方法文章

放射性标记和磷酸肌醇的细胞水平的定量高效液相色谱耦合流动闪烁

DOI：

10.3791/53529

⸱

2016年1月6日

 ,  , 
1Department of Chemistry and Biology, Program in Molecular Science, Ryerson University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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磷酸肌醇的信号脂类的相对丰度变化迅速响应各种刺激。本文通过代谢标记的细胞用 3 H- 肌醇 ，随后萃取和脱酰描述了一种用于测量磷酸肌醇的丰度的方法。萃取甘油基肌醇然后通过高效液相色谱法分离，并通过流式细胞闪烁定量。

摘要

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磷酸肌醇 （PtdInsPs） 是必需的信号脂质，负责募集特异性效应子并赋予细胞器分子身份和功能。7 种 PtdInsPs 中的每一种的分布和丰度都不同，它们受到特异性激酶和磷酸酶的严格调控。PtdInsPs 的丰度可以响应各种信号事件或调节机制的干扰而突然变化。要了解这些事件如何导致 PtdInsPs 数量的变化及其产生的影响，量化信号转导事件前后或对照和异常条件之间的 PtdInsP 水平非常重要。然而，由于它们的低丰度和相似性，量化每个 PtdInsP 的相对量可能具有挑战性。本文介绍了一种通过用 3个 H-肌醇代谢标记细胞来量化 PtdInsP 水平的方法，3 H-肌醇被掺入 PtdInsPs 中。然后沉淀磷脂并脱酰基。进一步提取所得的可溶性 3H-甘油肌醇，通过高效液相色谱 （HPLC） 分离，并通过流动闪烁检测。详细描述了酵母样品的标记和处理，以及 HPLC 和流动闪烁体的仪器设置。尽管丢失了有关酰基链含量的结构信息，但该方法很敏感，可以优化以同时定量细胞中的所有 7 种 PtdInsP。

引言

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磷酸肌醇 （PtdInsPs） 是重要的信号磷脂，有助于调节多种细胞功能，包括信号转导、膜运输和基因表达，然后调节高阶细胞行为，如细胞分裂、细胞器身份和代谢活性1-3。有 7 种 PtdInsPs 来源于磷脂酰肌醇 （PtdIns） 肌醇头基 （PtdIns） 的 3、4 和/或 5 位的磷酸化。重要的是，这 7 个 PtdInsP 分布不均，每个 PtdInsP 物种的局部浓度可以在特定的亚细胞位点增加或减少，在那里它们与一组不同的蛋白质效应子结合，这共同使每个 PtdInsP 能够控制其宿主膜的身份和功能3,4。此外，需要严格控制每个 PtdInsP 的水平，因为这会显着影响 PtdInsP 产生的信号强度。每种 PtdInsP 的定位和水平取决于介导每种 PtdInsP 合成和周转的多种脂质激酶、磷酸酶和磷脂酶的靶向和活性3,4。因此，PtdInsP 调节机制的失调会扰乱细胞功能，导致癌症和退行性疾病等疾病2,5,6。为了充分了解 PtdInsPs 及其调节机制的作用和功能，已经开发了基于显微镜和基于生化的技术来跟踪和量化 PtdInsPs。

在许多情况下，PtdInsPs 通过特定的蛋白质结构域7-9 与其蛋白质效应子结合。当与整个蛋白质分开表达时，这些蛋白质模块通常保留其适当的折叠和脂质识别特性。通过将特异性 PtdInsP 结合蛋白结构域与荧光蛋白 （FP） 如绿....

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方案

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注:文中详细描述了一个在酵母来衡量PtdInsPs方法。它提供了用于标记的酵母细胞用 3 H- 肌醇 ，提取和脱酰化脂质和的HPLC洗脱协议以分级分离和量化去酰基化PtdInsPs的实验细节。请注意，标签，脱酰化，PtdInsPs在哺乳动物细胞分辨率和量化需要优化和更长的HPLC-洗脱曲线。这些细节可以找到其他地方，虽然我们讨论一些在讨论方面。总体而言，该方法提取脂质，脱酰化并提取水溶性格罗-InsPs从酵母中给出并示于图1。

1.协议标签和浅析PtdInsPs酵母

  1. 细胞培养及放射性标记
    1. 生长的酵母菌株SEY6210的20ml液体培养在30℃下以恒定振荡中完成合成媒体数中期或在约0.6-0.7 600nm的值（OD 600）的光密度。
      注:请不要使用YPD媒体，因为这可能会影响3 H- 肌醇结合。这种文化的大小应为2-3 HPLC运行提供了足够的材料。
    2. 沉淀总共10-14外径的酵母细胞（注意1 ml培养用的OD 600 = 1〜包含1×10 7细胞）通过离心，在800×g离心5分钟，在12毫升的圆底管中。重悬用2ml肌醇的培养基（IFM）（ 见表

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结果

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使用这种方法，酵母PtdInsPs进行代谢标记用 3 H- 肌醇 。标记后，磷脂沉淀，用高氯酸，接着脱酰磷脂和提取的水溶性格罗-InsPs（ 图1）。在这个阶段，重要的是要量化与所提取格罗-InsPs通过液体闪烁相关的总放射性信号，以确保有足够的信噪比为非常低丰度PtdInsPs像磷脂酰肌醇（3,5）P 2;总共5-10万的CPM应注射。由于酵母细胞表现出只有四个PtdInsPs，分辨率可以如所述（图2）中，使其与1小时洗脱法。

这里，野生型，atg18Δ和vac14Δ酵母突变体标记和处理，以分析磷脂酰肌醇的变化（3,5）P 2，第ê最丰富的酵母16,19,27的PtdInsPs的。如观察到的在图.......

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讨论

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这篇文章详细描述了从酵母HPLC-耦合流动闪烁量化细胞PtdnsPs水平所需要的实验方案。该方法使PtdInsPs 用 3 H- 肌醇 ，随后脂质处理和提取的水溶性的3 H-GRO-InsPs，HPLC分级和分析的代谢标记。使用这种方法，PtdInsPs在细胞在各种条件下的相对水平可以被量化，作为示出了用于磷脂酰肌醇（3,5）P 2在野生型，vac14 D和atg18ð酵母细胞（图4）。

有一些关键步骤和修改，可以做，以优化结果和/或排除。一个实现PtdInsPs的可靠的量化的最重要的参数是总放射性的信号电平。通常情况下，注射3-5百万计数进入高效液相往往不足以可靠定量变化喜gher丰PtdInsP物种如磷脂酰肌醇（4,5）P2。然而，注射高达1000万计数可能是必要的低丰度品种的量化，如磷脂酰肌醇（3,5）P 2。有可能影响放射性信号的电平实现的，包括用于制备样品，标记的时间和温度

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披露

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提交人声明，他们没有竞争的经济利益。

致谢

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C.Y.H. 得到了安大略省政府的安大略省研究生奖学金的支持。本文由 R.J.B. 提供，由自然科学与工程研究委员会、加拿大研究主席计划和瑞尔森大学资助。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1-丁醇生物基BC1800试剂级
磷酸氢铵BioshopAPD001ACS 级
硫酸铵生物基ADB0060超纯级
自动进样器安捷伦G1329B安捷伦 1260 infinity 系列
生物素SigmaB4501
硼酸生物基BB0044分子生物学级
氯化钙生物基CT1330无水、工业级
泛酸钙SigmaC8731
硫酸铜 （II）451657无水
D-葡萄糖生物基GB0219无水、生物技术级
Dulbecco 的改性Eagle's MediumLife11995-065含 4.5 g/L 葡萄糖、110 mg/L pyruate、L-谷氨酰胺
Dulbecco 对 Eagle's MediumMP 生物医学的0916429 含 4.5 g/L 葡萄糖，不含 L-谷胱胺，不含肌醇
EDTA生物基EB0107无酸、超纯级
乙醚Caledon 实验室1/10/4700无水、试剂级
甲酸乙酯Sigma112682试剂级
胎牛血清Wisent 080-450美国来源，优质，热灭活
胎牛血清，透析生活26400044美国origin
： FlowLogic ULabLogic Systems LtdSG-BXX-05用于流动闪烁的闪烁流体 
叶酸生物基FB0466USP 级
HEPES 缓冲溶液Life156300801 M 溶液
肌醇、肌醇-[2-3H（N）]Perkin ElmerNET114005MC9：1 乙醇与水
胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺Life51500056100x 溶液
氯化铁 （III）Sigma157740试剂
等级 Laura - 色谱数据收集和分析软件LabLogic Systems Ltd版本 4.2.1.18流动闪烁体软件
L-谷氨酰胺SigmaG7513200 mM，溶液，无菌过滤，BioXtra，适用于细胞培养
氯化镁SigmaM8266无水
硫酸锰BiobasicMB0334一水合物，ACS 级
甲醇Caledon 实验室6701-7-40HPLC 级
甲胺溶液Sigma42646640% （v/v）
磷酸二氢钾BiobasicPB0445无水 ACS 级
烟酸BiobasicNB0660试剂级
OpenLAB CSD ChemStation 安捷伦修订版 C.01.03 HPLC 软件
对氨基苯甲酸 （PABA）BioshopPAB001.100游离酸
青霉素-链霉素SigmaP4333100X，液体，稳定，无菌过滤，细胞培养测试
高氯酸Sigma244252ACS 试剂，70%
PhenoSpher SAX 色谱柱Phenomenex00G-315-E05 µm， 80 Å， 250 x 4.6 mm
磷酸Caledon 实验室1/29/8425试剂级
钾BiobasicPB0440ACS 级
碘化钾BiobasicPB0443ACS 级
酸吡哆醇SigmaP9755
四元泵AgilentG1311CAgilent 1260infinity 系列
核黄素BioshopRIB333.100USP 级
氯化钠生物基DB0483生物技术级
钼酸钠Sigma243655
恒温柱温箱AgilentG1316AAgilent 1260 infinity 系列
盐酸硫胺素SigmaT4625试剂级;制备 0.02% （w/v） 的溶液，形成悬浮液。混合和冷冻等分试样
Ultima GoldPerkin Elmer6013321用于液体闪烁计数的闪烁尾凑
硫酸锌生物基ZB2906七水合物，试剂级
&β;-RAM 4IN/US 系统4 型流动闪烁体 - 500 µl 流通池;Perkin Elmer 的替代放射性流闪烁体分析仪 
改良 氯化盐

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443 (7112), 651-657 (2006).
  2. Bridges, D., Saltiel, A. R. Phosphoinositides and Disease. Curr. Top. Microbiol. Immuno. 362, 61-85 (2012).
  3. Botelho, R. J.

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Phosphoinositide QuantificationHPLC Flow ScintillationTritium LabelingYeast Cell AnalysisPhospholipid ExtractionDeacylation ProcedureRadioactive DetectionGradient ElutionPeak IntegrationData Normalization

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