从小鼠耳部和尾部组织制备原代成纤维细胞培养物

摘要

我们介绍一种从实验小鼠耳朵和尾巴中分离原代成纤维细胞的简单且快速的实验方法。该方法无需特殊的动物操作训练，且可用于从室温下保存长达10天的耳组织中建立成纤维细胞培养。

摘要

原代细胞直接来源于组织，被认为更能代表细胞的生理状态 体内 相较于已建立的细胞系，原代细胞更接近体内状态。然而，原代细胞培养通常寿命有限，需要频繁重新制备。成纤维细胞是一种易于获取的原代细胞来源。本文介绍一种简单快速的实验方法，用于从小鼠耳部和尾部组织建立原代成纤维细胞培养。该方案适用于在室温下保存长达10天的耳部组织建立原代成纤维细胞培养。只要严格按照本方案操作，即使使用非无菌状态且长期储存的组织，污染也极不可能发生。成纤维细胞在体外培养中增殖迅速，可在发生复制性衰老前扩增至大量细胞。

引言

原代细胞来源于活体组织，并在体外进行培养 体外 条件。通常认为，与永生化细胞系或肿瘤细胞系相比，原代细胞在生理状态和遗传背景上更接近其来源组织¹因此，原代细胞是研究生物学问题的有用模型^2,3然而，与可无限增殖的已建立细胞系不同，原代细胞在培养中最终会进入衰老状态，需要频繁重新制备。

常用的原代细胞包括成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、T细胞、B细胞、骨髓来源的巨噬细胞（BMDM）和骨髓来源的树突状细胞（BMDC）。成纤维细胞常被用作原代细胞培养模型，相较于其他原代细胞具有显著优势。细胞培养易于建立，易于维持，且在培养前无需对细胞进行纯化。它们具有较快的初始增殖能力，且无需特殊培养基或激活方案。成纤维细胞可通过生物、化学和物理方法高效转染^4,5。在建立细胞培养前，耳组织可在室温下保存长达10天。成纤维细胞培养有利于观察细胞质内的动态过程，并适用于重编程为诱导性多能干细胞（iPS细胞）⁶。

成纤维细胞是结缔组织中的重要细胞，可分泌胶原蛋白和细胞外基质⁷。它们为多种组织提供结构支架⁸，并在伤口愈合和组织修复过程中发挥关键作用^9,10。

本文介绍一种简单快速（<4 小时）从小鼠耳部和尾部建立成纤维细....

方案

小鼠饲养于无病原体环境中，直至实施安乐死，此过程均遵循机构相关指南（新加坡国立大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）指南以及国家实验动物研究咨询委员会（NACLAR）指南）。

1. 小鼠

1. 订购一只合适遗传背景的小鼠。本方案基于来自一只 C57BL/6 小鼠的组织。

2. 完全培养基的制备

1. 通过向RPMI 1640培养基中添加以下组分来制备完全培养基：10% 胎牛血清（FCS）、50 µM 2-巯基乙醇、100 µM 天冬酰胺、2 mM 谷氨酰胺、1% 青霉素-链霉素溶液。

3. 酶溶液的制备

1. 在15 ml锥底管中配制胶原酶D溶液。
   1. 称取10 mg胶原酶D，溶于4 ml完全培养基中。
2. 在1.7 ml微量离心管中配制蛋白酶K溶液。
   1. 称取10 mg蛋白酶K。
   2. 加入5 µl 的1 M Tris缓冲液（pH 8.0），再加入1 µl 的0.5 M EDTA（pH 8.0）。
   3. 用无菌水定容至494 µl 。
   4. 将蛋白酶K溶液置于37 °C水浴中孵育30分钟。

结果

从组织中提取成纤维细胞会导致产生大量组织碎片（图1）。与组织碎片不同，成纤维细胞在培养第1至第3天期间会贴附于组织培养用塑料表面。成纤维细胞培养物的培养基可在培养第3天安全更换，这将显著降低培养物中残留的碎片水平（图2）。成纤维细胞呈现细长的形态，并具有清晰可见的细胞质（图1和图2）。从培养第3天起应可见有丝分裂细胞，且细胞在培养3至4天内应达到70–80%的融合度。在培养第3天，耳部和尾部组织在10 cm培养皿中的细胞产量分别为4至5 × 10⁵（耳部）和5至6 × 10⁵个细胞（尾部）。在成纤维细胞分离后的第3天起，可将细胞传代并以每10 cm培养皿2 × 10⁵个细胞的密度接种。

在室温下保存10天的耳组织中提取成纤维细胞，培养5至6天后应达到70-80%的细胞融合度（图3）。在培养第5天后，以每10 cm培养皿2 × 10⁵个细胞的密度接种，培养3至4天.......

讨论

本文提供了一种简单、经济且快速的实验方法，用于从小鼠耳部和尾部建立原代成纤维细胞培养。组织分离后3天内即可获得贴壁且快速分裂的成纤维细胞。原代细胞的一个重要局限性是会出现衰老现象，即永久性生长停滞¹⁵。采用本方案，成纤维细胞在出现衰老特征前可传代5至6次，衰老特征包括细胞变扁平、体积增大（增加2-3倍）以及无法继续扩增。

在分离成纤维细胞时，必须注意组织的破碎过程，因为切割或消化不充分会导致成纤维细胞回收率降低。可以将耳部和尾部的成纤维细胞合并，以增加成纤维细胞的数量。还可采用相同方法处理其他组织（如腹膜和肺组织），以进一步增加成纤维细胞数量。尽管在提取成纤维细胞后培养物中可能存在碎片，但建议在第三天之后再更换培养基，因为成纤维细胞需要一定时间才能贴附于细胞培养皿上。

该方案的一个潜在局限性在于使用了非无菌组织，因而存在微生物污染的可能性。为降低污染风险，在收获成纤维细胞前，将耳朵和尾巴组织在70%乙醇中孵育。此外，在原代培养中加入抗真菌剂两性霉素B，以防止酵母菌和真菌的生长，这在建立成纤维细胞培养时是一.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RPMI-1640	HyClone	SH30027.01
胎牛血清	HyClone	SV30160.03
2-巯基乙醇	Sigma-Aldrich	M3148
天冬酰胺	Sigma-Aldrich	A4159
谷氨酰胺	Sigma-Aldrich	G8540
青霉素/链霉素	HyClone	SV30010
乙醇	Merck Millipore	107017	分析纯，绝对乙醇
胶原酶D	Roche Diagnostics	11088866001	来自Clostridium histolyticum，冻干粉，非无菌
蛋白酶Pronase	Merck Millipore	53702	来自Streptomyces griseus
Tris缓冲液（pH 8）	1st BASE	1415	超纯级
0.5M EDTA（pH 8）	1st BASE	BUF-1053	生物技术级
10X磷酸盐缓冲液（PBS）	1st BASE	BUF-2040-10X4L	超纯级
胰蛋白酶-EDTA溶液 10X	Sigma-Aldrich	59418C-100ML	含0.5%胰蛋白酶，0.2% EDTA，经SER-TAIN工艺γ射线灭菌，不含酚红，溶于生理盐水
两性霉素B	Sigma-Aldrich	A2492-20ml	250 μg/ml，溶于去离子水，经无菌过滤
剪刀	Aesculap
镊子	Aesculap	AE-BD312R
0.2 μM注射器滤器	Sartorius Stedim	16534
70 μM细胞筛	SPL	93070
注射器活塞	Terumo	SS+10L
冻存管	NUNC	368362
1.7 ml 微量离心管	Axygen	MCT-175-C
10 cm 细胞培养皿	Greiner	664160	细胞培养处理培养皿
15 ml 锥底离心管	Greiner	188271
50 ml 锥底离心管	Greiner	227261
水浴锅	GFL	1002
离心机	Eppendorf	5810R
恒温振荡培养箱	Sartorius Stedim		Certomat-BS1
蔡司Axiovert 25倒置光学显微镜	Carl Zeiss AG