后包埋免疫胶体金法是进行特定分子亚细胞定位高分辨率分析的最有效方法之一。本文介绍了一种定量分析视网膜带状突触处谷氨酸受体的实验方案。
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摘要
摘要
视网膜神经节细胞（RGCs）从双极细胞接收兴奋性谷氨酸能输入。RGCs的突触兴奋由突触后NMDA受体（NMDARs）和AMPA受体（AMPARs）介导。生理学数据表明，RGC上的谷氨酸受体不仅表达于突触后膜，也存在于突触周围或突触外膜区室中。然而，谷氨酸受体在RGC突触中的精确定位尚未明确。尽管在中枢神经系统突触中已广泛采用高分辨率定量分析谷氨酸受体的方法，但该方法在视网膜中的应用仍十分有限。我们开发了一种用于膜受体分析的包埋后免疫金标技术，可实现对视网膜带状突触处这些受体的数量、密度及变异性的定量估算。本文将介绍所需工具、试剂以及具体操作步骤，包括：1）视网膜固定样本的成功制备；2）冷冻置换；3）包埋后免疫金标透射电子显微镜（EM）免疫细胞化学；以及4）带状突触处谷氨酸受体的定量可视化。
引言
谷氨酸是视网膜中的主要兴奋性神经递质1。视网膜神经节细胞（RGCs）接收来自双极细胞的谷氨酸能突触输入，是将视觉信息传递至大脑的视网膜输出神经元2。生理学研究表明，RGCs的突触兴奋由突触后NMDA受体（NMDARs）和AMPA受体（AMPARs）介导3,4,5。尽管RGCs中的兴奋性突触后电流（EPSCs）由AMPARs和NMDARs共同介导3,5,6,7,8，但RGCs上的自发微型EPSCs（mEPSCs）仅表现出AMPARs介导的组分4,5,9。然而，降低谷氨酸摄取可揭示自发EPSCs中存在NMDAR组分5，提示RGC树突上的NMDARs可能位于兴奋性突触之外。膜相关鸟苷酸激酶（MAGUKs）如PSD-95可聚集神经递质受体，包括突触部位的谷氨酸受体和离子通道，同时也表现出特定的突触下表达模式10,11,12,13,14。
近几十年来，共聚焦免疫组织化学和包埋前电子显微镜（EM）免疫组织化学技术已被用于研究膜受体的表达。尽管共聚焦免疫染色能够揭示受体表达的总体分布模式，但其分辨率较低，无法用于区分亚细胞定位。哺乳动物视网膜的包埋前电镜研究表明，NMDAR亚基存在于视锥双极细胞带状突触的突触后成分中15,16,17。这与生理学证据似乎存在明显矛盾。然而，反应产物的扩散是包埋前免疫过氧化物酶法中公认的....
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方案
动物的护理和操作均依照美国国立卫生研究院（NIH）动物护理与使用委员会指南进行。出生后第15至21天的Sprague-Dawley大鼠，通过上丘双侧注射1-1.2% CTB，饲养于12小时光照:12小时黑暗的循环环境中。
1. 视网膜组织固定
- 准备以下材料和工具：解剖显微镜、两把尖端非常细的镊子、剪刀、纤维素滤纸、塑料移液管和载玻片。
- 在密闭容器中使用 2.0 ml 氟烷（一种吸入性麻醉剂）对大鼠进行麻醉。通过以下方法判断麻醉是否充分：夹脚趾时后肢无回缩反应，或无眨眼反射。随后立即使用断头器断头。用虹膜剪剪下眼球，并置于盛有含 4% 多聚甲醛的 0.1 M 磷酸盐缓冲液（PB，pH 7.4）的玻璃皿中。
- 在解剖显微镜下，通过剪除眼球前部去除角膜。用镊子从视网膜内表面移除晶状体和玻璃体。
- 用两把镊子剥离巩膜，直至视网膜与眼杯分离。
- 立即用剃刀将视网膜切成 100 - 200 µm 厚的条状，并进行 pH 转移固定。
- 将视网膜条在 pH 6.0 的含 4% 多聚甲醛的 0.1 M PB 中固定 20 - 30 分钟，然后在 pH 10.5 的含 4% 多聚甲醛和 0.01% 戊二醛的溶液中于 RT 固定 10 - 20 分钟。
- 在含 0.15 mM CaCl2 的 PB（pH 7.4，4°C）中洗涤数次后，....
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结果
本研究结果表明，在大鼠视网膜视网膜神经节细胞（RGC）树突上，GluA2/3 和 NMDARs 的突触下定位模式存在显著差异，这与先前报道一致24,25。在 RGC 树突轮廓中，77% 的 GluA2/3 免疫金颗粒位于突触后致密区（PSD）内（图 1A），这与大多数中枢突触的情况相似。然而，NMDARs 既可位于突触内，也可位于突触外。83% 的 GluN2A 免疫金颗粒定位于 PSD 内（图 1C、2A、2B），且主要富集于 OFF 突触，并在 PSD 中心区域更为集中（图 2C）。相比之下，绝大多数标记 GluN2B 的金颗粒（96%）位于 PSD 外（图 1B、2A、2B），主要沿突触外质膜分布，其颗粒密度峰值出现在距 PSD 边缘约 180 nm 处（图 2B）。特别地，GluN2B 表现出对 ON 突触的偏好性。在部分实验中，对 GluN2A、PSD-95 和 CTB 进.......
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讨论
我们介绍了四种成功的定量免疫胶体金电镜后包埋技术：1）短暂且温和的固定，2）冷冻置换，3）后包埋免疫胶体金染色，以及4）定量分析。
电镜免疫金标技术可实现超薄组织切片中特定蛋白质的检测。使用金颗粒标记的抗体可通过电子显微镜直接观察。尽管该技术在检测膜受体的突触下定位方面具有强大能力，但其技术操作较为复杂，需要对组织固定和处理方法进行严格的优化。
为了在膜完整性和抗原性之间达到最佳平衡，我们测试了不同的固定方法和时间。例如，先前用于中枢突触后包埋电镜检测NMDAR的成功方案19,20在视网膜中未能检测到NMDAR免疫反应性。本研究采用温和的固定方式和较短的孵育时间，以避免强烈且长时间固定后NMDA受体抗原性降低16。
冷冻置换法最早于20世纪90年代初开发，用于谷氨酸受体的超微结构定位27，该方法涉及在非极性疏水性树脂HM20中进行低温渗透和聚合28，这是实现最佳包埋后免疫金标记所必需的.......
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致谢
本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）下属国家神经疾病与卒中研究所（NINDS）和国家耳聋及其他沟通障碍研究所（NIDCD）内部研究项目的支持。我们感谢NINDS电子显微镜设施和NIDCD高级成像中心（项目编号 # ZIC DC 000081-03）提供的技术支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 多聚甲醛 | EMS | 15710 | |
| 戊二醛 | EMS | 16019 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S9638 | |
| Na2HPO4 | Sigma | 7782-85-6 | |
| CaCl2 | Sigma | C-8106 | |
| BSA | Sigma | A-7030 | |
| 吐温 X-100 | Sigma | T-8787 | |
| NaOH | Sigma | 221465 | |
| NaN3 | JT Baker | V015-05 | |
| 甘油 | Gibco BRL | 15514-011 | |
| Lowicryl HM 20 | Polysciences | 15924-1 | |
| Tris-Base | Fisher | BP151-500 | |
| Tris | Fisher | 04997-100 | |
| Anti-GluN2A | Millipore | AB1555P | 稀释比例 1/50 |
| Anti-GluN2B | Millipore | AB1557P | 稀释比例 1/30 |
| Anti-GluA2/3 | Millipore | AB1506 | 稀释比例 1/30 |
| Anti-PSD-95 | Millipore | MA1–046 | 稀释比例 1/100 |
| 驴抗兔 IgG-10 nm 金颗粒 | EMS | 25704 | 稀释比例 1/20 |
| 驴抗小鼠 IgG-10 nm 金颗粒 | EMS | 25814 | 稀释比例 1/20 |
| 驴抗小鼠 IgG-5 nm 金颗粒 | EMS | 25812 | 稀释比例 1/20 |
| 驴抗山羊 IgG-18 nm 金颗粒 | Jackson ImmunoResearch | 705-215-147 | 稀释比例 1/20 |
| Formvar-碳镀镍槽网格 | EMS | FCF2010-Ni | |
| 醋酸铀酰 | EMS | 22400-1 | |
| 甲醇 | EMS | 67-56-1 | |
| 柠檬酸铅 | Leica | ||
| Leica EM AFS | Leica | ||
| Leica EM CPC | Leica | ||
| 超薄切片机 | Leica | ||
| JEOL 1200 EM | JEOL | ||
| 液氮 | Roberts Oxygen | ||
| 丙烷 | Roberts Oxygen | ||
| CTB | List Biological Laboratories | 104 | 1 - 1.2% |
| Anti-CTB | List Biological Laboratories | 703 | 稀释比例 1/4,000 |
参考文献
- Copenhagen, D. R., Jahr, C. E. Release of endogenous excitatory amino acids from turtle photoreceptors. Nature. 341, 536-539 (1989).
- Wässle, H., Boycott, B. B. Functional architecture of the mammalian retina. Physiol. Rev. 71, 447-480 (1991).
- Mittman, S., Taylor, W.....
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重印与许可
