成像膜电位与基因编码荧光电压传感器的两种类型

Summary

描述了一种使用基因编码电压指示器对膜电位变化进行成像的方法。

Abstract

基因编码电压指示剂 （GEVI） 已经改进到开始可用于体内记录的程度。虽然最终目标是对体内神经元活动进行成像，但必须能够对单个细胞的活性进行成像，以确保体内制备成功。该程序将描述如何对单个细胞中的膜电位进行成像，为最终在体内成像提供基础。在这里，我们描述了对 GEVI 进行成像的方法，该 GEVI 由一个电压感应结构域与单个荧光蛋白 （FP） 或两个能够在体外进行 Förster 共振能量转移 （FRET） 的荧光蛋白融合而成。使用图像分配器可以将两种不同波长创建的图像同时投影到同一电荷耦合器件 （CCD） 相机上。图像分割器在光路中定位第二个滤光片立方体。第二个滤光片立方体由一个二向色镜和两个发射滤光片组成，用于根据 GEVI 的 FP 分离供体和受体荧光波长。这种设置能够同时记录受体和供体荧光伴侣，同时通过全细胞膜片钳配置纵膜电位。当使用由单个 FP 组成的 GEVI 时，可以移除第二个滤光片立方体，从而允许图像分配器中的镜子将单个图像投射到 CCD 相机上。

Introduction

本文的主要重点是说明使用基因编码荧光蛋白在体外膜电位的变化的光学成像系统。在膜电位成像变化提供学习的神经元回路的活性的令人兴奋的可能性。当改变膜电位结果在荧光强度变化，相机的各像素变为一个替代电极使神经元活动的非侵入式测量。四十多年来，有机电压敏感的染料已经观察膜电位^1-4的变动情况。然而，这些染料缺乏蜂窝特异性。此外，某些类型的细胞都难以染色。通过使细胞中专门研究表达荧光电压敏感探测器遗传编码电压指示器（GEVIs）克服这些限制。

有三类GEVIs的。第一类GEVI的使用VOltage感应来自电压传感磷酸酶区带是单一荧光蛋白^（FP）5-9或荧光共振能量转移（FRET）对^10-12。第二类传感器的使用微生物的视紫红质作为荧光指示剂直接^13-15或通过电致变色FRET ^16,17。第三类利用两个组件，该遗传成分是膜锚定的FP和第二组分是一种膜结合的淬灭染料^18-20。而第二和第三类是用于在体外和切片实验^19,20有用，只有第一类传感器是目前用于体内分析⁶是有用的。

在本报告中，我们将在体外使用第一类GEVIs的（图1）表明膜电位的摄像。该第一类电压传感器的是最简单的转换到体内成像 。由于GEVIsütilizing融合于FP的电压传感域中大约50倍比视紫红质类传感器的更亮，它们可以通过使用弧光灯照明，而不是要求一个非常强大的激光进行成像。亮度的差异的另一个后果是，第一类GEVIs的很容易超过大脑的自体荧光。基于视紫红质探针不能。第三类传感器的只是为第一类是光明，但需要添加化学淬灭剂这是难以在体内的管理。

我们将因此表现出探针与单个^{FP（Bongwoori）8}和由FRET对的探针（纳比^2）12采集。该FRET本报告中构建的VSFP-CR（电压敏感荧光蛋白-四叶草mRuby2）的蝴蝶版本¹¹组成的绿色荧光供体，三叶草，和红色荧光受体，mRuby2，名为彩蝶2.242和彩蝶2.244

图1:在本报告中 （A） 成像基因编码的电压指标（GEVIs）基于GEVI有一个跨膜电压感应域和荧光蛋白单FP 的两种类型 。 （B）基于FRET GEVI由跨膜电压感应域，FRET供体和受体的。 请点击此处查看该图的放大版本。

Protocol

伦理声明:动物实验协议在KIST动物协议2014-001批准的机构动物护理和使用委员会。

1.设备安装

1. 成像设置
   1. 放置在隔振台倒置荧光显微镜。使用的高倍率（60X油浸镜头具有1.35数值孔径）的物镜和装有分色镜和过滤器适合用于电压成像的荧光蛋白质的滤波器立方体。
      注意:此设置使用倒置显微镜，以采用目标具有较高的NA，但也可以使用直立显微镜。的确，在倒置显微镜仅用于探针的发展，因为更高的数值孔径（NA）的物镜收集一个比具有低的NA从而改善了信号噪声比（SNR更多的光;可以被描述为通过分割的峰值光信号基准的标准差记录的荧光）。对于非开发人员，我们会推荐的应用，如切片或体内记录正置显微镜。
   2. 制备的光源，例如，氙弧灯，配备有用于高效落射荧光宽视场成像的机械快门。通过光导引导光显微镜安装。光将通过激发滤光片和通过在过滤器立方体第一分色镜反射。对准光线超过来看²¹场最大化光强均匀地照亮标本。
      注意:传统上，75瓦特弧光灯被用于自较高瓦数灯泡创建更大但不亮的照明域。激光器可以使用，但被限制在一个单一的波长。 LED成为明亮，可能确实是所选择的光源提供多个波长并且不需要机械快门。
   3. 安装两台CCD照相机的fluoresc如在图2D所示 EnCE的显微镜。
      注意:第一CCD照相机具有较高的空间分辨率，并用于表达GEVI质膜一个小区的识别，以进行测试。对于膜电位影像学改变，确保第二CCD相机具有高帧速率每秒（fps）的速度，如1000架。使用双端口摄像机适配器（图2D-（3））来切换两台CCD照相机之间的成像通道。在此设置中，一demagnifier用于从物镜使图像适应在第二CCD摄象机CCD芯片。
   4. 为基于FRET GEVI成像安装第一（慢）和第二（快速）CCD摄像机之间的图像分离器。插入具有分色镜（560纳米）和两个发射滤光片的立方体（520纳米/ 40 645纳米/ 75）中的图像分离器。这将导致的视图的两个字段，一个用于供体荧光，另一个代表受主荧光。删除这个S成像的Econd过滤多维数据集时一个GEVI用一个FP。
      注意:此方法检测单FP基于GEVI是Bongwoori它使用FP，超级黄道pHluorin A227D（SE A227D）。根据它的激发和发射光谱⁵被选择的激励滤光器（472纳米/ 30），发射滤波器（497纳米/长传）和分色镜（495纳米）。一般地，激发和发射滤光片应与荧光团的每个光谱的最大重叠以获得明亮的图象，同时通过发射滤波器发射的分色镜块任何激发光。的过滤器和分色镜的FRET对¹¹基于GEVI记录的选择遵循相同的原理，除了它就必须在对供体和受体荧光的并发观察图像分离器的第二过滤器立方体。第一滤波器立方体置于显微镜过滤盒需要具有三叶草激发滤光器（475纳米/ 23）。然后发射˚F从两个的FP luorescence将通过第一分色镜（495纳米）被发送到第二滤波器立方体。第二滤波器立方体具有分色镜（560纳米），并为每个FP从而分离从两个不同的FP荧光2发射滤波器（520纳米/ 40为三叶草和mRuby2 645纳米/ 75）。

		单一的基于FP GEVI （Bongwoori）	基于FRET对GEVI （彩蝶2.42和2.44彩蝶）
首先滤光块放置在显微镜	激发滤光片	472纳米/ 30	475纳米/ 23
	分色镜	495纳米	495纳米
	发射滤光片	为497nm /长传	-
第二滤波器立方体置于分束器	分色镜	-
	排放过滤器1	-	520纳米/ 40
	发射滤光片2	-	645纳米/ 75

表1.两种不同的过滤设置用于单一的基于FP GEVI和基于FRET GEVI录音

2. 隔振
   1. 请不要在隔振台运动部件安装的任何设备。确保附加到非隔离设备的电缆松散，以避免样品的振动。
3. 膜片钳室
   1. 密封所述膜片钳室的底部用薄＃0护罩玻璃由于物镜的工作距离相对较小。这是在倒置显微镜设置的缺点。
      注意:作为具有高NA物镜的折衷，工作距离减小。为了放置SPECIM在很短的工作距离内的连接，盖玻璃和盖玻片（步骤2）必须尽可能地薄。
4. 温度控制
   1. 确保浴溶液流经一个温度控制器，以围绕保持修补细胞^33℃下在整个实验。
5. 设备的连接
   1. 连接膜片钳放大器和光源到高速CCD照相机的刺刀尼尔-Concelman（BNC）命令框的机械快门。这将使成像软件控制放大器，摄像头，同时光源。
      注意:电气和成像部件需要以提供用于电活动的同时进行电气和光学记录进行同步。

图2.装备彪设置用于电压成像与GEVIs以下的光路的工作流中 ，（A）75W氙弧灯，（B）从电弧灯的激发光被激励的过滤器过滤，然后反射由第一分色镜到达之前检体阶段，在右上角的插图显示了全细胞结构，（C）慢速CCD照相机被用来帮助一个小区和膜片钳的两个选择，（D）的图像采集部分; （1）高速CCD照相机，（2）将图像分离器为FRET对和单声道的FP GEVIs，（3）demagnifier以使图像适应到CCD芯片在高速CCD照相机，（4）双端口摄像机适配器来切换成像途径和（5）的速度慢CCD照相机以高空间分辨率进行识别的小区到补丁，（E和F）的图像采集与基于单一-FP GEVI（E）和一个基于FRET的GEVI（F）。 请点击此处查看该图的放大版本。

2. GEVIs的表达

1. 在人胚肾293细胞
   1. 培养人胚肾293（HEK 293）细胞用Dulbecco _在 CO 2培养箱_（5％CO 2）中于^37℃下在补充有10％胎牛血清改良的Eagle培养基（DMEM）。使用具有直径100毫米和20毫米的高度组织培养皿。用^2×10 3开始培养- 6×10 ^{3细胞 /} cm 2的孵育，直到达到用于随后转染80-90％汇合。
   2. 在转染当天，吸出细胞培养基，并轻轻地用Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水洗一次。驱散HEK 293细胞用0.25％胰蛋白酶EDTA溶液1-2分钟，吸出解决方案，并轻轻拍打的菜端分离的C厄尔。添加新鲜的DMEM（10％FBS）和通过吸液解离成群细胞。通过使用血球确定细胞浓度。
   3. 放置0.08 - 0.13毫米厚，10毫米直径的盖玻片预先涂覆有在24孔组织培养板的聚-L-赖氨酸。种子在盖玻片上的HEK 293细胞以^1×10 5细胞^/ cm 2的细胞密度。
      注意:由于HEK 293细胞能够相互形成间隙连接，种子数目需要得到分离的细胞。
   4. 瞬时转染的细胞通过使用脂转染试剂制造商的指令之后的编码GEVI一个合适的基因构建体。
      注意:用于此步骤中使用的pcDNA3.1（Bongwoori）和pUB2.1（纳比2.242），为骨架的载体的基因构建体。的DNA所用的量为100纳克每个盖玻片;然而，转染条件需要根据经验确定每个GEVI进行测试。
2. 在分离的小鼠臀部pocampal初级神经元
   1. 解剖从胚胎17天C57BL6 / N小鼠海马然后分离海马神经元如前所述^22,23。
   2. 板中的解离的神经元上的聚-D-赖氨酸涂覆的0.08-0.13毫米厚，以^1×10 5细胞/ ml的细胞密度10毫米直径的盖玻片。在^37℃下将细胞在CO _2培养箱 （5％CO _2）。
   3. 瞬时转染的分离的神经元，6 - 7日在体外 （DIV）通过如先前所述²⁴使用磷酸钙转染试剂编码GEVI的基因构建体。
      注意:用于此步骤中使用的pcDNA3.1（Bongwoori）和pUB2.1（纳比2.244），为骨架的载体的基因构建体。的DNA的使用量为1微克每个盖玻片。再次，转染条件需要是对于测试的每种GEVI凭经验确定。
3. 检查电压IMA前的表达水平更改
   1. 从CO _2培养箱取组织培养板和落射荧光显微镜下观察，从转染的细胞的荧光。
   2. 确认从膜的荧光之后，在第3盖玻片转移到修补室用于电压成像。
      注:电压成像进行了16 - 24小时后转染。然而，由于不同的荧光蛋白质具有不同的成熟时间，一些GEVIs需要在转染后更多的时间。例如，含有mRuby2在这个协议的FRET对可能需要更长的时间来表达，因为mRuby2的成熟比四叶草¹¹需要显著更长的时间。供体和受体的荧光应该检查。

3.电压成像协议

1. 选择具有良好膜表达健康细胞
   1. 使用显微镜，找到一个健康的细胞（图4B），显示强膜本地化的荧光相比，内部的荧光。尽量不要打补丁圆形细胞。圆形细胞或者分裂或垂死和难以打补丁。在持续应用的5.0 mV的测试脉冲振幅和5.0毫秒，以帮助后续膜片钳实验。
2. 准备电压成像单元
   1. 选择修补细胞后，将细胞上方的膜片钳吸管。把移液管，直到它轻轻触及细胞膜。在这一步中，观察到1MΩ - 2MΩ上升膜电阻的膜片钳软件^25。
      注:有时，可以通过触摸细胞膜只是发生了良好的千兆欧姆密封。只要千兆欧姆密封是稳定的，应该没问题。
   2. 通过吸管轻轻施加负压建立一个千兆欧姆密封。定在所希望的保持电位移液器潜力。
   3. 在保持千兆欧姆密封，图像日与高速CCD照相机Ë细胞，并将其聚焦到膜面积。
   4. 通过口施加吸力的脉冲破裂细胞膜或注射器轻轻使一个全细胞构造^26。
   5. 图像补丁根据实验设计全细胞钳配置下夹紧单元通过使用成像软件
      1. 启动成像软件。点击[ACQUIRE] - [SciMeasure相机]菜单中打开"CCD ACQUIRE"页面。
      2. 创建一个新的数据文件保存图像。
      3. 点击[模拟输出]，然后按[读取一个ASCII]开辟一个脉冲协议文件进行成像。如果需要对数据进行平均点击的平均内部重复"。然后关闭"模拟输出"页面。
         注意:此脉冲协议需要设计并根据每个实验的目的在此之前步骤保存为".TXT"文件。
      4. 具体的设置acquis从"CCD ACQUIRE页面银行足球比赛的参数。输入关于'为采集帧的数"和"试验数"的具体值。
         注意:帧的数量是由获取的速度和脉冲协议的定时来确定。例如，如果成像在1kHz，1000帧等于记录时间1秒。
      5. 点击[获取数据（光学+ BNC）]按钮开始录制。而该电压成像正在发生，观看从膜片钳软件示波器窗口，以确保在整个记录稳定的全细胞构型。
         注意:要测试GEVI的响应电压范围宽，ΔF/ F值或整个生理电压范​​围时间分辨率信号的大小，进行全细胞膜片钳实验已经踩到一个脉冲协议电压脉冲范围从-170 mV到130毫伏。为了确定在解决动作电位的GEVI的表现从培养初步诱发RY神经元图像的全细胞电流钳配置下的单元格。

4.数据采集

1. 的ΔF/˚F计算
   1. 启动成像软件。单击[文件] - [读取数据文件]打开数据文件进行分析。观察的右侧在其静息光强（RLI）的细胞图像
      注意:软件平均值的前5帧，以确定记录的RLI。
   2. 点击"显示BNC接头"，使测量屏幕上的电流和电压值。
   3. 从更改"RLI框架"的页面模式，以"框减法"利用帧减法功能标识与响应光信号的像素。这是成像的真正威力，因为每个像素可以检查荧光潜在变化。
   4. 选择减法两个时间点（F ₀和F _1）。识别该信元的面积是显示响应信号，以膜电位变化。
      注意:对于帧相减图像的信噪比可以通过选择多个帧的每个时间点在时间上平均的信号得到改善。该软件减去选定的帧所需的平均光强，并计算在F _{1 -F 0}值（ΔF）。通常一个人选择在在刺激期采取的控股潜力和另一个时间点收购的时间点。
   5. 候需要通过拖动或点击与计算机鼠标的每个像素被分析的像素。从所选择的像素观察上的软件窗口的左侧的平均荧光强度的图形表示;图4B＆5B示出了从帧减法分析代表性图像。
   6. 由RLI（F _0）除以减去像素。点击[按RLIs的分割]收购ΔF/˚F值
2. 出口数据
   计算每一个电压阶跃进一步分析GEVI的电压传感特性ΔF/˚F值。使用这些值绘制的图表，如ΔF/˚F与后续数据分析的电压。
3. 通过unclicking"显示BNC接头"菜单中删除的电流和电压的曲线图。转到[OUTPUT] - [保存痕迹中显示（ASCII）的荧光跟踪导出采用标准的绘图软件曲线拟合分析的ASCII文件格式。

5.数据分析

1. 在GEVI电压传感特性
   1. 通过在数据分析程序绘制的ΔF/˚F值与电压绘制荧光变化相对电压曲线图（IV）。拟合曲线以波尔兹曼函数（表2）通过点击，以确定光信号的电压范围[分析] - [接头] - [S形拟合] ​​- [打开对话框]，然后选择波尔兹曼功能。
      注意:拟合到一个功能使得possiblE要表征不同的电压探头的电压传感特性，或者他们的表演在不同的细胞进行比较。玻尔兹曼功能可用于在本文中测试的探针，因为来自这些探测器的FV曲线表明S形图案。
   2. 通过使用初始值和最终值由函数计算的_（A 1和A _2）正常化每ΔF/ F值。
      注:在波尔兹曼方程，最小为_A 1，最大值为_A 2。对于标准化，使用电子表格应用软件通过定义₁零_和 A 2为一体，以调整ΔF/˚F值。平均的归一化ΔF/˚F值计算标准差进行统计分析。
   3. 重制的归一化ΔF/先前在5.1.1节记载的F-值与电压）。
2. 光学响应速度
   1. 有数据分析中打开）从步骤4.2.2取得的ASCII文件程序并绘制ΔF/˚F跟踪随时间的变化。
   2. 点击在数据分析软件"数据选择器"，并选择对应于一个阶梯电压脉冲的开始和当光信号已经达到稳定状态的第二时间点一个时间点。通过点击适合这个范围内提供单，双指数衰减函数[分析] - [配件] - [指数拟合] - [打开对话框]，然后选择一个指数衰减函数。报告更合适。
      注:通过拟合的单或双指数衰减函数，由τ为代表的量化时间常数可以被收购。这将有助于实验者比较他们的测量结果与不同的电压指标完成的动力学。荧光跟踪可能显示可以与双指数衰减函数来描述快速和慢速分量。在这种情况下，计算将导致具有不同的振幅两个时间常数。
   3. 第计算È加权τ常数比较呈现两种时间分量到探针与单个组分的探针的动力学。
      注意:加权tau蛋白被计算为_τ1乘以相对幅度的总和_中 ，A 1，加_τ2乘以相对幅度_，A 2由下式所定义的;

Results

瞬时转染细胞可以表现出在荧光强度和显著变异质膜表达的程度。即使在同一盖玻片一些细胞将具有内部荧光的不同级别。这很可能是由于转染试剂的被细胞吸收的量。有时候，太多的表达导致细胞经历导致细胞凋亡²⁷未折叠蛋白反应（明亮，圆润的细胞，具有高内荧光）。因此，实验者提醒用尽可能少的内部荧光尽可能测试两个明亮的细胞和细胞暗淡内部以来表达创建降低了信噪比（SNR），无响应的荧光。

另一个考虑是发色团的成熟率，图3示出了在受体chromoph的荧光视差矿（mRuby2），其中有一个更长的成熟时间比捐助生色团（四叶草）。

图3. HEK 293细胞的共聚焦...

Discussion

神经系统采用几种不同的方式的电压，抑制导致轻微的超极化，突触输入导致轻微的去极化和动作电位产生一个比较大的电压变化。通过GEVIs测量膜电位变化的能力提供了同时分析神经回路中的几个组件的有前途的潜力。在这份报告中，我们展示了使用GEVIs膜电位影像学改变的根本方法。

用于成像的变化电压的主要关键是GEVI在质膜的有效表达。胞内表达创建降低了探头的SNR一个非响应荧光。优化转染条件大大改善了光学测量的一致性。事实上，测试一个新颖GEVI时最好是还测试已知探针，以确保在光活性的差别到NE是由于完全瓦特探头与细胞的不的条件。

图6示出内部荧光的减小电压成像的灵敏度的效果，ΔF/ F值。 图6B示出的ΔF值表示基于单FP GEVI，Bongwoori一个HEK细胞。迹线2来自何处相对亮内部荧光在图6A中看到的区域2（蓝色）。此跟踪具有ΔF值迹线1的水平相近然而 ，在...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
倒置显微镜	奥林巴斯	IX71
60X 物镜（数值孔径 = 1.35）	奥林巴斯	UPLSAPO 60XO
激发滤光片	Semrock	FF02-472/30	用于 Bongwoori 二向色镜中超黄道 pHluorin 的电压成像
	Semrock	FF495-Di03-25x36
发射滤光片	Semrock	FF01-497/LP
75W 氙弧灯	CAIRN	OptoSource 照明器	LED 和激光器也是有效的光源
慢速 CCD 相机	日立	KP-D20BU
双端口相机适配器	奥林巴斯	U-DPCAD
高速CCD相机	RedShirtImaging， LLC	NeuroCCD-SM
图像分流器	CAIRN	Optosplit 2
激发滤光片	Semrock	FF01-475/23-25	用于基于FRET对的GEVI的电压成像，由三叶草和mRuby组成2）
二向色镜	Semrock	FF495-Di03-25x36
发射滤光片	Chroma	ET520/40
二向色镜	Semrock	FF560-FDi01-25X36
发射滤光片	Chroma	ET645/75
隔振系统	Kinetic systems	250BM-IC， 5702E-3036-31
修补室	Warner instruments	RC-26G， 64-0235
#0 微型盖玻片 （22 x 40 mm）	电子显微镜科学	72198-20
温度控制器	Warner instruments	TC-344B
#0 （0.08 ~ 0.13 mm） - 10 mm 直径玻璃盖玻片	Ted Pella	260366
脂质转染剂	Life Technologies	11668-027
磷酸钙试剂	Clontech - Takara	631312
膜片钳放大器	HEKA	EPC 10 USB 放大器
多通道数据采集软件	HEKA	Patchmaster
图像采集和分析软件	RedShirtImaging	Neuroplex
电子表格应用软件	Microsoft	Microsoft Excel 2010
数据分析软件	OriginLab	OriginPro 8.6.0
去agnifier	Qioptiq LINOS	Optem标准相机耦合器 0.38x SC38 J clamp
共聚焦显微镜	Nikon	Nikon A1R 共聚焦显微镜
抗淬灭试剂	Life Technologies	P36930