纤毛病小鼠突变体耳蜗中平面细胞极性表型的评估

摘要

初级纤毛影响多种信号通路。哺乳动物耳蜗是研究平面细胞极性（PCP）信号通路的理想模型。纤毛功能障碍会影响耳蜗的外向生长、细胞排列模式以及毛细胞的定向，这些均为PCP的表型读数。我们的目标是通过表型分析、免疫组织化学和扫描电子显微镜技术，分析小鼠耳蜗中的PCP信号通路。

摘要

近年来，初级纤毛通过影响多种信号通路，在发育和疾病中被确认为关键调控因子。最早被发现与纤毛功能相关的信号通路之一是非经典Wnt信号通路，也称为平面细胞极性（PCP）信号通路。在脊椎动物发育过程中研究平面细胞极性（PCP）信号作用的最佳部位之一是哺乳动物耳蜗。在小鼠耳蜗中，PCP信号通路的紊乱会破坏耳蜗的向外生长、细胞排列模式以及毛细胞的方向，而这些均受到纤毛功能障碍的影响。本实验方案的目标是通过表型分析、免疫组织化学和扫描电子显微镜技术，描述发育中哺乳动物耳蜗内PCP信号通路的分析方法。收敛与延伸缺陷表现为耳蜗管缩短和/或细胞排列模式改变，这些可在从小鼠突变体胚胎分离组织后进行定量分析。通过免疫荧光或扫描电子显微镜（SEM），可观察并量化静纤毛束的方向以及动纤毛的长度或位置变化。深入理解纤毛蛋白在细胞信号通路及其他生物学现象中的作用，对于揭示细胞与发育生物学机制，以及开发靶向治疗策略至关重要。

引言

初级纤毛是源自大多数哺乳动物细胞表面的、基于微管的细长突起结构。初级纤毛常与运动纤毛相混淆，后者每个细胞通常有多个，其功能是推动膜表面的液体流动。相比之下，初级纤毛主要发挥感觉功能，因此也被称为感觉纤毛。这一细胞器曾长期被忽视，但近年来由于其与多种人类遗传性疾病相关而被“重新发现”¹。作为理想的信号传导细胞器，初级纤毛已被证实可调控多种信号通路，其中许多通路不仅在组织稳态和疾病中具有重要作用，也在发育过程中发挥关键功能²。

最早被发现与纤毛功能障碍相关的信号通路之一是非经典Wnt信号通路，也称为平面细胞极性（PCP）通路³。该信号级联最初在果蝇中被鉴定，对胚胎发生至关重要，特别是对于细胞汇聚与延伸过程，以及上皮细胞在上皮平面上的正确取向⁴。一组核心调控蛋白的有序信号传递可将方向性信号转化为细胞骨架的重排，最终导致上皮细胞在平面上的协调极化⁵。汇聚与延伸过程对于耳蜗管的伸长以及正确的细胞模式排列是必不可少的⁶。由于这一过程通过PCP通路的激活来调控，因此耳蜗PCP突变体最显著的表型之一便是耳蜗管缩短并伴有感觉上皮组织紊乱⁷。类似地，缺乏纤毛的小鼠突变体也表现出类似的汇聚与延伸表型^8,9，但其具体调控机制仍有待阐明。

由于汇聚延伸过程对耳蜗管的外向生长以及耳蜗管内感觉上皮的细胞模式形成至关重要，因此发育中的耳蜗是研究脊椎动物发育过程中平面细胞极性（PCP）信号传导的理想器官。柯蒂器官（organ of Corti）是指衬于耳蜗管内的特化感觉上皮，由非感觉性的支持细胞和机械感觉毛细胞组成，这些毛细胞必须具有一致的方向性，耳蜗才能正常发挥功能¹⁰。机械感觉毛细胞得名于从每个感觉毛细胞的皮质板（顶端表面）延伸而出的静纤毛束¹¹。这些静纤毛是机械感觉的主要转换结构，尽管被称为“静纤毛”，但实际上是由基于肌动蛋白丝修饰而成的微绒毛构成。在每一个V形的毛束中，三排静纤毛以高度有序、规则的方式呈阶梯状排列。真正的基于微管的纤毛，即动纤毛（kinocilia），对于静纤毛束的发育和定向至关重要¹²。在每个毛细胞上，单个动纤毛物理性地附着于静纤毛束，位置靠近最高一排静纤毛的中央侧。动纤毛的确切功能尚不明确，一种假说是，在静纤毛由微绒毛成熟成形的过程中，动纤毛起到“牵引”作用，使其形成特定形态¹²。在脊椎动物中，耳蜗内的动纤毛仅短暂存在，在小鼠听力开始之前即从毛细胞上回缩^11,13,14。

在发育中的耳蜗中，纤毛的完全缺失会导致耳蜗管严重缩短、静纤毛束形态异常且方向紊乱，以及基体定位错误^8,9。功能性纤毛不仅包含纤毛轴丝结构，许多与纤毛功能相关的蛋白质还以复合物形式定位于纤毛相关的亚结构区域，如基体、过渡区或纤毛轴丝¹⁵。基体来源于中心粒中的母体中心粒，同时也是微管组织中心，可组织从纤毛向外延伸至细胞体的微管网络，并调控细胞内运输以及纤毛内的物质转运。纤毛过渡区是另一个调控纤毛功能的重要区域，负责调控纤毛组分的输入与输出过程¹⁶。

多项研究已发现纤毛与非经典Wnt信号通路（PCP信号）之间存在关联，但其确切机制尚不明确¹⁷。由于纤毛基因与PCP基因之间存在功能冗余，且细胞极性对普遍性细胞异常高度敏感，因此很难将某种突变直接与PCP特异性缺陷联系起来。PCP信号的一个读出指标是基体和初级纤毛的定位，因此区分初级缺陷与继发性缺陷具有挑战性。一些在斑马鱼和小鼠突变体中的研究则提示纤毛与Wnt信号通路之间可能并无关联^18-20。数据间的差异可能反映了不同物种、组织或时间依赖性因素下，纤毛在Wnt信号传导中所起作用的差异。此外，如果基体仍保持功能，正常的Wnt响应能力可能得以保留。深入理解纤毛蛋白在细胞信号通路及其他生物学现象中的作用，对于阐明细胞与发育生物学的基本规律，以及开发靶向治疗策略至关重要。

方案

根据机构和政府的指南与法规使用和实施安乐死，最常用的方法是通过吸入 CO₂ 并进行颈椎脱位。

1. 试剂的准备

注意：实验开始前，使用分析纯级试剂配制所有试剂。除非另有说明，均使用分子生物学级的蒸馏去离子水配制溶液。

1. 磷酸盐缓冲液（1× PBS)：通过溶解8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na₂HPO₄ 和 0.24 g KH₂PO₄ 在 1 L 的 H₂O. 用 HCl 将 pH 调至 7.4。PBS 无需灭菌，可于室温保存。注意：此缓冲液不含 CaCl₂ 或 MgCl₂.
2. 4% 多聚甲醛（PFA）溶液：在通风橱中，将40 g多聚甲醛粉末加入1 L 1×PBS中，配制4% PFA溶液。搅拌并加热至约60 °C以促进溶解，随后逐滴缓慢加入NaOH以提高pH值。待粉末完全溶解后，用HCl将pH值调至7.4。经0.45 µm滤膜过滤后，分装并冷冻保存。每次实验前使用新鲜解冻的分装液。
3. Triton缓冲液：将8.77 g NaCl溶解于1 L 0.1 M Tris-HCl（pH 7.5）溶液中，配制0.1 M Tris-HCl（pH 7.5）、0.15 M NaCl溶液，然后加入1 ml Triton X-100，搅拌至溶解。Triton缓冲液室温保存。
4. Triton封闭液：将1 ml山羊血清加入9 ml Triton缓冲液中，配制10%山羊血清的Triton封闭液。4 °C保存。若使用小鼠来源的一抗，在封闭步骤中向Triton封闭液中加入 Goat anti-mouse IgG Fab片段，稀释比例为1:200。
   注意：如果计划将样品用于扫描电子显微镜（SEM）观察，请准备以下所列的额外试剂。
5. 含钙和镁的汉克斯平衡盐溶液（Hanks' Balanced Salt Solution, HBSS）：通过将储存液用无菌蒸馏水稀释，配制1x的HBSS溶液。₂O. 由于HBSS缓冲液配制复杂且存在风险，建议订购预配的10倍浓缩液。常规使用的HBSS缓冲液终浓度如下：1.26 mM CaCl₂，0.49 mM MgCl₂-6H₂O，0.41 mM MgSO₄₄-7H₂O, 5.33 mM KCl, 0.44 mM KH₂PO₄，4.17 mM NaHCO₃₃，137.93 mM NaCl，0.34 mM Na₂HPO₄，5.56 mM 葡萄糖。
6. HEPES缓冲液：将23.8 g HEPES溶解于1 L 1×HBSS缓冲液中，配制0.1 M HEPES溶液。
7. 扫描电子显微镜固定液（SEM Fix）：通过将电镜级戊二醛（2.5%）和多聚甲醛（4%）溶于HEPES缓冲液中配制SEM用固定液。加入CaCl₂₂ 至终浓度为 10 mM。
8. 1% 四氧化锇（OsO₄）₄) 在 Hepes 缓冲液中；1% 四氧化锇水溶液：将四氧化锇储备液分别用 Hepes 缓冲液和无菌蒸馏水稀释₂O，使其终浓度为1%。四氧化锇具有高毒性，通常以4%溶液的形式出售。
9. 1% (w/v) 单宁酸：将 0.5 g 单宁酸溶解于 50 ml 无菌蒸馏 H₂O 中₂O. 通过0.45孔径滤器过滤除菌。
10. 梯度乙醇溶液系列：使用无菌蒸馏水将200 proof乙醇稀释₂O 配制 30%、50%、70%、90% 和 95% 的乙醇溶液。最终漂洗步骤需使用 100% 200 proof 乙醇。最终漂洗应使用新开封的 200 proof 乙醇瓶装试剂。

2. 组织选择

1. 最佳检测时间为胚胎发育第16.5天（E16.5）至出生后第3天（P3）之间的胚胎或幼崽。
   注意：随着小鼠的发育成熟，骨迷路和颞骨逐渐发生骨化，使得解剖操作变得愈发困难。此外，耳蜗毛细胞上唯一真正的微管构成的动纤毛（kinocilia）在发育过程中会回缩，在成年小鼠中已不存在。
2. 固定后，对成年小鼠耳蜗进行脱钙处理。将已解剖的（见第3节）骨迷路组织放入含有2 ml EDTA（PBS中4.13%，pH 7.3）的微量离心管中，在旋转仪上持续旋转处理3至4天，每天更换EDTA溶液。组织软化后，使用1.5 ml或更多PBS在旋转混合仪上以增强振荡条件清洗3次，每次5分钟 。

3. 耳蜗解剖

1. 通过颈椎脱位或吸入 CO₂（100% CO₂）实施安乐死后，取下头部。根据动物大小选择手术刀片或小型剪刀，从鼻部开始沿矢状中线向尾侧切开头部。用镊子从颅骨的每一侧取出脑组织。辨认颞骨，其内含有正在发育的内耳骨迷路（见图1A中的箭头所示）。
2. 在解剖显微镜下，使用镊子小心地将骨迷路从颅骨（颞骨）中分离出来。操作时，将镊子轻轻插入骨迷路下方，剥离周围的骨组织。对于出生后4天（P4）以内的动物，骨迷路仍主要为软骨性质，可较容易地完整取出而不破裂。
3. 解剖完成后，使用解剖镊的尖端清除卵圆窗和圆窗，并在耳蜗螺旋顶部打一个小孔。在进一步解剖耳蜗导管之前，先固定骨迷路。为便于后续撕裂膜的去除（见3.7），将骨迷路置于1.5 ml 4%多聚甲醛（PFA）中，冰上固定5分钟。
   注意：若无需去除撕裂膜，则建议延长固定时间（见4.1–4.3）。在解剖耳蜗导管前对颞骨进行短暂固定，有助于解剖过程及撕裂膜的去除。解剖完成并暴露柯蒂氏器后，需进行进一步固定。
4. 进一步解剖骨迷路以暴露耳蜗感觉上皮，步骤如下：将骨迷路置于含有PBS的黑色硅胶弹性体包被的解剖皿中，以利于操作。如需固定组织，可使用微型固定针。使用时，将针穿过骨迷路的前庭部分，使耳蜗螺旋的腹面朝上。
   注意：黑色硅胶弹性体皿的制备方法：将硅胶弹性体基础成分与炭粉混合，获得不透明的黑色；加入固化剂后倒入一个或多个培养皿（玻璃或塑料）中；在真空条件下干燥以去除夹带的气泡，使用前确保完全干燥。
5. 使用精细镊子（#5）去除外层软骨，暴露耳蜗导管。从卵圆窗开始，将镊子的尖端插入卵圆窗，轻轻撬开软骨，缓慢向上朝顶部方向移动。
6. 暴露耳蜗导管后，去除其腹侧表面——即前庭膜（Reissner's膜）。使用精细镊子在耳蜗导管基部夹住前庭膜，并向上剥离。此时可观察到耳蜗导管的背侧结构，包括感觉上皮。
7. 按以下方法去除撕裂膜（可选步骤）。若需对动纤毛或静纤毛束进行扫描电镜（SEM）或免疫组织化学分析，应去除撕裂膜。
8. 使用极精细的镊子（#55或更细）在耳蜗基部夹住撕裂膜，并向上朝顶部方向剥离。
   注意：撕裂膜呈光学透明状，难以直接观察。通常情况下，该膜会完整脱落；尽管不易看见，但在从暴露的柯蒂氏器上拉下时，可感受到一定的阻力。
9. 暴露柯蒂氏器后，按以下方法对组织进行进一步固定。保留前庭区域，以利于后续组织处理。

4. 固定

1. 对于常规免疫组织化学，将解剖出的骨迷路置于1.5 ml 4% PFA中，在4 °C下于摇床上固定2小时。
   注意：由于不同抗体和抗原的敏感性差异，固定的时间和成分可能需要调整，应针对每种抗体进行优化。
2. 固定后，用 1.5 ml 或更多的 PBS 洗涤样品，每次 5 分钟，共洗 3 次 在摇床上加大振荡强度进行处理。样品可在 PBS 中于 4 °C 保存数周后再进行处理。
3. 若准备用于扫描电镜（SEM）的样品，将解剖出的颞骨置于SEM固定液（见1.7）中固定2小时 在室温下，用1.5 ml或更多的HEPES缓冲液冲洗3次，每次5分钟，进行洗涤。 在摇床上加强振荡。储存于HEPES缓冲液中，4 °C保存，直至后续处理。不建议储存超过数周。

5. 免疫组织化学

1. 在平底96孔板的一个孔中对分离的样品进行免疫组织化学染色。也可使用PCR管或微量离心管。建议保留骨迷路的前庭部分，以利于后续处理。
2. 将组织在1.5 ml Triton缓冲液中孵育1小时，室温下置于振荡器上轻轻振荡，以进行组织通透处理。
3. 将组织在0.5 ml Triton封闭液中孵育，室温下至少1小时进行封闭。若使用小鼠来源的一抗，需在封闭液中加入抗小鼠IgG Fab片段，稀释比例为1:200（见第1.4节）。这可显著减少抗小鼠IgG在小鼠组织中的非特异性结合。
4. 将组织与用Triton封闭液稀释的一抗在4 °C下孵育过夜 ，并轻轻振荡。一抗的稀释比例取决于所用抗体（见第6.1节）。也可在室温下孵育2小时 。理想情况下，使用至少0.5 ml的一抗稀释液。若抗体有限，可使用能完全浸没组织的最小体积的一抗稀释液。
5. 用1.5 ml或更多Triton缓冲液在振荡器上充分冲洗组织，每次15分钟，至少洗涤3次，振荡强度适当提高。
6. 将组织与荧光染料标记的二抗在Triton封闭液中孵育1小时，室温下置于振荡器上，二抗稀释比例按厂家推荐浓度（通常为1:200–1:1,000）。使用至少0.5 ml的二抗稀释液体积。
   1. 使用前将稀释后的二抗在13,000 × g离心3分钟，以减少二抗聚集体的非特异性结合。从本步骤开始需避光操作，防止荧光染料发生光漂白。
7. 同第5.5步，用1.5 ml或更多Triton缓冲液在振荡器上充分冲洗组织，每次15分钟，至少洗涤3次，振荡强度适当提高。将样品保存在PBS中，4 °C储存，直至准备封片。

6. 抗体选择 

注意：推荐抗体的来源及其稀释比例详见特定材料与设备表。抗体孵育步骤请参照第5节所述进行。

1. 为了观察基于微管的动纤毛，可使用纤毛轴丝标记物，如抗Arl13b抗体（1:1,000）或抗乙酰化α-微管蛋白抗体（1:800）。使用抗γ-微管蛋白抗体（1:200）或其他中心体标记物来显示基体。
2. 为了观察富含肌动蛋白丝的静纤毛束，可在二抗孵育过程中加入与多种不同荧光染料偶联的鬼笔环肽（1:300 - 1,000）。鬼笔环肽还可标记其他丝状肌动蛋白结构，包括环绕每个上皮毛细胞周边的皮层肌动蛋白丝，有助于确定每个毛细胞的轮廓。如有需要，可使用其他膜标记物，如抗Zo-1抗体（1:500）。
3. 使用抗Myosin VI抗体（1:1,000）或抗Myosin VIIa抗体（1:1,000）对耳蜗毛细胞进行标记。在评估耳蜗长度时可使用这些抗体。

注意：使用针对显微镜需求优化的适当荧光染料标记的二抗。

7. 封片与成像

1. 将样本置于含有 PBS 的黑色硅胶弹性体培养皿中。使用精细镊子从耳蜗螺旋中分离前庭区域。
2. 极为小心地去除耳蜗螺旋下方的软骨和间充质。剩余的耳蜗螺旋包含内沟、柯蒂器官和外沟。
3. 将耳蜗螺旋转移至载玻片上的一滴 PBS 中。如需要，可将耳蜗螺旋分割成相当于一个回转的片段。但此步骤并非必需，且可能导致组织丢失。耳蜗毛细胞的顶端表面（静纤毛侧）应朝上，面向盖玻片。
4. 用吸水纸或滤纸轻轻吸去 PBS ，若上皮组织发生移位或重叠，可轻柔调整耳蜗螺旋的位置。
5. 直接在耳蜗样本上滴加一滴封片介质，并轻柔地盖上盖玻片，注意避免产生气泡。无需使用间隔垫片；将盖玻片直接置于样本上。推荐使用水溶性、非荧光、半永久性封片介质，该介质无需额外步骤即可固定盖玻片。封片介质和盖玻片厚度应与显微镜规格相匹配。
6. 使用配备高倍率（63 - 100X）、高数值孔径（1.2 - 1.4）物镜的落射荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜，拍摄耳蜗毛细胞顶端表面的图像。使用较低倍率物镜（5 - 20X）拍摄耳蜗螺旋的重叠图像，以定量分析耳蜗管的长度。根据所用二抗的荧光染料，匹配相应的激发激光和发射滤光片。

8. 扫描电子显微镜

1. 从第4.3节继续。在 Hepes 缓冲液中清洗扫描电镜固定的样品后，在通风条件下进行以下步骤。以下方案适用于耳蜗组织，并可避免使用溅射镀膜法涂覆导电金属。
2. 在含1% OsO₄的 Hepes 缓冲液中后固定1小时，随后用1 ml蒸馏水洗涤3次，每次5分钟。应使用刚好完全浸没组织的最小体积的 OsO₄ 溶液，以减少有毒废物的产生。无需振荡。
3. 在室温下，将样品依次置于以下各溶液中孵育1小时，每步之间用1 ml蒸馏水洗涤3次，每次5分钟：新配制并过滤的1%单宁酸水溶液；1% OsO₄ 水溶液；1%单宁酸水溶液；1% OsO₄ 水溶液。
4. 通过梯度乙醇系列对样品进行脱水处理，依次在下列浓度中各孵育10分钟：30%、50%、70%、90% 和 95%。无需振荡。
5. 将样品转移至无水乙醇（使用新开封的200 proof乙醇瓶装）中，共更换三次，每次5分钟 。
6. 按照制造商说明书，使用临界点干燥仪对样品进行处理。
7. 在电子显微镜成像前，使用导电碳胶将样品固定于扫描电镜样品台表面。在体视显微镜下，使用精细镊子和画笔轻轻调整样品位置，使耳蜗上皮面朝上。利用样品的前庭部分将组织“锚定”在样品台上。将样品存放在干燥器中直至成像。扫描电镜成像操作参见 Jones (2012)²¹。

9. 定量分析

1. 完成免疫组织化学制备后，使用落射荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜采集图像。完成扫描电镜（SEM）制备后，使用扫描电子显微镜对样品进行成像。对耳蜗器的顶面进行成像，以观察暴露的耳蜗毛细胞及嵌入的支持细胞。
2. 定义耳蜗导管上的特定位置，例如从基底部起始的25%、50%和75%处，并利用这些位置比较突变体与对照样本之间的耳蜗区域差异。将纤毛突变体与其同窝出生的对照个体进行分析和比较，因为遗传背景的差异可能影响耳蜗表型。
   注意：耳蜗器的发育呈梯度模式，从中部基底向顶端和基底两端延伸。在小鼠中，发育过程直至出生后第14天（P14）才完成，因此必须比较处于相似发育阶段和位置的区域。
3. 使用显微镜配套软件拍摄图像，以便根据需要对特定表型进行定量分析（见下文）。使用Image J等图像分析软件或显微镜自带软件，测量长度、计数细胞并确定蛋白定位，具体方法如下所述。将这些数据以柱状图、散点图、箱线图或直方图形式呈现，比较突变体与对照组。
4. 耳蜗导管总长度（图3A）：
   1. 使用毛细胞标记物或鬼笔环肽（标记静纤毛束），确定并测量感觉上皮的起始与终止位置。耳蜗导管长度在纤毛突变体中常出现缩短。
5. 静纤毛束异常（图3B,D,E,G）：
   1. 测量静纤毛束的凸度（高度），即静纤毛束顶点到穿过其两侧“臂”末端连线之间的最短距离，如图3G左侧所示。或者，量化外毛细胞静纤毛束两臂所包围的面积，如图3G右侧所示。若可识别出具有圆形静纤毛束的毛细胞，将其占总毛细胞数的百分比进行统计。
      注意：在许多纤毛突变体中，无论静纤毛束的方向如何，均可观察到其结构异常。准确量化静纤毛束异常较为困难。
6. 静纤毛束方向性（图3B,C,G）：
   1. 评估每个静纤毛束相对于垂直于分隔内毛细胞与外毛细胞的柱细胞排所延伸直线的方向。正常方向的细胞沿此垂直轴对齐，因此旋转角度为0°。使用360°记法或以相对于0°的绝对偏差值来确定旋转角度。
7. 动纤毛位置或静纤毛束位置（图3B,F,H）：
   1. 统计动纤毛缺失的细胞所占百分比。测量动纤毛至静纤毛束“顶点”或中心的距离。当静纤毛束异常时，“顶点”可能难以界定，此时可改用束的中心作为参考点。
8. 通过在每个毛细胞上叠加位置网格，并标记动纤毛基部或静纤毛束顶点/中心的位置，来量化动纤毛和静纤毛束在毛细胞顶面的分布。将数据表示为各分类在网格特定区域内所占百分比，并将所有标记位置叠加至同一位置网格上进行展示。
   注意：在对照组织中，动纤毛始终附着于静纤毛束的顶点。而在纤毛突变体中，动纤毛常出现缺失、错位但仍附着，甚至完全脱离静纤毛束的情况。
9. 动纤毛长度（图3I）：
   1. 使用纤毛轴丝标记物对动纤毛进行标记，并测量其长度。仅测量位于1.5 µm共聚焦平面内且呈平展状态的动纤毛。通过观察扫描组织的横截面视图确认纤毛是否平展。由于动纤毛在发育过程中会回缩，因此应比较相同耳蜗区域、年龄匹配的样本。
10. 极性蛋白的错位定位：
    1. 使用针对极性蛋白（如Vangl2和Gαi3）的抗体进行免疫组织化学染色后，通过成像确定其定位情况。

注意：在某些纤毛突变体中，极性蛋白的定位会受到破坏。其中包括Vangl2和Gαi3，已有研究表明，在Ift20、Bbs8和Bbs6突变型耳蜗中，这些蛋白的定位出现异常。

注意：有关如何定量和展示毛细胞极性的更多示例，可参见以下论文。Curtin 等（2003）《当代生物学》²²，Montcouquiol 等（2003）Nature⁷，Wang 等（2006）《神经科学杂志》²³，Montcouquiol 等（2008）《分子生物学方法》²⁴，May-Simera 等（2012）《分子生物学方法》²⁵，尹等（2012）PloS one ²⁶.

结果

耳蜗解剖与组织制备

在取出脑组织后，对 P0 小鼠头部进行正中矢状面解剖，从后方可见骨性迷路（图 1A，白色箭头所示），并可将其取出。图 1B 显示分离出的骨性迷路，左侧为耳蜗毛细胞面向上、腹侧朝上，右侧为从后方观察的背侧视图。白色箭头指向卵圆窗，由此处可开始去除外层软骨。一旦外层软骨完全去除，即可观察到暴露的耳蜗管，仍保持完整（图 1C）。图中显示通过前庭区域插入大头针以辅助解剖的操作；也可使用两枚从不同角度插入的大头针固定组织。图 1D 显示去除前庭膜和盖膜后的耳蜗管（左侧），以及从前庭区域分离后的耳蜗上皮螺旋体，用于免疫组织化学染色前的封片准备（右侧）。为大致展示暴露的耳蜗毛细胞形态，图 1E 显示了一个完整的扫描电镜制备样本。

讨论

在准备耳蜗组织进行分析时，需注意以下几个关键点。首先，遗传背景的差异可能改变耳蜗表型，因此必须仅对同窝出生的对照动物进行分析和比较。其次，为了在免疫组织化学染色中获得最佳图像，并满足扫描电镜（SEM）的要求，必须完全去除前庭膜（tectorial membrane）。前庭膜是一种不透明结构，会遮挡其下方感觉上皮细胞，增加成像难度。尽管在处理过程中前庭膜有时会自行收缩，暴露出毛细胞，但即便如此，仍强烈建议将其彻底清除。该步骤需要耐心和熟练的操作技巧。第三，使用针对纤毛蛋白（尤其是定位于高度致密基体的蛋白）的抗体进行免疫组织化学染色可能具有挑战性，需要优化实验条件。可考虑进行抗原修复、增强透化步骤，或降低固定剂浓度或缩短固定时间。最后，在对动纤毛（kinocilium，即耳蜗毛细胞上的初级纤毛）进行成像时，需注意其从出生后第0天（P0）至第1天（P1）开始，沿耳蜗基部至顶部的方向逐渐回缩。因此，在测量动纤毛长度时，应比较相同耳蜗区域且年龄匹配的动物样本中的毛细胞。此外，中间支持细胞也具有不会回缩的初级纤毛，在观察时必须仔细区分支持细胞的纤毛与毛细胞的动纤毛。

随着小鼠的成熟，由于颞骨和...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
工具/设备
硅胶弹性体 - Sylgard 184	Sigma-Aldrich	761028-5EA	参见注释2
直刃显微解剖剪	Various
精细镊子（编号5和55）及钝头镊子	Various
解剖显微镜	Various
未包被的玻璃载玻片	Various
显微镜盖玻片（22 mm × 40 mm × 0.15 mm）	Various
移液管	Various
微量固定针（Minutien pins）	Fine Science Tools	26002-10
扫描电镜样品台	tousimis	8762
扫描电镜样品钉	TED PELLA	16111
PELCO导电胶片：碳导电胶	TED PELLA	16084-3
荧光显微镜	Various
临界点干燥仪	Various
扫描电子显微镜	Various
玻璃载玻片	Various
玻璃盖玻片	Various
Kimwipe擦拭纸	Various
细毛画笔
试剂
1× 磷酸盐缓冲液（PBS）	Gibco/Life Technologies	10010023
多聚甲醛 （PFA）（电镜用需EM级）	Various		每次使用前用1× PBS新鲜配制4%溶液。电镜用需EM级。
2.5% 戊二醛一级品	Sigma-Aldrich	G5882
Tris-HCl（pH 7.5）	Various
NaCl	Various
CaCl₂	Various
吐温X-100（Triton X-100）	Various
正常山羊血清	Various
AffiniPure Fab片段驴抗小鼠IgG（H+L）	Jackson ImmunoResearch	715-007-003
Fluoromount-G封片剂	SouthernBiotech	0100-01
10× Hanks’平衡盐溶液（HBSS）	Gibco/Life Technologies	14065
Hepes	Gibco/Life Technologies	15630-080
四氧化锇（OsO₄）	Sigma-Aldrich/Fluka Analytical	75632
单宁酸	Sigma-Aldrich	403040
200 proof乙醇	Various
抗体
抗Arl13b抗体	Protein Tech	17711-1-AP	建议稀释比例 1:1,000
抗乙酰化微管蛋白抗体（611-B1）	Sigma-Aldrich	T6793	建议稀释比例 1:800
抗γ-微管蛋白抗体（GTU-88）	Sigma-Aldrich	T6557	建议稀释比例 1:200
抗Zo_1 抗体	Invitrogen	40-2300	建议稀释比例 1:500
Myosin VI抗体	Proteus Biosciences	25-6791	建议稀释比例 1:1000
Myosin VIIa抗体	Proteus Biosciences	25-6790	建议稀释比例 1:1,000
抗Vangl2抗体	Merk Millipore	ABN373	建议稀释比例 1:250
抗Gαi3抗体	Sigma-Aldrich	G4040	建议稀释比例 1:250
Alexa Fluor® 488鬼笔环肽	Invitrogen/Life Technologies	A12379	建议稀释比例 1:300 - 1,000
Alexa Fluor® 568鬼笔环肽	Invitrogen/Life Technologies	A12380	建议稀释比例 1:300 - 1,000