为了鉴定影响机械感知的新型突变，我们设计了一种检测方法，用于测量通过MARCM方法产生的突变克隆果蝇刚毛对触觉刺激的行为反应。该技术组合能够鉴定出原本可能导致致死的机械敏感性突变。
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摘要
摘要
由于与哺乳动物内耳毛细胞在结构和功能上具有同源性，支配这些毛细胞的神经元 果蝇 外部感觉器官为研究机械感知提供了极佳的模型系统。本实验方案描述了一种果蝇的简单触觉行为，可用于鉴定干扰机械感知的突变体。当对果蝇胸部的大刚毛（macrochaete bristle）施加触觉刺激时，会引发第一或第三对足的梳理反射。影响机械转导（如NOMPC基因突变）或其他反射弧组分的突变，均可能抑制该梳理反应。传统的成体行为筛选方法会遗漏在发育过程中具有必需功能的致死突变体。本方案结合触觉行为检测与可抑制细胞标记的镶嵌分析（MARCM），仅生成并标记少量纯合突变细胞区域，这些细胞通过表达绿色荧光蛋白（GFP）进行可视化。通过对MARCM克隆进行异常行为反应检测，可筛选一系列致死性P因子突变，从而发现传统方法难以识别的、参与机械感知的新基因。
引言
人类依赖于将来自环境的机械刺激（如触觉、压力、振动或声波）转化为神经系统可处理的感觉信息的能力，这一过程称为机械转导。人类与无脊椎动物在机械转导的整体机制特征上具有许多相同之处1，这使得Drosophila成为研究机械转导分子机制的有用模型。Drosophila melanogaster具有两组特化的感受器器官（I型和II型），能够将机械刺激转化为动作电位。I型机械感受器包含一个具有单个树突或感觉过程的神经元，并由三个支持细胞包围2。I型机械感受器包括刚毛机械感受器、对听觉敏感的弦音器官（约翰斯通器官）以及传递翅膀拍打信息的杯状感器3。覆盖果蝇背部的刚毛是I型器官中最丰富且最容易获取的。与脊椎动物中与听觉和平衡相关的毛细胞所处的胞外环境类似，围绕果蝇机械敏感神经元的支持细胞会分泌富含钾离子的内淋巴液，从而形成异常的钾离子浓度梯度1。哺乳动物和果蝇系统的机械敏感神经元均利用这种高浓度的胞外钾离子使细胞去极化。当大刚毛受到朝向体壁方向的机械刺激时，感觉神经元会因细胞膜的钾离子去极化而产生一系列动作电位作为响应4。支配刚毛的Drosophila感觉神经元在结构和功能上均与包括脊椎动物毛细胞在内的其他生物体的机械敏感细胞相似1,5。由于Drosophila外部感觉器官易于进行实验操作，且研究人员可利用丰富的遗传学技术，因此Dros....
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方案
1. 构建 MARCM 果蝇的杂交实验
- 将果蝇饲养在玉米粉糖浆培养基（6.5 g/L 琼脂；23.5 g/L 酵母；60 g/L 玉米粉；60 ml/L 糖浆；4 ml/L 酸混合物；0.13% Tegosept）或标准 Drosophila 培养基中，置于 22 摄氏度、12 小时光照/12 小时黑暗的条件下。
注意：使用低于标准的温度有助于维持 MARCM 品系的健康状态。这将使卵至成虫的发育时间延长至 14 天。 - 使用 MARCM 准备就绪品系中的处女雌蝇（约 1–8 日龄），该品系包含必要的遗传元件（由上游激活序列控制的 GFP（UAS-GFP）、Gal80 抑制蛋白、Gal4 转录因子、热激启动的重组酶以及 FRT 重组位点）。
注意：我们的 MARCM 准备就绪品系包含以下基因型：elavGal4, UAS-CD8-GFP, hs-flipase; FRT40A, tubGal80/CyO; tubGal4/TM3Sb。
注意：具体的 FRT 位点取决于突变在基因组中的位置。例如，FRT40A 用于检测位于第 2 染色体左臂的突变，如 NOMPC（有关 MARCM 实验方案的更多细节，请参见10）。 - 将 MARCM 准备就绪的处女雌蝇与携带目标突变及其对应 FRT 位点的雄蝇（例如，w-; NOMPC3, FRT40A/CyO; +/+）杂交。为控制 MARCM 有效诱导，设....
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结果
该实验方案的成功在很大程度上取决于可检测果蝇的总体产量、热激诱导有丝分裂重组的效率，以及在每2分钟刺激一次的条件下获得果蝇强烈行为反应的能力。由于估计仅有12.5%的胚胎含有必需的MARCM元件，且约16.67%的羽化成虫具有GFP表达潜力，因此在定时产卵期间获得大量卵至关重要。图1A展示了在4小时时间段内成功进行定时产卵的一个示例，该产卵结果将用于后续实验步骤中。
在卵孵化后85至100小时进行热激时，GFP标记的外部感觉器官产量最高，大多数果蝇均有一个大刚毛被标记。在此时间段内进行热激，许多感兴趣区域的可检测刚毛基部可含有纯合细胞，其中背中央刚毛和后翅刚毛最常被标记（图2A）。在此时间窗口之外进行热激，则会导致GFP表达出现在目标体区以外的区域，或无GFP表达（图2B）。
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讨论
本方案利用成年果蝇的行为学检测方法，筛选影响Drosophila机械感知的突变体。由于突变体库中包含致死性的P因子插入突变，无法直接用于成虫阶段的筛选，因此本方案采用了一种复杂的遗传学技术，该技术最初由Lee和Luo（1999年）提出，并由Wu和Luo（2006年）详细描述为具体实验流程，以克服成虫致死的问题。MARCM技术通过诱导同源染色体之间的有丝分裂重组，产生纯合细胞的克隆区域。由于有丝分裂重组过程中抑制蛋白tub-GAL80的丢失，这些克隆区域可通过GFP标记进行识别。通过使用MARCM技术获得特定基因位点的纯合细胞，即可在成年果蝇中利用多种方法研究基因功能，包括本文所述的行为学检测方法。
限制可检测基因数量及具体基因的主要因素在于果蝇基因组中是否存在FRT位点。果蝇品系必须在目标突变所在的染色体臂上含有FRT位点。用于MARCM实验的果蝇品系必须携带与突变染色体相同的FRT位点，以实现有丝分裂重组。在本实验室中，我们已构建了含有MARCM遗传背景并携带FRT40A和FRT42D位点的果蝇品系。这些品系使我们能够筛选已分别与2L和2R染色体臂上相应FRT位.......
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披露
作者无竞争性财务利益。
致谢
作者谨此感谢布卢明顿果蝇品系中心（Bloomington stock center）、Liqun Luo、Charles Zuker 以及 Lily 和 Yuh Nung Jan 慷慨提供果蝇品系，同时感谢以下机构对本研究的资金支持：SOMAS-URM（资助 JD 和 SW）、Bachelor Ford 教师暑期研究奖学金（资助 SW）、BD 公司暑期研究奖学金（资助 CL 和 DL）、Renee 和 Anthony M. Marlon 医学博士 '63 暑期研究奖学金（资助 DL）、James C. '75 与 Jane Colihan 暑期研究奖学金（资助 TO），上述后三项资助均来自圣十字学院校友/家长暑期研究基金，以及 Stransky 基金会暑期研究奖学金（资助 TO）。特别感谢圣十字学院生物学系及院长办公室对实验室全部工作的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 啤酒酵母（25 磅） | MP Biomedicals | ICN90331225 | 果蝇饲料 |
| 玉米粉（25 磅） | MP Biomedicals | ICN90141125 | 果蝇饲料 |
| 琼脂（1 磅） | MoorAgar Inc. | 41004 | 果蝇饲料 |
| 对羟基苯甲酸甲酯（5 千克） | Genesee | 20-259 | 果蝇饲料 |
| 糖蜜（1 加仑） | Sugarmill Brand - Thomsen Food Service | 0 2625 | 果蝇饲料 |
| 丙酸 | Fisher | A258-500 | 果蝇饲料 |
| 磷酸 | Fisher | A260-500 | 果蝇饲料 |
| 果蝇培养管，窄口（聚苯乙烯） | Genesee | 32-109 | 果蝇培养 |
| 6 盎司方形底瓶（聚丙烯） | Genesee | 32-130 | 果蝇培养 |
| Flugs - 塑料果蝇培养瓶 | Genesee | 49-100 | 果蝇培养 |
| 大号人造纤维塞 | Genesee | 51-100 | 果蝇培养 |
| 窄口自动加料器（Droso-Filler） | Genesee | 59-168 | 果蝇饲料制备 |
| 瓶用自动加料器（Droso-Filler） | Genesee | 59-170 | 果蝇饲料制备 |
| 8A-C / 齿轮驱动实验室搅拌器，带C型夹安装架 1/15 HP，700 rpm 可调转速，115 V，50/60 Hz | Cleveland Mixer | 8A-C | 果蝇饲料制备 |
| 水套式反应釜 | 果蝇饲料制备 | ||
| 昼夜生长培养箱 | Forma Scientific | 温度及明暗循环控制 | |
| 水浴锅 | VWR | 用于热激处理 | |
| 显微手术剪 | Fine Science Tools | 15000-08 | 用于去除果蝇头部 |
| 荧光体视显微镜 | Zeiss | SteREO Discovery V8 | 配备GFP滤光立方（KSC295-814D）带通滤光片 |
| 荧光光源 | Zeiss | X-Cite 120 | 光纤导光管便于系统配置 |
| 显微镜用相机 | Zeiss | AxioCam ICc1 | |
| 图像采集软件 | Zeiss | ||
| 冰桶 | 用于低温麻醉 | ||
| 自制低温麻醉操作盘 | 用于低温麻醉下的去头操作 | ||
| 塑料盒 | 用于在高湿度环境中恢复去头后的果蝇 |
参考文献
- Grünert, U., Gnatzy, W. K+ and Ca++ in the receptor lymph of arthropod cuticular mechanoreceptors. J Comp Physiol A. 161, 329-333 (1987).
- Kernan, M. J. Mechanotransduction and auditory transduction in Drosophila. Pflugers Arch. 454, 703-720 (20....
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重印与许可
