纤毛病小鼠突变体耳蜗中平面细胞极性表型的评估

摘要

初级纤毛影响多种信号通路。哺乳动物耳蜗是研究平面细胞极性（PCP）信号通路的理想模型。纤毛功能障碍会影响耳蜗的外向生长、细胞排列模式以及毛细胞的定向，这些均为PCP的表型读数。我们的目标是通过表型分析、免疫组织化学和扫描电子显微镜技术，分析小鼠耳蜗中的PCP信号通路。

摘要

近年来，初级纤毛通过影响多种信号通路，在发育和疾病中被确认为关键调控因子。最早被发现与纤毛功能相关的信号通路之一是非经典Wnt信号通路，也称为平面细胞极性（PCP）信号通路。在脊椎动物发育过程中研究平面细胞极性（PCP）信号作用的最佳部位之一是哺乳动物耳蜗。在小鼠耳蜗中，PCP信号通路的紊乱会破坏耳蜗的向外生长、细胞排列模式以及毛细胞的方向，而这些均受到纤毛功能障碍的影响。本实验方案的目标是通过表型分析、免疫组织化学和扫描电子显微镜技术，描述发育中哺乳动物耳蜗内PCP信号通路的分析方法。收敛与延伸缺陷表现为耳蜗管缩短和/或细胞排列模式改变，这些可在从小鼠突变体胚胎分离组织后进行定量分析。通过免疫荧光或扫描电子显微镜（SEM），可观察并量化静纤毛束的方向以及动纤毛的长度或位置变化。深入理解纤毛蛋白在细胞信号通路及其他生物学现象中的作用，对于揭示细胞与发育生物学机制，以及开发靶向治疗策略至关重要。

引言

初级纤毛是源自大多数哺乳动物细胞表面的、基于微管的细长突起结构。初级纤毛常与运动纤毛相混淆，后者每个细胞通常有多个，其功能是推动膜表面的液体流动。相比之下，初级纤毛主要发挥感觉功能，因此也被称为感觉纤毛。这一细胞器曾长期被忽视，但近年来由于其与多种人类遗传性疾病相关而被“重新发现”¹。作为理想的信号传导细胞器，初级纤毛已被证实可调控多种信号通路，其中许多通路不仅在组织稳态和疾病中具有重要作用，也在发育过程中发挥关键功能²。

最早被发现与纤毛功能障碍相关的信号通路之一是非经典Wnt信号通路，也称为平面细胞极性（PCP）通路³。该信号级联最初在果蝇中被鉴定，对胚胎发生至关重要，特别是对于细胞汇聚与延伸过程，以及上皮细胞在上皮平面上的正确取向⁴。一组核心调控蛋白的有序信号传递可将方向性信号转化为细胞骨架的重排，最终导致上皮细胞在平面上的协调极化⁵。汇聚与延伸过程对于耳蜗管的伸长以及正确的细胞模式排列是必不可少的⁶。由于这一过程通过PCP通路的激活来调控，因此耳蜗PCP突变体最显著的表型之一便是耳蜗管缩短并伴有感觉上皮组织紊乱⁷。类似地，缺乏纤毛的小鼠突变体也表现出类似的汇聚与延伸表型^8,9，但其具体调控机制仍有待阐明。

由于汇聚延伸过程对耳蜗管的外向生长....

方案

根据机构和政府的指南与法规使用和实施安乐死，最常用的方法是通过吸入 CO₂ 并进行颈椎脱位。

1. 试剂的准备

注意：实验开始前，使用分析纯级试剂配制所有试剂。除非另有说明，均使用分子生物学级的蒸馏去离子水配制溶液。

1. 磷酸盐缓冲液（1× PBS)：通过溶解8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na₂HPO₄ 和 0.24 g KH₂PO₄ 在 1 L 的 H₂O. 用 HCl 将 pH 调至 7.4。PBS 无需灭菌，可于室温保存。注意：此缓冲液不含 CaCl₂ 或 MgCl₂.
2. 4% 多聚甲醛（PFA）溶液：在通风橱中，将40 g多聚甲醛粉末加入1 L 1×PBS中，配制4% PFA溶液。搅拌并加热至约60 °C以促进溶解，随后逐滴缓慢加入NaOH以提高pH值。待粉末完全溶解后，用HCl将pH值调至7.4。经0.45 µm滤膜过滤后，分装并冷冻保存。每次实验前使用新鲜解冻的分装液。
3. Triton缓冲液：将8.77 g NaCl溶解于1 L 0.1 M Tris-HCl（pH 7.5）溶液中，配制0.1 M Tris-HCl（pH 7.5）、0.15 M NaCl溶液，然后加入1 ml Triton X-100，搅拌至溶解。Triton缓冲液室....

结果

耳蜗解剖与组织制备

在移除脑组织后，对 P0 小鼠头部进行正中矢状面解剖，从后方可见骨迷路（图 1A，白色箭头），并可将其取出。图 1B 显示分离出的骨迷路，耳蜗毛细胞面朝上、腹侧（左图）以及从后方观察的背侧（右图）。白色箭头指向卵圆窗，可从此处开始去除外层软骨。当外层软骨完全去除后，可观察到暴露但仍然完整的耳蜗导管（图 1C）。图中显示了通过前庭区域插入大头针以辅助解剖的操作，也可使用两枚以不同角度插入的大头针固定组织。图 1D 显示去除前庭膜和盖膜后的耳蜗导管（左图），以及从 vestibular 区域分离后、准备用于免疫组织化学封片的孤立耳蜗上皮螺旋结构（右图）。为大致展示暴露后的耳蜗毛细胞形态，图 1E 展示了一个完整的扫描电镜制备样本。

讨论

在准备耳蜗组织进行分析时，需注意以下几个关键点。首先，遗传背景的差异可能改变耳蜗表型，因此必须仅对同窝出生的对照动物进行分析和比较。其次，为了在免疫组织化学染色中获得最佳图像，并满足扫描电镜（SEM）的要求，必须完全去除前庭膜（tectorial membrane）。前庭膜是一种不透明结构，会遮挡其下方感觉上皮细胞，增加成像难度。尽管在处理过程中前庭膜有时会自行收缩，暴露出毛细胞，但即便如此，仍强烈建议将其彻底清除。该步骤需要耐心和熟练的操作技巧。第三，使用针对纤毛蛋白（尤其是定位于高度致密基体的蛋白）的抗体进行免疫组织化学染色可能具有挑战性，需要优化实验条件。可考虑进行抗原修复、增强透化步骤，或降低固定剂浓度或缩短固定时间。最后，在对动纤毛（kinocilium，即耳蜗毛细胞上的初级纤毛）进行成像时，需注意其从出生后第0天（P0）至第1天（P1）开始，沿耳蜗基部至顶部的方向逐渐回缩。因此，在测量动纤毛长度时，应比较相同耳蜗区域且年龄匹配的动物样本中的毛细胞。此外，中间支持细胞也具有不会回缩的初级纤毛，在观察时必须仔细区分支持细胞的纤毛与毛细胞的动纤毛。

随着小鼠的成熟，由于颞骨和.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
工具/设备
硅胶弹性体 - Sylgard 184	Sigma-Aldrich	761028-5EA	参见注释2
直刃显微解剖剪	Various
精细镊子（编号5和55）及钝头镊子	Various
解剖显微镜	Various
未包被的玻璃载玻片	Various
显微镜盖玻片（22 mm × 40 mm × 0.15 mm）	Various
移液管	Various
微量固定针（Minutien pins）	Fine Science Tools	26002-10
扫描电镜样品台	tousimis	8762
扫描电镜样品钉	TED PELLA	16111
PELCO导电胶片：碳导电胶	TED PELLA	16084-3
荧光显微镜	Various
临界点干燥仪	Various
扫描电子显微镜	Various
玻璃载玻片	Various
玻璃盖玻片	Various
Kimwipe擦拭纸	Various
细毛画笔
试剂
1× 磷酸盐缓冲液（PBS）	Gibco/Life Technologies	10010023
多聚甲醛 （PFA）（电镜用需EM级）	Various		每次使用前用1× PBS新鲜配制4%溶液。电镜用需EM级。
2.5% 戊二醛一级品	Sigma-Aldrich	G5882
Tris-HCl（pH 7.5）	Various
NaCl	Various
CaCl₂	Various
吐温X-100（Triton X-100）	Various
正常山羊血清	Various
AffiniPure Fab片段驴抗小鼠IgG（H+L）	Jackson ImmunoResearch	715-007-003
Fluoromount-G封片剂	SouthernBiotech	0100-01
10× Hanks’平衡盐溶液（HBSS）	Gibco/Life Technologies	14065
Hepes	Gibco/Life Technologies	15630-080
四氧化锇（OsO₄）	Sigma-Aldrich/Fluka Analytical	75632
单宁酸	Sigma-Aldrich	403040
200 proof乙醇	Various
抗体
抗Arl13b抗体	Protein Tech	17711-1-AP	建议稀释比例 1:1,000
抗乙酰化微管蛋白抗体（611-B1）	Sigma-Aldrich	T6793	建议稀释比例 1:800
抗γ-微管蛋白抗体（GTU-88）	Sigma-Aldrich	T6557	建议稀释比例 1:200
抗Zo_1 抗体	Invitrogen	40-2300	建议稀释比例 1:500
Myosin VI抗体	Proteus Biosciences	25-6791	建议稀释比例 1:1000
Myosin VIIa抗体	Proteus Biosciences	25-6790	建议稀释比例 1:1,000
抗Vangl2抗体	Merk Millipore	ABN373	建议稀释比例 1:250
抗Gαi3抗体	Sigma-Aldrich	G4040	建议稀释比例 1:250
Alexa Fluor® 488鬼笔环肽	Invitrogen/Life Technologies	A12379	建议稀释比例 1:300 - 1,000
Alexa Fluor® 568鬼笔环肽	Invitrogen/Life Technologies	A12380	建议稀释比例 1:300 - 1,000