介绍了一种利用基因编码的电压指示剂对膜电位变化进行成像的方法。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
基因编码的电压指示剂（GEVIs）已得到显著改进，目前已逐步可用于 体内 记录。虽然最终目标是成像神经元活动 体内，必须能够对单个细胞的活动进行成像，以确保体内实验准备的成功。本实验方案将介绍如何对单个细胞的膜电位进行成像，为最终实现活体成像提供基础 体内在此，我们描述了成像基因编码电压指示剂（GEVIs）的方法，该指示剂由一个电压感应结构域与单个荧光蛋白（FP）或一对可进行荧光共振能量转移（FRET）的荧光蛋白融合而成。 体外使用图像分光器可将由两种不同波长产生的图像同时投射到同一个电荷耦合器件（CCD）相机上。图像分光器在光路中放置第二个滤光立方体，该立方体包含一个二向色镜和两个发射滤光片，用于根据GEVI所用的荧光蛋白（FPs）分离供体和受体的荧光波长。此配置可在通过全细胞膜片钳技术操控膜电位的同时，实现对受体和供体荧光信号的同步记录。当使用的GEVI仅包含单一荧光蛋白时，可移除第二个滤光立方体，使图像分光器内的镜面将单一图像投射至CCD相机。
引言
本文的主要目的是展示膜电位变化的光学成像 体外 使用基因编码的荧光蛋白。对膜电位变化进行成像为研究神经元环路的活动提供了令人振奋的可能性。当膜电位的变化引起荧光强度的改变时，相机的每个像素都可作为替代电极，实现对神经元活动的非侵入性测量。四十多年来，有机电压敏感性染料已被广泛用于观察膜电位的变化。 1-4然而，这些染料缺乏细胞特异性，此外，某些细胞类型难以染色。基因编码的电压指示剂（GEVIs）通过使待研究的细胞特异性表达荧光电压敏感探针，克服了这些局限性。
基因编码电压指示剂（GEVI）分为三类。第一类GEVI利用电压敏感磷酸酶的电压感应结构域，与单一荧光蛋白（FP）5-9或 Förster 偿能共振转移（FRET）荧光对10-12结合使用。第二类传感器直接利用微生物视紫红质作为荧光指示剂13-15，或通过电致变色FRET机制实现16,17。第三类系统包含两个组分：一个为锚定于细胞膜的荧光蛋白基因组分，另一个为膜结合的淬灭染料组分18-20。尽管第二类和第三类传感器适用于体外（in vitro）和脑片实验19,20，但目前仅有第一类传感器可用于活体（in vivo）分析6。
在本报告中，我们将....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
伦理声明：动物实验方案已获得韩国科学技术研究院（KIST）动物护理和使用委员会的批准，批准编号为2014-001。
1. 仪器设置
- 成像装置设置
- 将倒置荧光显微镜放置于防振台上。使用高倍物镜（60倍油镜，数值孔径1.35）以及配备有适用于电压成像所用荧光蛋白的二向色镜和滤光片的滤光立方体。
注意：该装置采用倒置显微镜以使用数值孔径（NA）更高的物镜，但也可使用正置显微镜。实际上，倒置显微镜仅用于探针开发，因为较高数值孔径（NA）的物镜比低NA物镜收集更多的光，从而提高记录信号的信噪比（SNR；可定义为峰值光学信号除以基线荧光的标准偏差）。对于非探针开发者，我们推荐在脑片或活体组织成像等应用中使用正置显微镜 体内 记录。 - 准备光源， 例如氙弧灯，配备机械快门，用于高效的落射荧光宽场成像。通过光导接口将光线引导至显微镜。光线将穿过激发滤光片，并由滤光立方体中的第一片二向色镜反射。调整光路，使样品在视野范围内获得均匀照明，并实现最大化的光照强度。 21.
注意：传统上使用75瓦的弧光灯，因为更高功率的灯泡会产生更大的照明区域，但亮度并不会增加。激光器可以使用，但仅限于单一波长。发光二极管（LEDs）的亮度正在不断提高，可能成为首选光源，因其可提供多种波长，且无需机械快门。 - 将两台CCD相机按照图示方式安装到荧光....
- 将倒置荧光显微镜放置于防振台上。使用高倍物镜（60倍油镜，数值孔径1.35）以及配备有适用于电压成像所用荧光蛋白的二向色镜和滤光片的滤光立方体。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
瞬时转染的细胞在荧光强度和细胞质膜表达程度上可能表现出显著差异。即使在同一盖玻片上，不同细胞的胞内荧光水平也可能各不相同。这很可能与细胞吸收的转染试剂的量有关。偶尔，过量表达会导致细胞发生未折叠蛋白反应，从而引发细胞凋亡27（表现为明亮、圆形且胞内荧光强烈的细胞）。因此，实验人员应谨慎地同时检测荧光强的细胞和荧光弱的细胞，并尽可能选择胞内荧光最少的细胞，因为胞内表达会产生非响应性荧光，降低信噪比（SNR）。
另一个需要考虑的因素是发色团的成熟速率。图3展示了受体发色团（mRuby2）与供体发色团（Clover）之间荧光强度的差异，其中mRuby2的成熟时间比Clover更长。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
神经系统以多种不同方式利用电压，其中抑制作用会引起轻微的超极化，突触输入会引起轻微的去极化，而动作电位则导致相对较大的电压变化。通过基因编码电压指示剂（GEVIs）测量膜电位变化的能力，为同时分析神经元回路的多个组分提供了广阔前景。在本报告中，我们展示了一种利用基因编码电压指示剂成像膜电位变化的基本方法。
对电压变化进行成像的一个关键因素是GEVI在质膜上的高效表达。细胞内表达会产生无响应的荧光，从而降低探针的信噪比（SNR）。优化转染条件可显著提高光学测量结果的一致性。实际上，在测试一种新型GEVI时，建议同时测试一种已知的探针，以确保光学活性的差异完全源于新探针本身，而非细胞实验条件所致。
图6展示了内部荧光对电压成像灵敏度（ΔF/F值）的降低作用。图6B显示了表达基于单荧光蛋白的基因编码电压指示剂Bongwoori的HEK细胞的ΔF值。迹线2来自区域2（蓝色），该区域在图6A中显示出相对较亮的内部荧光。该迹线的ΔF值水平.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由韩国国家研究基金会（NRF）的世界级研究所（WCI）项目资助，该项目由韩国教育科技部资助（项目编号：WCI 2009-003），以及韩国科学技术研究院机构项目（项目编号：2E24210）。Sungmoo Lee 获得韩国国家研究基金会（NRF）全球博士生奖学金项目（项目编号：NRF-2013H1A2A1033344）的资助，该项目隶属于韩国教育部（MOE）。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 倒置显微镜 | Olympus | IX71 | |
| 60倍物镜（数值孔径 = 1.35） | Olympus | UPLSAPO 60XO | |
| 激发滤光片 | Semrock | FF02-472/30 | 用于Bongwoori中超级电击pHluorin的电压成像 |
| 二向色镜 | Semrock | FF495-Di03-25x36 | |
| 发射滤光片 | Semrock | FF01-497/LP | |
| 75 W 氙弧灯 | CAIRN | OptoSource Illuminator | LED和激光也是有效的光源 |
| 低速CCD相机 | Hitachi | KP-D20BU | |
| 双端口相机适配器 | Olympus | U-DPCAD | |
| 高速CCD相机 | RedShirtImaging, LLC | NeuroCCD-SM | |
| 图像分光器 | CAIRN | Optosplit 2 | |
| 激发滤光片 | Semrock | FF01-475/23-25 | 用于基于Clover和mRuby2组成的FRET对的GEVI电压成像 |
| 二向色镜 | Semrock | FF495-Di03-25x36 | |
| 发射滤光片 | Chroma | ET520/40 | |
| 二向色镜 | Semrock | FF560-FDi01-25X36 | |
| 发射滤光片 | Chroma | ET645/75 | |
| 防振系统 | Kinetic systems | 250BM-IC, 5702E-3036-31 | |
| 膜片钳记录室 | Warner instruments | RC-26G, 64-0235 | |
| #0 显微盖玻片（22 × 40 mm） | Electron Microscopy Sciences | 72198-20 | |
| 温度控制器 | Warner instruments | TC-344B | |
| #0（0.08 ~ 0.13 mm）- 直径10 mm 玻璃盖玻片 | Ted Pella | 260366 | |
| 脂质体转染试剂 | Life Technologies | 11668-027 | |
| 磷酸钙转染试剂 | Clontech - Takara | 631312 | |
| 膜片钳放大器 | HEKA | EPC 10 USB放大器 | |
| 多通道数据采集软件 | HEKA | Patchmaster | |
| 图像采集与分析软件 | RedShirtImaging | Neuroplex | |
| 电子表格应用软件 | Microsoft | Microsoft Excel 2010 | |
| 数据分析软件 | OriginLab | OriginPro 8.6.0 | |
| 减倍镜 | Qioptiq LINOS | Optem标准相机耦合器 0.38x SC38 J夹 | |
| 共聚焦显微镜 | Nikon | Nikon A1R共聚焦显微镜 | |
| 抗荧光淬灭试剂 | Life Technologies | P36930 |
参考文献
- Salzberg, B. M., Davila, H. V., Cohen, L. B. Optical recording of impulses in individual neurones of an invertebrate central nervous system. Nature. 246, 508-509 (1973).
- Cohen, L. B., et al. Changes in axon fluorescence during act....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
