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方法文章

视网膜带状突触膜受体的高分辨率定量免疫金分析

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DOI：

10.3791/53547

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2016年2月18日

 ,  ,  , 
1Synaptic Physiology Section, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 2Advanced Imaging Core, National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, National Institutes of Health

本文内容

摘要

后包埋免疫胶体金法是进行特定分子亚细胞定位高分辨率分析的最有效方法之一。本文介绍了一种定量分析视网膜带状突触处谷氨酸受体的实验方案。

摘要

视网膜神经节细胞（RGCs）从双极细胞接收兴奋性谷氨酸能输入。RGCs的突触兴奋由突触后NMDA受体（NMDARs）和AMPA受体（AMPARs）介导。生理学数据表明，RGC上的谷氨酸受体不仅表达于突触后膜，也存在于突触周围或突触外膜区室中。然而，谷氨酸受体在RGC突触中的精确定位尚未明确。尽管在中枢神经系统突触中已广泛采用高分辨率定量分析谷氨酸受体的方法，但该方法在视网膜中的应用仍十分有限。我们开发了一种用于膜受体分析的包埋后免疫金标技术，可实现对视网膜带状突触处这些受体的数量、密度及变异性的定量估算。本文将介绍所需工具、试剂以及具体操作步骤，包括：1）视网膜固定样本的成功制备；2）冷冻置换；3）包埋后免疫金标透射电子显微镜（EM）免疫细胞化学；以及4）带状突触处谷氨酸受体的定量可视化。

引言

谷氨酸是视网膜中的主要兴奋性神经递质1。视网膜神经节细胞（RGCs）接收来自双极细胞的谷氨酸能突触输入，是将视觉信息传递至大脑的视网膜输出神经元2。生理学研究表明，RGCs的突触兴奋由突触后NMDA受体（NMDARs）和AMPA受体（AMPARs）介导3,4,5。尽管RGCs中的兴奋性突触后电流（EPSCs）由AMPARs和NMDARs共同介导3,5,6,7,8，但RGCs上的自发微型EPSCs（mEPSCs）仅表现出AMPARs介导的组分4,5,9。然而，降低谷氨酸摄取可揭示自发EPSCs中存在NMDAR组分5，提示RGC树突上的NMDARs可能位于兴奋性突触之外。膜相关鸟苷酸激酶（MAGUKs）如PSD-95可聚集神经递质受体，包括突触部位的谷氨酸受体和离子通道，同时也表现出特定的突触下表达模式10,11,12,13,14。

近几十年来，共聚焦免疫组织化学和包埋前电子显微镜（EM）免疫组织化学技术已被用于研究膜受体的表达。尽管共聚焦免疫染色能够揭示受体表达的总体分布模式，但其分辨率较低，无法用于区分亚细胞定位。哺乳动物视网膜的包埋前电镜研究表明，NMDAR亚基存在于视锥双极细胞带状突触的突触后成分中15,16,17。这与生理学证据似乎存在明显矛盾。然而，反应产物的扩散是包埋前免疫过氧化物酶法中公认的人工假象。因此，该方法通常无法提供统计学上可靠的数据，可能难以区分突触膜与突触外膜的定位18,19,20,21。另一方面，生理学和解剖学数据均支持AMPA受体在视网膜神经节细胞（RGCs）上定位于突触区域3,5,7,9,22。因此，视网膜带状突触处的谷氨酸受体及MAGUKs不仅定位于突触后膜，也存在于突触周围或突触外膜区室中。然而，目前仍缺乏对这些视网膜带状突触中膜蛋白的高分辨率定量分析。

本文中，我们建立了一种包后免疫电镜胶体金技术，用于检测NMDAR亚基、AMPAR亚基和PSD-95在突触下的定位，并通过霍乱毒素B亚基（CTB）逆行示踪法标记的大鼠视网膜神经节细胞（RGCs）突触，进一步估算这些蛋白在突触处的数量、密度及其分布变异性。

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方案

动物的护理和操作均依照美国国立卫生研究院（NIH）动物护理与使用委员会指南进行。出生后第15至21天的Sprague-Dawley大鼠，通过上丘双侧注射1-1.2% CTB，饲养于12小时光照:12小时黑暗的循环环境中。

1. 视网膜组织固定

  1. 准备以下材料和工具：解剖显微镜、两把尖端非常细的镊子、剪刀、纤维素滤纸、塑料移液管和载玻片。
  2. 在密闭容器中使用 2.0 ml 氟烷（一种吸入性麻醉剂）对大鼠进行麻醉。通过以下方法判断麻醉是否充分：夹脚趾时后肢无回缩反应，或无眨眼反射。随后立即使用断头器断头。用虹膜剪剪下眼球，并置于盛有含 4% 多聚甲醛的 0.1 M 磷酸盐缓冲液（PB，pH 7.4）的玻璃皿中。
  3. 在解剖显微镜下，通过剪除眼球前部去除角膜。用镊子从视网膜内表面移除晶状体和玻璃体。
  4. 用两把镊子剥离巩膜，直至视网膜与眼杯分离。
  5. 立即用剃刀将视网膜切成 100 - 200 µm 厚的条状，并进行 pH 转移固定。
  6. 将视网膜条在 pH 6.0 的含 4% 多聚甲醛的 0.1 M PB 中固定 20 - 30 分钟，然后在 pH 10.5 的含 4% 多聚甲醛和 0.01% 戊二醛的溶液中于 RT 固定 10 - 20 分钟。
  7. 在含 0.15 mM CaCl2 的 PB（pH 7.4，4°C）中洗涤数次后，将视网膜条在 0.1 M PB 中依次用甘油进行冷冻保护处理（10%、20%、30% 各 60 分钟，最后在 30% 中过夜），然后进行冷冻置换。

2. 冷冻置换

注意：此冷冻置换方法改编自先前发表的方案19,20。此外，仪器必须保持极低温度（需佩戴手套）；否则，组织在接触仪器时可能会部分解冻。所有这些步骤均在AFS腔室内完成，仪器不得移出腔室边缘以上。同样，AFS中使用的所有化学试剂也必须充分冷却。

  1. 在EM冷冻保存仪（CPC）中，将视网膜条置于-184°C的液态丙烷中进行 plunge-freeze。使用细刷将样品转移至固定在浸入杆末端金属 stub 上的双面胶小片上（用刷子吸去多余的缓冲液）。
  2. 将金属棒浸入液态丙烷中，保持约5秒，然后使用充满液氮（'LN₂'）的小型转运室转移至自动冷冻置换仪（AFS）中2 冷却的冷冻转运容器
  3. 将冷冻样本和器械（镊子和手术刀）放入 AFS 后，在接触组织前，先在腔室内冷却器械数分钟，或通过将器械尖端放入盛有液氮（'LN2 冷却的冷冻转运容器  
  4. 一旦进入原子力显微镜（AFS），使用精细解剖刀将样品和胶带从载样 stub 上取下。同时保持氮气流量控制，TF（TF 被描述为液氮的“调节控制阀”）2 在这些操作过程中，汽化器需保持开启状态。
  5. 在将冷冻组织放入平嵌模具之前（即在设置AFS之前，从透明塑料片上切下一个小圆片，放入持载器底部，以衬垫每个孔的底部。这有助于在聚合完成后更轻松地取出凝固的样本块。
    注：此前，我们采用了一种替代平面包埋夹的方法，使用双层Reichert+明胶胶囊（参见Petralia和Wenthold，1999） 20.
  6. 使用AFS中的以下自动程序（使用仪器术语）：T1 = -90°C 保持32小时，S1 = 以4°C/小时的速率升温 (11.3 小时)，T2 = -45°C 持续 50 小时，S2 = 以 5°C/小时的速率升高温度 （9 小时），T3 = 0°C 保持 40 小时（总计 = 142.3 小时）。在启动定时程序前，将样品放入 AFS（-90°C）可能需要 2 - 4 小时。
  7. 在 -90°C 下，将冷冻切片浸入含 1.5% 醋酸铀的甲醇溶液中 >在AFS中放置32小时。将两片组织（通常情况下）放入扁平包埋铝制支架的七个孔中（三个可放入AFS）。
    1. 将组织连同胶带一起放入盛有醋酸铀/甲醇的孔中，若组织难以从胶带上剥离，可在开始包埋介质（如Lowicryl HM20）渗透前再移除胶带。
  8. 然后逐步升高温度至-45°C（每小时升高4°C；采用自动程序）。
  9. 用细尖塑料移液管将每个平埋包埋 holder 中的旧溶液移除，然后用另一支标准塑料移液管加入预冷的新甲醇，重复此步骤三次，对样品进行甲醇预冷洗涤。
  10. 然后，采用相同方法，依次用低温包埋树脂对样品进行渗透处理，如包埋介质（HM20/甲醇按1:1和2:1比例分别处理2小时，随后用纯树脂处理2小时，更换树脂后过夜）。
  11. 第二天再次更换树脂，并调节树脂液面至恰好与孔板上边缘齐平。
  12. 在自动程序下（从 -45°C 至 0°C；每小时升高 5°C）用紫外光照射 40 小时以使样品聚合。
  13. 然后从原子力显微镜（AFS）中取出样品。通常情况下，样品块仍会呈现一定程度的粉红色。将样品置于化学通风橱内荧光灯附近，室温下过夜或更长时间，直至样品完全透明。

3. 电镜后包埋免疫金免疫细胞化学

注意： 采用如文献23,24,25所述的方法进行包埋后免疫细胞化学染色。

  1. 使用超薄切片机切割1 µm切片，用1%甲苯胺蓝染色切片，并检查切片方向；调整组织块方向以获得最佳横切面。
  2. 使用超薄切片机切割70 nm厚的超薄切片，并将其收集于经Formvar-碳支持膜覆盖的镍质载网栅格上。
  3. 用蒸馏水将载网清洗一次2O，随后用Tris缓冲盐水（TBS，0.05 M Tris缓冲液，0.7% NaCl，pH 7.6）洗涤三次。
  4. 在含5% BSA的TBS中，将载网置于20 µl液滴中孵育30分钟，随后在含有山羊抗CTB抗体（1:3,000）和一种NMDAR亚基抗体（抗兔GluN2A 1:50、GluN2B 1:30）或抗兔GluA2/3（1:30）的混合液中孵育，混合液为含2% BSA和0.02 M NaN₃的TBS-Triton（TBST，0.01% Triton X-100，pH 7.6），液滴体积为20 µl3 室温过夜。
  5. 在三滴（20 µl）TBS（pH 7.6）上分别洗涤载网，每次10、10和20分钟，随后在TBS（pH 8.2）中洗涤5分钟。
  6. 在含有2% BSA和0.02 M NaN3的TBST（pH 8.2）溶液中，加入驴抗兔IgG（1:20）与10 nm金颗粒偶联物和驴抗山羊IgG（1:20）与18 nm金颗粒偶联物的混合液，取20 µl滴加于载网上，孵育2小时。3.
  7. 在20 µl TBS（pH 7.6）液滴中清洗载网，每次5分钟、5分钟和10分钟，随后用超纯水清洗，然后干燥。
  8. 用5%醋酸铀和0.3%柠檬酸铅在蒸馏水中对载网进行复染2分别在避光条件下孵育 8 和 5 分钟。
  9. 用于三重标记实验，将载网在溶液中孵育过夜 在室温下，用 20 µl 滴加含有抗山羊 CTB（1:3,000）、抗小鼠 PSD-95（1:100）和抗兔 GluN2A（1:50）的混合液孵育载网。随后，在含有 2% BSA 和 0.02 M NaN₃ 的 TBST（pH 8.2）溶液中，用 20 µl 滴加含与 18、10 和 5 nm 金颗粒偶联的 IgG 的混合液，继续孵育载网 2 小时。3保持与双重标记相同的洗涤和抗体孵育间及孵育后的复染步骤。
  10. 对照实验中仅使用二抗进行处理。
  11. 在透射电子显微镜上观察网格并数字化图像。如有必要，仅使用 Adobe Photoshop 6.0 对最终图像进行亮度和对比度的调整24.

4. 定量分析

  1. 在8,000倍放大倍数下手动选择无孔洞或裂纹的内丛状层（IPL）区域，随后在25,000倍放大倍数下随机拍摄IPL全深度的电镜照片并进行拼接。
  2. 在视锥双极细胞突触双元结构处识别RGC树突，需满足以下条件：a) 含有逆向运输的CTB信号（大金颗粒），b) 具有清晰可辨的膜结构、裂隙及突触后致密区（PSD），c) PSD内至少含有两个小金颗粒，或在突触外膜质膜上分布有超过一个小金颗粒。
  3. 根据上述标准，收集45至55个RGC树突用于定量分析。
  4. 使用NIH ImageJ软件测量各RGC树突的PSD长度及突触外质膜长度。将距离膜10 nm范围内的金颗粒计为膜相关颗粒，依据为质膜平均厚度为7–9 nm 26。
  5. 计算颗粒密度，即每线性微米内的金颗粒数量（金颗粒/µm）。测量每个金颗粒中心至PSD中点（用于突触定位）或PSD边缘（用于突触外定位）的距离。
  6. 使用软件进行统计分析。采用双尾t检验比较均值，当P <0.05时认为差异具有统计学意义。除非另有说明，数据均以均值±标准误（SEM）表示18。

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结果

本研究结果表明，在大鼠视网膜视网膜神经节细胞（RGC）树突上，GluA2/3 和 NMDARs 的突触下定位模式存在显著差异，这与先前报道一致24,25。在 RGC 树突轮廓中，77% 的 GluA2/3 免疫金颗粒位于突触后致密区（PSD）内（图 1A），这与大多数中枢突触的情况相似。然而，NMDARs 既可位于突触内，也可位于突触外。83% 的 GluN2A 免疫金颗粒定位于 PSD 内（图 1C、2A、2B），且主要富集于 OFF 突触，并在 PSD 中心区域更为集中（图 2C）。相比之下，绝大多数标记 GluN2B 的金颗粒（96%）位于 PSD 外（图 1B、2A、2B），主要沿突触外质膜分布，其颗粒密度峰值出现在距 PSD 边缘约 180 nm 处（图 2B）。特别地，GluN2B 表现出对 ON 突触的偏好性。在部分实验中，对 GluN2A、PSD-95 和 CTB 进...

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讨论

我们介绍了四种成功的定量免疫胶体金电镜后包埋技术：1）短暂且温和的固定，2）冷冻置换，3）后包埋免疫胶体金染色，以及4）定量分析。

电镜免疫金标技术可实现超薄组织切片中特定蛋白质的检测。使用金颗粒标记的抗体可通过电子显微镜直接观察。尽管该技术在检测膜受体的突触下定位方面具有强大能力，但其技术操作较为复杂，需要对组织固定和处理方法进行严格的优化。

为了在膜完整性和抗原性之间达到最佳平衡，我们测试了不同的固定方法和时间。例如，先前用于中枢突触后包埋电镜检测NMDAR的成功方案19,20在视网膜中未能检测到NMDAR免疫反应性。本研究采用温和的固定方式和较短的孵育时间，以避免强烈且长时间固定后NMDA受体抗原性降低16。

冷冻置换法最早于20世纪90年代初开发，用于谷氨酸受体的超微结构定位27，该方法涉及在非极性疏水性树脂HM20中进行低温渗透和聚合28，这是实现最佳包埋后免疫金标记所必需的...

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致谢

本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）下属国家神经疾病与卒中研究所（NINDS）和国家耳聋及其他沟通障碍研究所（NIDCD）内部研究项目的支持。我们感谢NINDS电子显微镜设施和NIDCD高级成像中心（项目编号 # ZIC DC 000081-03）提供的技术支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
多聚甲醛EMS15710
戊二醛EMS16019
NaH2PO4SigmaS9638
Na2HPO4Sigma7782-85-6
CaCl2SigmaC-8106
BSASigmaA-7030
吐温 X-100SigmaT-8787
NaOHSigma221465
NaN3JT BakerV015-05
甘油Gibco BRL15514-011
Lowicryl HM 20Polysciences15924-1
Tris-BaseFisherBP151-500
TrisFisher04997-100
Anti-GluN2AMilliporeAB1555P稀释比例 1/50
Anti-GluN2BMilliporeAB1557P稀释比例 1/30
Anti-GluA2/3MilliporeAB1506稀释比例 1/30
Anti-PSD-95MilliporeMA1–046稀释比例 1/100
驴抗兔 IgG-10 nm 金颗粒EMS25704稀释比例 1/20
驴抗小鼠 IgG-10 nm 金颗粒EMS25814稀释比例 1/20
驴抗小鼠 IgG-5 nm 金颗粒EMS25812稀释比例 1/20
驴抗山羊 IgG-18 nm 金颗粒Jackson ImmunoResearch705-215-147稀释比例 1/20
Formvar-碳镀镍槽网格EMSFCF2010-Ni
醋酸铀酰EMS22400-1
甲醇EMS67-56-1
柠檬酸铅Leica
Leica EM AFSLeica
Leica EM CPCLeica
超薄切片机Leica
JEOL 1200 EMJEOL
液氮 Roberts Oxygen
丙烷Roberts Oxygen
CTBList Biological Laboratories1041 - 1.2%
Anti-CTBList Biological Laboratories703稀释比例 1/4,000

参考文献

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免疫金电镜技术谷氨酸受体冷冻置换超薄切片包埋后免疫金标记定量可视化膜蛋白分析视网膜神经节细胞NMDA受体
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