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方法文章

从小鼠耳部和尾部组织制备原代成纤维细胞培养物

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DOI：

10.3791/53565

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2016年1月10日

 , 
1Immunology Program, Department of Microbiology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2NUS Graduate School for Integrative Sciences and Engineering, National University of Singapore

本文内容

摘要

我们介绍一种从实验小鼠耳朵和尾巴中分离原代成纤维细胞的简单且快速的实验方法。该方法无需特殊的动物操作训练，且可用于从室温下保存长达10天的耳组织中建立成纤维细胞培养。

摘要

原代细胞直接来源于组织，被认为更能代表细胞的生理状态 体内 相较于已建立的细胞系，原代细胞更接近体内状态。然而，原代细胞培养通常寿命有限，需要频繁重新制备。成纤维细胞是一种易于获取的原代细胞来源。本文介绍一种简单快速的实验方法，用于从小鼠耳部和尾部组织建立原代成纤维细胞培养。该方案适用于在室温下保存长达10天的耳部组织建立原代成纤维细胞培养。只要严格按照本方案操作，即使使用非无菌状态且长期储存的组织，污染也极不可能发生。成纤维细胞在体外培养中增殖迅速，可在发生复制性衰老前扩增至大量细胞。

引言

原代细胞来源于活体组织，并在体外进行培养 体外 条件。通常认为，与永生化细胞系或肿瘤细胞系相比，原代细胞在生理状态和遗传背景上更接近其来源组织1因此，原代细胞是研究生物学问题的有用模型2,3然而，与可无限增殖的已建立细胞系不同，原代细胞在培养中最终会进入衰老状态，需要频繁重新制备。

常用的原代细胞包括成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、T细胞、B细胞、骨髓来源的巨噬细胞（BMDM）和骨髓来源的树突状细胞（BMDC）。成纤维细胞常被用作原代细胞培养模型，相较于其他原代细胞具有显著优势。细胞培养易于建立，易于维持，且在培养前无需对细胞进行纯化。它们具有较快的初始增殖能力，且无需特殊培养基或激活方案。成纤维细胞可通过生物、化学和物理方法高效转染4,5。在建立细胞培养前，耳组织可在室温下保存长达10天。成纤维细胞培养有利于观察细胞质内的动态过程，并适用于重编程为诱导性多能干细胞（iPS细胞）6。

成纤维细胞是结缔组织中的重要细胞，可分泌胶原蛋白和细胞外基质7。它们为多种组织提供结构支架8，并在伤口愈合和组织修复过程中发挥关键作用9,10。

本文介绍一种简单快速（<4 小时）从小鼠耳部和尾部建立成纤维细胞培养物的方案11。该方案获取组织所需的小鼠操作经验极少（与其他方案12,13相比），并可用于建立从小鼠耳部组织中分离的培养物，这些组织可在室温下保存于培养基中长达10天。

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方案

小鼠饲养于无病原体环境中，直至实施安乐死，此过程均遵循机构相关指南（新加坡国立大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）指南以及国家实验动物研究咨询委员会（NACLAR）指南）。

1. 小鼠

  1. 订购一只合适遗传背景的小鼠。本方案基于来自一只 C57BL/6 小鼠的组织。

2. 完全培养基的制备

  1. 通过向RPMI 1640培养基中添加以下组分来制备完全培养基：10% 胎牛血清（FCS）、50 µM 2-巯基乙醇、100 µM 天冬酰胺、2 mM 谷氨酰胺、1% 青霉素-链霉素溶液。

3. 酶溶液的制备

  1. 在15 ml锥底管中配制胶原酶D溶液。
    1. 称取10 mg胶原酶D，溶于4 ml完全培养基中。
  2. 在1.7 ml微量离心管中配制蛋白酶K溶液。
    1. 称取10 mg蛋白酶K。
    2. 加入5 µl 的1 M Tris缓冲液（pH 8.0），再加入1 µl 的0.5 M EDTA（pH 8.0）。
    3. 用无菌水定容至494 µl 。
    4. 将蛋白酶K溶液置于37 °C水浴中孵育30分钟。

4. 胶原酶D-蛋白酶混合液的制备（≤2条尾）

注意：后续步骤需在无菌细胞培养罩内进行。

  1. 向 4 ml 胶原酶 D 溶液中加入 250 µl 蛋白酶溶液。
  2. 将胶原酶 D 与蛋白酶的混合液通过 0.2 µm 注射器滤器，滤入无菌的 15 ml 锥底离心管中。

5. 从耳部和尾部组织中提取成纤维细胞

  1. 根据相应的机构指南对小鼠实施安乐死。
  2. 将已灭菌的手术器械（剪刀和镊子）放入细胞培养超净台中。
  3. 向两个10 cm细胞培养皿中各加入10 ml完全培养基。
  4. 用剪刀剪取小鼠耳朵（约1 cm半径）和尾部末端5 cm，在无菌50 ml锥底离心管中用40 ml 70%乙醇浸泡5分钟 。
  5. 将耳朵和尾部组织置于开放的10 cm细胞培养皿中，在超净台内风干5分钟。干燥后，将耳组织和尾组织分别转移至两个标记为"耳朵"和"尾部"的培养皿中，每个培养皿含10 ml完全培养基，操作如步骤5.3所述。
  6. 使用剪刀去除耳朵和尾部组织上的毛发。
  7. 用剪刀将耳朵和尾部组织剪成小于3 mm大小的碎片。
  8. 将剪碎的组织转移至标记为"耳朵"和"尾部"的1.8 ml冻存管中，并加入足够的胶原酶D-蛋白酶溶液，使液体体积达到冻存管上的1.8 ml刻度线。
  9. 将冻存管水平放置于摇床上，于37 °C以200 rpm振荡90分钟 。
  10. 90分钟 孵育后，从摇床上取出冻存管并置于超净台中。
  11. 向两个分别标记为"耳朵"和"尾部"的10 cm细胞培养皿中各加入10 ml完全培养基，并在每个培养皿中放置一个70 µm细胞筛网。
  12. 将消化后的耳组织和尾组织放入步骤5.11中相应标记的培养皿中的70 µm细胞筛网上，使用10 ml注射器活塞用力研磨组织超过>5分钟。期间偶尔晃动细胞筛网，使细胞充分洗入培养基中。
  13. 将每个培养皿中的细胞悬液用移液器转移至两个标记为"耳朵"和"尾部"的15 ml锥底离心管中。用额外的10 ml完全培养基冲洗培养皿和筛网，并将冲洗液加入相应的15 ml锥底离心管中。
  14. 使用冷藏细胞离心机在约580 x g、4 °C条件下离心7分钟 ，使细胞沉淀。
  15. 弃去上清液，向15 ml锥底离心管中的细胞沉淀加入10 ml完全培养基，并重悬细胞。
  16. 重复步骤5.14和5.15。

6. 细胞混合物的培养

  1. 移除上清液，确保细胞沉淀物不受扰动。
  2. 将细胞重悬于 10 ml 完全培养基中，并将相应混合物分别加入两个标记为 "ears" 和 "tail" 的 10 cm 细胞培养皿中。
  3. 向培养物中加入 10 µl 两性霉素 B 溶液（储存液：250 µg/ml）。
  4. 将细胞置于 37 °C、含 5% CO2 的湿润培养箱中孵育。
  5. 第三天，更换为含 10 µl 两性霉素 B 的 10 ml 新鲜完全培养基，以去除碎片（图 1 和 图 2）。

7. 成纤维细胞的传代培养

  1. 当细胞培养至约70%融合度（培养第3-4天）时，移除培养基，并用5 ml无菌1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。
  2. 移除PBS，向细胞中加入2 ml无菌1×胰蛋白酶-EDTA溶液。
  3. 将细胞置于37 °C、含5% CO2的湿润化培养箱中孵育5 min 。
  4. 5分钟后，轻轻敲击培养皿，向细胞中加入6 ml完全培养基。
  5. 将细胞悬液转移至15 ml锥底离心管中，在4 °C条件下，使用冷藏细胞离心机以约450 × g离心5 min 。
  6. 弃去上清液，并用5 ml完全培养基轻柔重悬细胞沉淀。
  7. 在10 cm细胞培养皿中接种2 × 105个细胞，并在37 °C、含5% CO2的湿润化培养箱中培养3-4天，之后重复步骤7.1至7.6。

8. 耳组织样品的运输前准备

注意：后续步骤需在无菌细胞培养罩内进行。

  1. 根据相关机构指南对小鼠实施安乐死。
  2. 将已灭菌的剪刀和镊子放入细胞培养操作台中。
  3. 向一个50 ml锥底离心管中加入50 ml完全培养基。
  4. 用剪刀剪下小鼠耳朵（约1 cm半径）。
  5. 用镊子将耳朵转移至步骤3中准备好的50 ml锥底离心管中。
  6. 用封口膜密封50 ml锥底离心管，随后置于适当的包装盒中，室温条件下运输。

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结果

从组织中提取成纤维细胞会导致产生大量组织碎片（图1）。与组织碎片不同，成纤维细胞在培养第1至第3天期间会贴附于组织培养用塑料表面。成纤维细胞培养物的培养基可在培养第3天安全更换，这将显著降低培养物中残留的碎片水平（图2）。成纤维细胞呈现细长的形态，并具有清晰可见的细胞质（图1和图2）。从培养第3天起应可见有丝分裂细胞，且细胞在培养3至4天内应达到70–80%的融合度。在培养第3天，耳部和尾部组织在10 cm培养皿中的细胞产量分别为4至5 × 105（耳部）和5至6 × 105个细胞（尾部）。在成纤维细胞分离后的第3天起，可将细胞传代并以每10 cm培养皿2 × 105个细胞的密度接种。

在室温下保存10天的耳组织中提取成纤维细胞，培养5至6天后应达到70-80%的细胞融合度（图3）。在培养第5天后，以每10 cm培养皿2 × 105个细胞的密度接种，培养3至4天...

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讨论

本文提供了一种简单、经济且快速的实验方法，用于从小鼠耳部和尾部建立原代成纤维细胞培养。组织分离后3天内即可获得贴壁且快速分裂的成纤维细胞。原代细胞的一个重要局限性是会出现衰老现象，即永久性生长停滞15。采用本方案，成纤维细胞在出现衰老特征前可传代5至6次，衰老特征包括细胞变扁平、体积增大（增加2-3倍）以及无法继续扩增。

在分离成纤维细胞时，必须注意组织的破碎过程，因为切割或消化不充分会导致成纤维细胞回收率降低。可以将耳部和尾部的成纤维细胞合并，以增加成纤维细胞的数量。还可采用相同方法处理其他组织（如腹膜和肺组织），以进一步增加成纤维细胞数量。尽管在提取成纤维细胞后培养物中可能存在碎片，但建议在第三天之后再更换培养基，因为成纤维细胞需要一定时间才能贴附于细胞培养皿上。

该方案的一个潜在局限性在于使用了非无菌组织，因而存在微生物污染的可能性。为降低污染风险，在收获成纤维细胞前，将耳朵和尾巴组织在70%乙醇中孵育。此外，在原代培养中加入抗真菌剂两性霉素B，以防止酵母菌和真菌的生长，这在建立成纤维细胞培养时是一...

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披露

作者声明不存在经济利益冲突。

致谢

本工作由 NRF 资助项目 HUJ-CREATE - 炎症的细胞与分子机制支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
RPMI-1640HyCloneSH30027.01
胎牛血清HyCloneSV30160.03
2-巯基乙醇Sigma-AldrichM3148
天冬酰胺Sigma-AldrichA4159
谷氨酰胺Sigma-AldrichG8540
青霉素/链霉素HyCloneSV30010
乙醇Merck Millipore107017分析纯，绝对乙醇
胶原酶DRoche Diagnostics11088866001来自Clostridium histolyticum，冻干粉，非无菌
蛋白酶PronaseMerck Millipore53702来自Streptomyces griseus 
Tris缓冲液（pH 8）1st BASE1415超纯级
0.5M EDTA（pH 8）1st BASEBUF-1053生物技术级
10X磷酸盐缓冲液（PBS）1st BASEBUF-2040-10X4L超纯级
胰蛋白酶-EDTA溶液 10XSigma-Aldrich59418C-100ML含0.5%胰蛋白酶，0.2% EDTA，经SER-TAIN工艺γ射线灭菌，不含酚红，溶于生理盐水
两性霉素BSigma-AldrichA2492-20ml250 μg/ml，溶于去离子水，经无菌过滤
剪刀Aesculap
镊子AesculapAE-BD312R
0.2 μM注射器滤器Sartorius Stedim16534
70 μM细胞筛SPL93070
注射器活塞TerumoSS+10L
冻存管NUNC368362
1.7 ml 微量离心管AxygenMCT-175-C
10 cm 细胞培养皿Greiner664160细胞培养处理培养皿 
15 ml 锥底离心管Greiner188271
50 ml 锥底离心管Greiner227261
水浴锅GFL1002
离心机Eppendorf5810R
恒温振荡培养箱Sartorius StedimCertomat-BS1
蔡司Axiovert 25倒置光学显微镜Carl Zeiss AG

参考文献

  1. Fitzpatrick, L. E., McDevitt, T. C. Cell-derived matrices for tissue engineering and regenerative medicine applications. Biomater Sci. 3 (1), 12-24 (2015).
  2. Elenbaas, B., et al. Human breast cancer cells generated by oncogenic transformation of primary epithelial cells. Genes Dev. 15 (1), 50-65 (2001).
  3. Stansley, B., Post, J., Hensley, K. A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer's disease. J Neuroinflammation. 9 (1), 115(2012).
  4. Lim, J., Dobson, J. Improved transfection of HUVEC and MEF cells using DNA complexes with magnetic nanoparticles in an oscillating field. J Genet. 91 (2), 223-227 (2012).
  5. Li, M., et al. High-efficiency transduction of fibroblasts and mesenchymal stem cells by tyrosine-mutant AAV2 vectors for their potential use in cellular therapy. Hum Gene Ther. 21 (11), 1527-1543 (2010).
  6. Patel, M., Yang, S. Advances in reprogramming somatic cells to induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 6 (3), 367-380 (2010).
  7. Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell luman formation. Mol Biol Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).
  8. Ohlund, D., Elyada, E., Tuveson, D. Fibroblast heterogeneity in the cancer wound. J Exp Med. 211 (8), 1503-1523 (2014).
  9. Guo, S., Dipietro, L. A. Factors affecting wound healing. J Dent Res. 89 (3), 219-229 (2010).
  10. Werner, S., Krieg, T., Smola, H. Keratinocyte-fibroblast interactions in wound healing. J Invest Dermatol. 127 (5), 998-1008 (2007).
  11. Shen, Y. J., et al. Genome-derived cytosolic DNA mediates type I interferon-dependent rejection of B cell lymphoma cells. Cell Rep. 11 (3), 460-473 (2015).
  12. Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, A. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. J Vis Exp. (44), (2010).
  13. Baglole, C. J., et al. Isolation and phenotypic characterization of lung fibroblasts. Methods Mol Med. 117, 115-127 (2005).
  14. Alt, E., et al. Fibroblasts share mesenchymal phenotypes with stem cells, but lack their differentiation and colony-forming potential. Biol Cell. 103 (4), 197-208 (2011).
  15. Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. The essence of senescence. Genes Dev. 24 (22), 2463-2479 (2010).
  16. Lander, M. R., Moll, B., Rowe, W. P. A procedure for culture of cells from mouse tail biopsies: brief communication. J Natl Cancer Inst. 60 (2), 477-478 (1978).
  17. Moore, C. B., Allen, I. C. Primary ear fibroblast derivation from mice. Methods Mol Biol. (1031), 65-70 (2013).
  18. Liu, J., et al. Generation of stable pluripotent stem cells from NOD mouse tail-tip fibroblasts. Diabetes. 60 (5), 1393-1398 (2011).

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