInsPs¹⁸。使用带有强阴离子交换 （SAX） 色谱柱的 HPLC 可实现基于分子量、电荷和形状的分离，从而分离出相同分子量和电荷的脱酰基 PtdInsPs （Gro-InsPs）。然后将 HPLC 淋洗液与流动闪烁体偶联，然后为每种 Gro-InsPs 物质相对于原始母体甘油-肌醇 （Gro-Ins） 产生基于放射性的信号峰¹⁸。这最终对应于细胞中 PtdInsPs 的相对水平。

PtdInsPs 和 HPLC 耦合流闪烁的放射性标记是研究磷脂酰肌醇 3,5-二磷酸 [PtdIns（3,5）P₂] 的调节和功能的有用工具，PtdInsP 仅占 PtdIns^16,19,20 的 ~0.1-0.3%。PtdIns（3,5）P₂ 的合成由酵母中称为 Fab1 的 PtdIns3P 5 激酶和哺乳动物中称为 PIKfyve²¹ 进行。该反应被酵母中称为 Fig4 的 PtdIns（3,5）P₂ 5-磷酸酶或哺乳动物中称为 mFig4/Sac3^{抵消 22-24}。有趣的是，PIKfyve/Fab1 和 mFig4/Fig4/Sac3 都存在于单个复合物中，并受支架接头蛋白、酵母中的 Vac14 或哺乳动物中的 mVac14/ArPIKfyve 的调节^25,26。在 VAC14 缺失的酵母细胞中，Fab1 不能有效发挥作用，导致 PtdIns（3,5）P₂ 水平降低 90%^27,28。另一方面，Atg18 是一种 PtdIns（3,5）P₂ 效应蛋白，可控制液泡裂^{变 29}。Atg18 也是 PtdIns（3,5）P₂ 的负调节因子，因为其基因 ATG18 的缺失导致 PtdIns（3,5）P₂ 水平^29,30 增加 10 至 20 倍。总体而言，PtdIns（3,5）P₂ 水平的变化严重影响酵母液泡和哺乳动物溶酶体的功能，从而影响膜运输、吞噬体成熟、自噬和离子转运等过程 ^6,19,21,31。

本文介绍了酵母中 PtdInsPs 用 ³H-肌醇放射性同位素标记以检测野生型 vac14Δ 和 atg18Δ 酵母菌株中 PtdIns（3,5）P₂ 的相对水平的过程。以此为例，显示了 HPLC 分离单个 PtdInsPs 的分离能力以及流动闪烁检测痕量 ³H-肌醇的灵敏度。我们还详细阐述了如何优化从哺乳动物细胞中标记和分离 ³个 H 标记的 PtdInsPs 的方法，哺乳动物细胞的样品往往更复杂，因为这些细胞具有所有七种 PtdInsP 物种。

注:文中详细描述了一个在酵母来衡量PtdInsPs方法。它提供了用于标记的酵母细胞^用 3 H- 肌醇 ，提取和脱酰化脂质和的HPLC洗脱协议以分级分离和量化去酰基化PtdInsPs的实验细节。请注意，标签，脱酰化，PtdInsPs在哺乳动物细胞分辨率和量化需要优化和更长的HPLC-洗脱曲线。这些细节可以找到其他地方，虽然我们讨论一些在讨论方面。总体而言，该方法提取脂质，脱酰化并提取水溶性格罗-InsPs从酵母中给出并示于图1。

1.协议标签和浅析PtdInsPs酵母

1. 细胞培养及放射性标记
   1. 生长的酵母菌株SEY6210的20ml液体培养在30℃下以恒定振荡中完成合成媒体数中期或在约0.6-0.7 600nm的值（OD _600）的光密度。
      注:请不要使用YPD媒体，因为这可能会影响³ H- 肌醇结合。这种文化的大小应为2-3 HPLC运行提供了足够的材料。
   2. 沉淀总共10-14外径的酵母细胞（注意1 ml培养用的OD ₆₀₀ = 1〜包含1×10 ⁷细胞）通过离心，在800×g离心5分钟，在12毫升的圆底管中。重悬用2ml肌醇的培养基（IFM）（ 见表 1 IFM组合物）。
   3. 重复离心和吸媒体。重悬带440微升IFM的沉淀并在室温下孵育15分钟。
   4. 添加60微升³ H- 肌醇 （1微升= 1微居）向每个样品，孵育在30℃的生长温度进行1至3小时以恒定振荡。
      注意^:3 H- 肌醇是一种放射性伴侣里亚尔应经过适当的培训来处理。此外，所有的消耗品，使用^{3 H-}含材料接触应适当设置，并指定为放射性废物。
      注:生长温度是可以改变的，只要所有菌株进行比较生长在相同的温度下必需的。
   5. 转移细胞悬液（500微升）到含有500微升9％高氯酸和200微升酸的离心管中洗涤玻璃珠。通过颠倒混合并在冰上孵育5分钟。
   6. 涡样品以最高速度进行10分钟，并使用凝胶加载提示，以避免在玻璃珠的裂解物转移到新的离心管中。
   7. 沉淀将样品在12000×g离心10分钟，在4℃，吸出上清液。
   8. 悬浮颗粒通过浴超声处理在1ml冰冷的100mM EDTA中。再次颗粒和以前一样。
2. 去酰基化和提取 新鲜通过组合2.3毫升甲醇，1.3 ml的40％甲胺的，0.55毫升1-丁醇和0.80毫升水制备5.0毫升脱酰试剂。倒置混合。
3. 吸出EDTA和超声处理将沉淀于50μl水中。
4. 加入500μl脱酰试剂和超声处理混合。在室温下孵育20分钟。
5. 热脂质在53℃下在热块50分钟。完全干燥的样品通过真空离心超过3小时或O / N。
   1. 确保化学捕集器安装在真空离心机和真空泵，以防止进入空气的蒸气之间。
6. 通过浴声处理重悬用300μl水的颗粒和在室温下孵育20分钟。干燥真空离心样品3小时或O / N。再一次重复此步骤。
7. 超声处理以450微升水沉淀。这是提取期间水相。
8. 刚准备将10毫升提取中的Ñ​​试剂通过加入8.0中毫升乙醚，1-丁醇，1.6 ml和0.40毫升甲酸乙酯。倒置混合。
9. 添加300微升提取试剂的水相。涡旋以最高速度混合物5分钟并通过离心以最高速度（18,000 xg离心）2分钟，分层。
10. 收集底部的水层到一个新的离心管，同时避免了上面的有机层，界面和沉淀。用新鲜的萃取剂重复萃取水相两次。
11. 完全干燥收集的水层通过真空离心。通过浴声处理分散在50μl水中沉淀。
12. 添加2微升各样品到4ml闪烁液在6 ml的聚乙烯闪烁瓶中。确定每个样品中计数（在CPM）的通过液体闪烁利用开窗口的数量。
13. 储存在-20℃的样本，直到准备用于HPLC。

使用这种方法，酵母PtdInsPs进行代谢标记用 3 H- 肌醇 。标记后，磷脂沉淀，用高氯酸，接着脱酰磷脂和提取的水溶性格罗-InsPs（ 图1）。在这个阶段，重要的是要量化与所提取格罗-InsPs通过液体闪烁相关的总放射性信号，以确保有足够的信噪比为非常低丰度PtdInsPs像磷脂酰肌醇（3,5）P 2;总共5-10万的CPM应注射。由于酵母细胞表现出只有四个PtdInsPs，分辨率可以如所述（图2）中，使其与1小时洗脱法。

这里，野生型，atg18Δ和vac14Δ酵母突变体标记和处理，以分析磷脂酰肌醇的变化（3,5）P 2，第ê最丰富的酵母16,19,27的PtdInsPs的。如观察到的在图4A-C中，为产生3 H-相关信号峰值的所有三个菌株的洗脱曲线。亲格罗宏峰首先洗脱（8-9分钟; 在图3中示出，但没有在图4自格罗宏黯然失色磷酸化物种的信号），接着格罗-Ins3P（〜18分钟），GRO- Ins4P（约20分钟），格罗宏（3,5）P2（〜29分钟）和格罗宏（4,5）P2（〜32:00分），它们分别对应于酰化的磷脂酰肌醇磷脂， PtdIns3P，PtdIns4P，磷脂酰肌醇（3,5）P 2和磷脂酰肌醇（4,5）P2。有在4分钟和一个趋于紧跟在父格罗项（10分钟）的几个额外小峰;这些可能代表肌醇和非glycerated肌醇磷酸盐（图3）。洗脱模式是一致的特征，虽然采用迪菲时的确切时间可能有所不同租HPLC系统和/或一个新列。

与磷脂酰肌醇（3,5）P 2（图4，红色箭头）相关的峰经历野生型之间的最显着的变化，atg18Δ和vac14Δ酵母菌株。相对于野生型细胞（A）中，有一个非常大的格罗项（3,5）中的p atg18Δ细胞2机相关信号和在vac14Δ酵母细胞一个较小的峰。为了量化与每个峰相关的总放射性信号，所述计数的峰（图3）的区域下结合。另外，由于样品之间的绝对放射性信号变化时，亲本格罗宏物种用作由人反对正火（1也可以选择对正常化总计数）内部对照。通过这样做，数据表明，磷脂酰肌醇（3,5）P 2只占0.07％，在野生型酵母细胞磷脂酰肌醇，而磷脂酰肌醇（3,5）p 2对应于亲磷脂酰肌醇中atg18Δ细胞，或在磷脂酰肌醇戏剧性17倍的增加（3,5）P 2相对于野生型细胞（图4A，B和D）的1.2％。相比较而言，磷脂酰肌醇（3,5）P 2的水平仅为0.01％在VAC14的磷脂酰肌醇信号-deleted酵母细胞，在磷脂酰肌醇（3,5）P 2（图4C和D）一种 85％的损失。总体而言，这些测量是在与已发表 ​​的结果显示，磷脂酰肌醇（3,5）P 2为约0.1％在野生型细胞磷脂酰肌醇的协议，90％减少vac14 D和在atg18 D细胞10到20倍相对于野生型细胞27,29。

图1.脱酰化和提取的 3 H- 格罗-INSP。放射性标记的梨皮在高氯酸ð沉淀用的EDTA水溶液。这然后吸出，并加入去酰基化试剂和培养在53℃。脱酰化反应混合物，然后真空干燥，并用水洗涤两次，然后加入萃取试剂。这然后涡旋，离心，水相被收集。提取步骤重复三次总以除去有机和不溶性杂质。水溶性部分（蓝色），其中包括3 H-格罗-INSP，然后真空干燥和再水化60微升水中。放射性的量由液体闪烁（CPM）和整个样本数量相等加载到高效液相色谱法测定。 请点击此处查看该图的放大版本。

<BR /> 图2.梯度为 GRO-督察3 H-GRO-督察，分辨率洗脱铵磷酸盐缓冲液强阴离子交换层析取决于磷酸氢二铵，pH值3.8（缓冲液B）的应用程序。梯度的选择取决于格罗-INSP物种可用于分离混合物中。 议定书A用于酵母样本，其中具有只有四个PtdInsPs。每四个峰的分辨率足以在迅速增加（NH 4）2 HPO 4浓度。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3.引导指令PtdInsP大量的数据分析，数据文件是在劳拉小号装直观地使用色谱仪（默认开启）oftware和评估。 "在缩放"工具使用（一），放大峰（B）。选择使用"添加投资回报率"工具（三）色谱明显的峰值。在"区域表"标签（d）中，从感兴趣的高亮区域的所有所得信息显示为一个单一的表（E）。导出的每个峰（F）的原始计数和规范各PtdInsP品种对父母的磷脂酰肌醇（g）或反对总计数。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4.磷脂酰肌醇（3,5）P 2 的水平在野生型和突变体酵母细胞。代表性的色谱示于提取物的流动闪烁ED 3 H-GRO-InsPs从野生型（A），atg18Δ（B），和vac14Δ（C）使用协议酵母株。从感兴趣相当于GRO宏区域的原始计数（3,5） P 2（箭头）中提取从色谱仪和背景减去。将所得的值进行比较，以野生型和表示为倍数变化在格罗项（3,5）P 2水平（D）。水平及变化格罗宏（3,5）P2被解释为显示水平和改变原来的磷脂酰肌醇（3,5）P2。 请点击此处查看该图的放大版本。

表1的组成酵母肌醇的培养基。酵母细胞被放射性标记与IFM为基础介质要与3 H- 肌醇补充。准备的100ml溶液IFM用该溶液的指示，过滤消毒用瓶盖0.22微米真空过滤和储存在室温。制备低磷酸盐和硫酸盐媒体（LPSM），使用指示的盐生成的100毫升的溶液，过滤消毒用瓶顶0.22微米真空过滤器，并储存在室温。溶解所指示的盐以制备微量元素的1L 1000倍的溶液。使用和/或储存分装于-20℃之前，调匀。化解表明维生素准备一个1升500倍的维生素解决方案。之前使用和储存分装于-20℃调匀。

提交人声明，他们没有竞争的经济利益。