利用青鳉鱼卵进行银纳米胶体的盐度依赖性毒性检测

摘要

胚胎阶段对异源物质最为敏感。尽管化学毒性依赖于盐度，但目前尚无方法用于检测毒性对水生生物的盐度依赖性。本文中，我们描述了一种测定水生胚胎毒性盐度依赖性的新型高通量方法。

摘要

盐度是水生环境的一个重要特征，对于水生生物而言，它定义了淡水、半咸水和海水等不同生境。化学物质对水生生物的毒性测试及其生态风险评估通常在淡水中进行，但化学物质对水生生物的毒性受pH、温度和盐度的影响。然而，目前尚无评估化学物质毒性随盐度变化的标准方法。本研究采用青鳉（Oryzias latipes）作为实验对象，因其能够适应淡水、半咸水和海水环境。通过使用不同浓度的胚胎培养基（ERM）（1x、5x、10x、15x、20x 和 30x）（其中1x ERM和30x ERM的渗透压分别相当于淡水和海水），测试银纳米胶体颗粒（SNCs）对青鳉卵的毒性。实验在六孔塑料板中进行，每孔放入15枚青鳉卵，设三个重复，于pH 7、25 °C、避光条件下，暴露于浓度为10 mg/L⁻¹的SNCs溶液中。

我们使用解剖显微镜和测微尺，在第6天测量心率（每15秒）和眼径，并在孵化当天测量仔鱼的全长（第4节）。胚胎持续观察至孵化或第14天；随后我们每天记录孵化率，持续14天（第4节）。为观察胚胎中银的积累情况，我们采用电感耦合等离子体质谱法测定测试溶液中的银浓度（第5节）以及去壳胚胎中的银含量（第6节）。SNCs对青鳉胚胎的毒性随盐度升高而明显增强。该新方法使我们能够在不同盐度条件下检测化学品的毒性。

引言

自1979年经济合作与发展组织（Organisation for Economic Co-operation and Development, OECD）发布化学品测试指南以来，该指南第2部分“生物系统效应”已发布了38项测试指南¹。所测试的水生生物均来自淡水生境，包括淡水植物、藻类、水生无脊椎动物（如溞类和摇蚊）以及鱼类（如青鳉、斑马鱼和虹鳟）。与海水环境相比，淡水环境更直接受到人类经济和工业活动的影响，因此因面临更高的污染风险而被优先列为测试对象。

在包括河口在内的沿海地区，盐度在半咸水和海水条件之间变化，这些区域常常受到工业活动的污染²。沿海地区及其相关的湿地具有高度的生态多样性和生产力。因此，必须保护沿海生态系统免受化学污染。然而，在半咸水和海水生境中开展的生态毒理学研究仍然有限。

Sakaizumi³ 研究了甲基汞与盐度对日本青鳉卵的联合毒性作用，发现提高测试溶液的渗透压会增强甲基汞的毒性。Sumitani 等.⁴ 利用青鳉卵研究了垃圾填埋场渗滤液的毒性，发现渗滤液与卵之间的渗透当量是诱导胚胎发育异常的关键因素。此外，Kashiwada⁵ 报道了塑料纳米颗粒（直径为 39.4 nm）在半咸水条件（15 倍胚胎培养基（ERM））下可轻易穿透青鳉卵的卵膜。

日本青鳉（Oryzias latipes）是一种典型的小型鱼类模型，已被广泛应用于基础生物学和生态毒理学研究⁶。由于具有高度发达的氯细胞，日本青鳉能够在从淡水到海水的不同环境条件下生存⁷。因此，它们可能适用于在多种盐度条件下进行测试。

方案

本研究中使用的日本青鳉鱼均按照东京理科大学的机构指南人道对待，在实验过程中充分考虑减轻其痛苦与不适。

1. 银纳米胶体（SNCs）

1. 购买纯化的SNCs（20 mg/L⁻¹，纯度99.99%，平均粒径约为28.4 ± 8.5 nm，悬浮于蒸馏水中）。
2. 根据操作手册⁸，采用电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）分析验证银的纯度和浓度。ICP-MS分析的前处理方法见第7节。

2. 不同盐度的SNC溶液（银胶体与Ag⁺的混合物）的制备

1. 配制60× ERM溶液：在1 L超纯水中加入60 g NaCl、1.8 g KCl、2.4 g CaCl₂·2H₂O和9.78 g MgSO₄·7H₂O；用超纯水配制的1.25% NaHCO₃溶液调节pH至7.0。
2. 将ERM溶液在25 °C下搅拌过夜。
3. 将SNCs与稀释后的ERM溶液混合，每种SNC-ERM混合溶液配制40 ml。最终SNCs浓度为10 mg/L⁻¹，ERM浓度分别为1x、5x、10x、15x、20x或30x。
4. 用超纯水配制的0.625% NaHCO₃溶液调节SNC-ERM混合溶液的pH至7.0。在SNC溶液的制备过程中，pH调节至关重要，因为酸性条件会促进Ag⁺ 的释放⁹。
5. 使用AgNO₃作为SNCs的参比化合物。
   1. 将AgNO₃与稀释后的ERM溶液混合，配制40 ml AgNO₃-ERM混合溶液，AgNO₃浓度为15.7 mg/L⁻¹（相当于10 mg/L⁻¹的银），ERM浓度分别为1x、5x、10x、15x、20x或30x。
      注意：为评估银胶体的毒性，采用可溶性银来源的AgNO₃溶液作为SNCs的参比化合物，SNCs为银胶体与可溶性银的混合物。

3. 青鳉鱼培养与卵的收集

1. 获取青鳉（O. latipes）（橙红色品系）（60条雄鱼和60条雌鱼）。
2. 使用青鳉流水养殖系统，将青鳉按群体培养（每组20条雄鱼和20条雌鱼），置于3 L水箱中，使用1x ERM培养液。
   1. 培养条件如下：
      培养液pH范围：6.2至6.5
      光照-黑暗周期：16:8小时
      培养液温度：24 ± 0.5 °C
      培养液渗透压：257 mOsm
3. 每天于10:00投喂卤虫（Artemia salina）无节幼体一次，并于09:00、11:00、13:00、15:00和17:00投喂人工干燥鱼饲料（每日五次）。
   1. 获取A. salina无节幼体。
   2. 在塑料烧杯中配制5 L的3.0%盐溶液。
   3. 向烧杯中的盐溶液加入30 g卤虫卵。
   4. 使用曝气泵在25 °C下充气（4 L/min⁻¹）孵育卵48小时。
   5. 48小时后，停止充气。
   6. 静置溶液5至10分钟，使孵化出的A. salina无节幼体（溶液下层）与未孵化卵及卵壳（溶液上层）分离。
   7. 通过倾析法去除上层液体。
   8. 将溶液下层部分通过孔径283 µm的筛网过滤，并用孔径198 µm的网筛收集通过的无节幼体。
   9. 在6小时内将无节幼体投喂给青鳉。
4. 雌性青鳉产卵后，轻轻从雌鱼体表取下外部卵团，或使用小网（网尺寸5 cm × 5 cm，孔径0.2 mm × 0.2 mm）从鱼缸底部收集卵。
5. 用流动的自来水冲洗卵团5秒。
6. 将所有冲洗后的卵团加入30x ERM溶液中。
7. 1分钟后将卵团从溶液中取出，置于干燥的纸巾之间轻轻滚动。
8. 将卵重新放回30x ERM溶液中。
9. 在解剖显微镜下挑选受精卵。
10. 用镊子将挑选出的810枚卵放入六孔塑料培养板中，置于1x ERM溶液中。
11. 将卵置于25 ± 0.1 °C的培养箱中孵育至发育阶段21。（青鳉胚胎的发育阶段根据岩松的研究¹⁰定义。）
12. 在解剖显微镜下挑出发育至阶段21的孵育卵。
13. 用1x ERM溶液冲洗挑选出的卵。
14. 将冲洗后的卵用于暴露实验（第4节）。

4. 不同 ERM 盐度下 SNCs 或 AgNO₃ 的毒性测试

1. 用测试溶液 [SNCs（10 mg/L⁻¹）或 AgNO₃（15.7 mg/L⁻¹，相当于 10 mg/L⁻¹ 银）] 在 pH 7 条件下，对青鳉鱼卵（21 期）进行三次冲洗，每次冲洗均在不同浓度的 ERM（1x、5x、10x、15x、20x 或 30x）中进行。对照组使用在 pH 7 条件下 1× 至 30× ERM 中的鱼卵。
2. 将 15 枚已冲洗的鱼卵加入六孔塑料培养板的每孔 5 ml 测试溶液中。（每种测试溶液均需重复三次暴露实验，用于 SNC 或 AgNO₃ 毒性检测。）
3. 用铝箔包裹培养板。
4. 将包裹后的培养板置于 25 °C 黑暗环境中孵育，直至孵化或孵育 14 天。
5. 每 24 小时观察一次暴露的鱼卵，记录生物学变化及死亡鱼卵（图 1 和 图 2）。
6. 每 24 小时更换一次测试溶液。
7. 按以下方式开展观察：
   1. 暴露第 6 天，在解剖显微镜下使用秒表计数青鳉胚胎的心率（每 15 秒）（图 3a）。
   2. 暴露第 6 天，在解剖显微镜下使用千分尺测量青鳉胚胎的眼部大小（直径）（图 3b）。
   3. 在孵化当天，在解剖显微镜下使用千分尺测量仔鱼的全长（图 3c）。
   4. 统计 14 天内成功孵化的暴露鱼卵总数（图 3d）。

5. 从SNC溶液中分离可溶性银及银含量分析

1. 通过使用3 kDa膜过滤器在14,000 × g和4 °C条件下离心10分钟，从每种SNC溶液（银胶体与可溶性银的混合物）中分离可溶性银。采用3 kDa膜过滤器分离SNC中的可溶性银，因为已有报道显示，在1× ERM中聚集态SNC的平均直径为67.8 nm¹¹，而Ag⁺的直径为0.162 nm¹²；3 kDa膜可截留直径为2 nm或更大的颗粒¹³。
2. 根据ICP-MS操作手册⁸，采用ICP-MS分析法测定50 µl滤液中的银浓度（即为可溶性银浓度）（图3e）。ICP-MS分析的前处理方法见第7节。

6. 青鳉胚胎中银生物累积的测量

1. 将青鳉鱼卵（21期）暴露于SNCs或AgNO₃中₃ 如第4节所述
2. 在暴露的第6天，从卵中去除卵膜（即，使用根据所述方案的青鳉孵化酶进行去卵膜处理 青鳉手册¹⁴.
3. 根据ICP-MS操作手册，采用ICP-MS分析法测定去壳卵中的银浓度⁸ (图 3f）。ICP-MS分析的预处理方法见第7节。

7. 通过ICP-MS分析测定银浓度

1. 将样品 [50 µl 银溶液（用于验证银浓度；第1节）；三个去壳胚胎（第5节）；或50 µl 过滤溶液（第5节）] 加入50 ml 聚四氟乙烯烧杯中。
2. 向50 ml 烧杯中加入2.0 ml 超纯硝酸。
3. 在电热板上于110 °C 加热混合物，直至接近干燥（约3小时）。
4. 为完全溶解有机物质，向烧杯中加入2.0 ml 超纯硝酸和0.5 ml 过氧化氢。
5. 再次在电热板上加热混合物，直至接近干燥（约3小时）。
6. 用4 ml 1.0% 超纯硝酸溶液溶解残留物。
7. 将4 ml 溶液转移至离心管中。
8. 重复步骤7.6至7.7两次（共三次）。最终体积为12.0 ml。
9. 根据操作手册⁸，采用ICP-MS分析测定样品（溶解于1.0% 超纯硝酸中）的银浓度。
   1. 使用内标和外标溶液（见材料列表）定量银浓度。内标和外标溶液经美国实验室认可协会（A2LA）认证。银的检测限为0.0018 ng/ml⁻¹（溶液）和0.016 ng mg-weight⁻¹（胚胎体）。

结果

盐度对SNC毒性的效应非常明显：畸形或死亡的发生率具有盐度依赖性（图1 和 图2）。我们检测了暴露于SNC（10 mg/L⁻¹）的胚胎的表型生物标志物（心率、眼径、全长和孵化率）。这些表型生物标志物揭示了SNC毒性的盐度依赖性。

对照组在1x至30x ERM条件下，心率范围为29.6至32.2次/15秒。然而，在30x ERM条件下，经SNC或AgNO₃暴露后，心率显著下降（P ＜0.01）（图3a）。心率降低表明健康状况恶化。在盐度为5x至30x ERM的条件下，经对照或AgNO₃暴露的幼虫全长与相应1x ERM溶液相比均无显著差异；体长始终为4.55至4.69 mm。然而，在15x和20x ERM条件下，经SNC暴露后，体长分别显著下降至4.33 mm和3.77 m...

讨论

青鳉是一种对海水耐受性很强的淡水鱼；鲜为人知的是，这种鱼最初的自然栖息地是日本沿海的海水环境⁶。因此，青鳉具有发育良好的氯细胞⁷。这一独特特性为科学家提供了一种新方法，仅利用单一鱼类物种，即可在不同盐度（从淡水到海水）条件下检测环境中化学物质的毒性。

为了获得处于21期的青鳉卵，必须每天早晨收集卵并在20期进行筛选。通常，青鳉配对在清晨（日出前）开始交配，并在日出时产卵。早晨收集的卵通常处于10或11期左右。如果在实验开始前需要控制卵的发育进程，可在达到21期之前将温度控制在15至20 °C以减缓卵的发育速度。在研究硫化纳米银（SNC）毒性的盐度依赖性时，测定测试溶液及去壳胚胎中银浓度（可溶性银）对我们的研究至关重要。孵化酶是去除卵膜最符合生物学特性的酶，因其具有高度特异性，不会产生有害的蛋白酶活性，因此是最佳选择。不建议使用其他蛋白酶。目前唯一可获得的孵化酶是针对青鳉的，这是本方法的一个局限性。

盐度对化学毒性测试结果的显著影响表明，在实验中尽可能真实地模拟此类天然水体特性，对于研...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
银纳米胶体	Utopia Silver Supplements
NaCl	Nacalai Tesque, Inc.	31319-45	用于制备 ERM
KCl	Nacalai Tesque, Inc.	28513-85	用于制备 ERM
CaCl2·2H2O	Nacalai Tesque, Inc.	06730-15	用于制备 ERM
MgSO4·7H2O	Nacalai Tesque, Inc.	21002-85	用于制备 ERM
NaHCO3	Nacalai Tesque, Inc.	31212-25	用于制备 ERM
AgNO3	Nacalai Tesque, Inc.	31018-72
pH 计	HORIBA, Ltd.	F-51S
天平	Mettler-Toledo International Inc.	MS204S
青鳉（Oryzias latipes）橙红色品系	国立环境研究所
青鳉流水式养殖系统	Meito Suien Co.	MEITOsystem
卤虫（Artemia salina）无节幼体卵	Japan pet design Co. Ltd	4975677033759
曝气泵	Japan pet design Co. Ltd	non-noise w300
Otohime 幼体 β-1	Marubeni Nissin Feed Co. Ltd	Otohime 幼体 β-1	人工干燥鱼饲料
体视显微镜	Leica Microsystems	M165FC
千分尺	Fujikogaku, Ltd.	10450023
培养箱	Nksystem	TG-180-5LB
摇床	ELMI Ltd.	Aizkraukles 21-136
6 孔塑料板	Greiner CELLSTAR	M8562-100EA
铝箔	AS ONE Co.	6-713-02
秒表	DRETEC Co. Ltd.	SW-111YE
3 kDa 膜滤器	EMD Millipore Corporation	0.5 ml 离心式滤器
50 ml 聚四氟乙烯烧杯	AS ONE Co.	33431097
Custom claritas 标准品	SPEXertificate	ZSTC-538	作为内标
Custom claritas 标准品	SPEXertificate	ZSTC-622	作为外标
超纯硝酸	关东化学公司	28163-5B
过氧化氢	关东化学公司	18084-1B	用于原子吸收光谱法
ICP-MS	Thermo Scientific	Thermo Scientific X Series 2
电热板	Tiger Co.	CRC-A300