使用两种基因编码的荧光电压传感器进行膜电位成像

摘要

介绍了一种利用基因编码的电压指示剂对膜电位变化进行成像的方法。

摘要

基因编码的电压指示剂（GEVIs）已得到显著改进，目前已逐步可用于 体内 记录。虽然最终目标是成像神经元活动 体内，必须能够对单个细胞的活动进行成像，以确保体内实验准备的成功。本实验方案将介绍如何对单个细胞的膜电位进行成像，为最终实现活体成像提供基础 体内在此，我们描述了成像基因编码电压指示剂（GEVIs）的方法，该指示剂由一个电压感应结构域与单个荧光蛋白（FP）或一对可进行荧光共振能量转移（FRET）的荧光蛋白融合而成。 体外使用图像分光器可将由两种不同波长产生的图像同时投射到同一个电荷耦合器件（CCD）相机上。图像分光器在光路中放置第二个滤光立方体，该立方体包含一个二向色镜和两个发射滤光片，用于根据GEVI所用的荧光蛋白（FPs）分离供体和受体的荧光波长。此配置可在通过全细胞膜片钳技术操控膜电位的同时，实现对受体和供体荧光信号的同步记录。当使用的GEVI仅包含单一荧光蛋白时，可移除第二个滤光立方体，使图像分光器内的镜面将单一图像投射至CCD相机。

引言

本文的主要目的是展示膜电位变化的光学成像 体外 使用基因编码的荧光蛋白。对膜电位变化进行成像为研究神经环路活动提供了令人振奋的可能性。当膜电位变化引起荧光强度改变时，相机的每个像素都可作为替代电极，实现对神经元活动的非侵入性测量。四十多年来，有机电压敏感性染料已被广泛用于观察膜电位的变化 ^1-4然而，这些染料缺乏细胞特异性，此外，某些细胞类型难以染色。基因编码的电压指示剂（GEVIs）通过使待研究的细胞特异性表达荧光电压敏感探针，克服了这些局限性。

基因编码电压指示剂（GEVI）分为三类。第一类GEVI利用电压敏感磷酸酶的电压感应结构域，结合单个荧光蛋白（FP）^5-9或 Förster 偏振能量转移（FRET）荧光对^10-12。第二类传感器直接利用微生物视紫红质作为荧光指示剂^13-15，或通过电致变色FRET机制实现检测^16,17。第三类系统包含两个组分：一个为锚定在细胞膜上的基因编码荧光蛋白，另一个为膜结合的淬灭染料^18-20。尽管第二类和第三类传感器适用于体外（in vitro）和脑片实验^19,20，但目前仅有第一类传感器可用于活体（in vivo）分析⁶。

在本报告中，我们将演示利用第一类基因编码电压指示剂（GEVIs）对膜电位进行成像图1) 体外第一类电压传感器是最容易实现过渡的 体内 成像。由于利用与荧光蛋白融合的电压感应结构域的基因编码电压指示剂（GEVI）的亮度比视紫红质类传感器高约50倍，因此可使用弧光灯照明进行成像，而无需使用极高功率的激光器。亮度差异的另一个结果是，第一类GEVI的信号可轻易超过脑组织的自发荧光背景，而基于视紫红质的探针则无法做到。第三类传感器的亮度与第一类相当，但需要添加一种化学淬灭剂，而该淬灭剂的给药较为困难。 体内.

因此，我们将演示获取带有单一荧光蛋白（Bongwoori）⁸的探针，以及由FRET对（Nabi 2）¹²组成的探针。本报告中的FRET构建体为VSFP-CR（电压敏感型荧光蛋白 - Clover-mRuby2）¹¹的蝴蝶型版本，包含绿色荧光供体Clover和红色荧光受体mRuby2，分别命名为Nabi 2.242和Nabi 2.244¹²。对这类记录方法的介绍将帮助研究人员更深入地理解基因编码电压指示剂（GEVIs）所能提供的信息类型。

图1. 本报告中成像的两种基因编码电压指示剂（GEVIs）（A）基于单一荧光蛋白的GEVI，包含跨膜电压感应结构域和一个荧光蛋白。（B）基于FRET的GEVI，由跨膜电压感应结构域、FRET供体和受体组成。请点击此处查看该图的放大版本。

方案

伦理声明：动物实验方案已获韩国科学技术院（KIST）动物护理与使用委员会批准，批准编号为2014-001。

1. 仪器设置

1. 成像装置设置
   1. 将倒置荧光显微镜放置于防振台上。使用高倍物镜（60倍油镜，数值孔径1.35）以及配备有适用于电压成像所用荧光蛋白的二向色镜和滤光片的滤光立方体。
      注意：该装置采用倒置显微镜以使用数值孔径（NA）更高的物镜，但也可使用正置显微镜。实际上，倒置显微镜仅用于探针开发，因为较高数值孔径（NA）的物镜比低NA物镜能收集更多光信号，从而提高记录信号的信噪比（SNR；可定义为峰值光学信号与基线荧光标准偏差的比值）。对于非开发人员，我们推荐在脑片或活体等应用中使用正置显微镜。 体内 记录
   2. 准备光源， 例如氙弧灯，配备机械快门，用于高效的落射荧光宽场成像。通过光导接口将光线引导至显微镜。光线将穿过激发滤光片，并由滤光立方体中的第一片二向色镜反射。调整光路，使样品在视野范围内获得均匀照明，并实现最大化的光照强度 ²¹.
      注意：传统上使用75瓦的弧光灯，因为更高功率的灯泡会产生更大的照明区域，但亮度并不会增加。激光器可以使用，但仅限于单一波长。发光二极管（LED）的亮度正在不断提高，可能成为首选光源，因其可提供多种波长，且无需机械快门。
   3. 将两台CCD相机按照图示安装到荧光显微镜上 图2D.
      注意：第一台CCD相机具有高空间分辨率，用于识别待测细胞质膜上表达GEVI的细胞。为成像膜电位变化，请确保第二台CCD相机具有高帧率，例如每秒1,000帧（fps）。使用双端口相机适配器（图 2D-(3)) 在两个CCD相机之间切换成像光路。在此设置中，使用一个缩小镜将物镜产生的图像投射到第二个CCD相机的CCD芯片上。 
   4. 在第一台（慢速）和第二台（快速）CCD相机之间安装图像分光器，用于基于FRET的GEVI成像。插入一个滤光立方体，内含分色镜（560 nm）和两个发射滤光片（520 nm/40） & 645 nm/75）置于图像分光器中。这将产生两个视野，一个用于供体荧光，另一个用于受体荧光。在对带有单个荧光蛋白的GEVI进行成像时，应移除第二个滤光立方体。
      注意：本方法中测试的基于单一荧光蛋白的基因编码电压指示剂为 Bongwoori，该指示剂使用荧光蛋白 super ecliptic pHluorin A227D（SE A227D）。激发滤光片（472 nm/30）、发射滤光片（497 nm/长通）和二向色镜（495 nm）的选择依据为其激发和发射光谱 ⁵通常，激发滤光片和发射滤光片应与荧光团的每种光谱具有最大的重叠，以获得明亮的图像，同时二向色镜应阻断任何透过发射滤光片的激发光。FRET 配对所用滤光片和二向色镜的选择 ¹¹ 基于GEVI的记录遵循相同原理，但需要在图像分光器中增加第二个滤光立方体，以同时观测供体和受体的荧光。显微镜滤光盒中放置的第一个滤光立方体需配备激发滤光片（475 nm/23），用于激发Clover。两个荧光蛋白（FP）发出的荧光将通过第一块二向色镜（495 nm）传输至第二个滤光立方体。第二个滤光立方体包含一块二向色镜（560 nm）和两个发射滤光片（520 nm/40用于Clover，645 nm/75用于mRuby2），从而分离来自两种不同荧光蛋白的荧光信号。

		基于单个荧光蛋白的GEVI (Bongwoori)	基于FRET配对的GEVI (Nabi 2.42 & Nabi 2.44)
置于显微镜中的第一个滤光片组	激发滤光片	472 nm/30	475 nm/23
	二向色镜	495 nm	495 nm
	发射滤光片	497 nm/长通	-
置于分光镜中的第二个滤光片组	二向色镜	-	560 nm
	发射滤光片 1	-	520 nm/40
	发射滤光片 2	-	645 nm/75

表1. 用于单荧光蛋白型GEVI和FRET型GEVI记录的两组不同滤光片

2. 隔振
   1. 请勿将任何带有活动部件的设备安装在隔振台上。确保连接到非隔振设备的电缆保持松弛，以避免样品产生振动。
3. 膜片钳记录浴槽
   1. 使用一片薄的#0盖玻片密封膜片钳记录浴槽的底部，因为物镜的工作距离相对较小。这是倒置显微镜系统的一个缺点。
      注意：高数值孔径（NA）物镜的代价是工作距离缩短。为了将样品置于极短的工作距离内，盖玻片和盖片（步骤2）应尽可能薄。
4. 温度控制
   1. 确保灌流液流经温度控制器，以在整个实验过程中维持记录细胞的温度在约33 ^oC。
5. 设备连接
   1. 将膜片钳放大器和光源的机械快门连接至高速CCD相机的BNC（Bayonet Neill-Concelman）指令盒。这将使成像软件能够同时控制放大器、相机和光源。
      注意：为了实现电活动的同步电学与光学记录，电学和成像组件必须保持同步。

图2. 使用GEVIs进行电压成像的设备设置 沿着光路的工作流程：（A）75 W氙弧灯，（B）来自弧光灯的激发光通过激发滤光片过滤后，由第一块二向色镜反射，再到达样品台；右上角插图显示全细胞构型，（C）低速CCD相机用于辅助细胞选择和膜片钳操作，（D）图像采集部分：（1）高速CCD相机，（2）用于FRET对和单荧光蛋白GEVIs的图像分光器，（3）缩小镜，用于将图像适配到高速CCD相机的CCD芯片上，（4）双通道相机适配器，用于切换成像光路，以及（5）具有高空间分辨率的低速CCD相机，用于识别待钳制的细胞，（E&F）基于单荧光蛋白的GEVI（E）和基于FRET的GEVI（F）的图像采集示意图。请点击此处查看该图的放大版本。

2. GEVIs 的表达

1. 在人胚胎肾293细胞中
   1. 使用添加10%胎牛血清的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），在37℃下培养人胚胎肾293（HEK 293）细胞 ^oC 在 CO₂ 培养箱（5% CO₂）₂）。使用直径100 mm、高20 mm的组织培养皿。以2 × 10²³ - 6 × 10³ 细胞/厘米²² 并培养至细胞融合度达到80–90%，用于后续转染。
   2. 转染当天，吸除细胞培养基，用杜氏磷酸盐缓冲液轻轻洗涤一次。加入0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，消化1–2分钟，吸除消化液，轻敲培养皿边缘使细胞脱落。加入新鲜DMEM（10% FBS），通过移液吹打使细胞团块分散。使用血细胞计数板测定细胞浓度。
   3. 将预先涂有聚-L-赖氨酸、厚度为 0.08 – 0.13 mm、直径为 10 mm 的盖玻片放入 24 孔组织培养板中。以 1 × 10⁵ 个细胞/孔的密度将 HEK 293 细胞接种于盖玻片上⁵ 细胞/厘米² 细胞密度
      注意：由于HEK 293细胞能够相互之间形成间隙连接，接种数量需确保获得孤立的单个细胞。
   4. 使用脂质体转染试剂，按照制造商说明书将编码GEVI的适当基因构建体瞬时转染至细胞中。
      注意：本步骤所用的基因构建体以 pcDNA3.1（Bongwoori）和 pUB2.1（Nabi 2.242）作为骨架载体。每张盖玻片使用的 DNA 量为 100 ng；然而，每种待测 GEVI 的转染条件需通过实验经验确定。 
2. 在分离的小鼠海马原代神经元中
   1. 从胚胎第17天的C57BL6/N小鼠中分离海马组织，然后按照先前所述方法解离海马神经元 ^22,23.
   2. 将解离的神经元接种到多聚-D-赖氨酸包被的、厚度为0.08–0.13 mm、直径为10 mm的盖玻片上，密度为1 × 10⁵个细胞/盖玻片⁵ 细胞/ml 的细胞密度。将细胞在 37℃ 培养 ^oC in CO₂ 培养箱（5% CO₂）₂).
   3. 在分离神经元培养6至7天时进行瞬时转染 体外 （DIV）使用钙磷酸盐转染试剂，按照先前所述方法，转染编码GEVI的基因构建体 ²⁴.
      注意：本步骤所用的基因构建体以 pcDNA3.1（Bongwoori）和 pUB2.1（Nabi 2.244）作为骨架载体。每张盖玻片使用的 DNA 量为 1 µg。此外，每种测试的 GEVI 所需的转染条件需通过实验经验确定。 
3. 在进行电压成像前检测表达水平
   1. 从 CO₂ 培养箱中取出组织培养板₂ 将细胞置于培养箱中孵育，并在落射荧光显微镜下观察转染细胞的荧光。
   2. 在确认膜上的荧光后，将盖玻片转移至第3节所述的灌流槽中进行电压成像。
      注意：电压成像在转染后16–24小时进行。然而，由于不同的荧光蛋白具有不同的成熟时间，某些基因编码电压指示剂（GEVI）在转染后需要更长的表达时间。例如，本实验方案中包含mRuby2的FRET对可能需要更长时间表达，因为mRuby2的成熟时间显著长于Clover¹¹应检测供体和受体的荧光。

3. 电压成像实验方案

1. 选择一个细胞膜表达良好的健康细胞
   1. 利用显微镜找到一个健康的细胞（图4B），其细胞膜区域的荧光强度应明显强于细胞内部荧光。尽量避免对呈圆形的细胞进行膜片钳操作。圆形细胞可能正处于分裂或死亡状态，难以形成稳定封接。施加一个幅度为5.0 mV、持续时间为5.0 msec的测试脉冲，以辅助后续的膜片钳实验。
2. 准备进行电压成像的细胞
   1. 选定待钳制的细胞后，将膜片钳电极移至细胞上方。缓慢下放电极，使其轻轻接触细胞膜。在此步骤中，观察膜片钳软件上显示的膜电阻是否出现1 MΩ - 2 MΩ的上升²⁵。
      注意：有时仅通过轻触细胞膜即可形成良好的吉欧姆封接。只要吉欧姆封接稳定，即可继续实验。
   2. 通过电极轻轻施加负压，建立吉欧姆封接。将电极电位设定为所需的钳制电位。
   3. 在维持吉欧姆封接的同时，使用高速CCD相机对细胞进行成像，并将焦点对准细胞膜区域。
   4. 通过嘴控或注射器轻柔施加吸力脉冲，击破细胞膜，形成全细胞记录构型²⁶。
   5. 根据实验设计，使用成像软件在全细胞钳制构型下对已钳制细胞进行成像
      1. 启动成像软件。点击[ACQUIRE] - [SciMeasure Camera]菜单，打开“CCD ACQUIRE”页面。
      2. 创建一个新的数据文件以保存图像。
      3. 点击[ANALOGUE OUTPUT]，然后选择[Read an ASCII]，以加载用于成像的脉冲协议文件。如果需要对数据进行平均处理，请勾选“Average the internal repetitions”选项，然后关闭“ANALOGUE OUTPUT”页面。
         注意：此脉冲协议需根据各实验的具体目的预先设计并保存为“.txt”格式文件。
      4. 在“CCD ACQUIRE”页面中设置特定的采集参数。输入“采集帧数”和“试验次数”的具体数值。
         注意：采集帧数由采集速度和脉冲协议的时间安排决定。例如，若以1 kHz频率成像，则1,000帧对应1秒的记录时间。
      5. 点击[TAKE DATA (Optics + BNC)]按钮开始记录。在电压成像过程中，持续观察膜片钳软件中的示波器窗口，确保在整个记录期间保持稳定的全细胞构型。
         注意：为测试GEVI的响应电压范围、ΔF/F值的信号幅度或在生理电压范围内的时间分辨率，可采用阶梯式电压脉冲（从-170 mV至130 mV）的脉冲协议进行全细胞电压钳实验。为评估GEVI在分辨培养原代神经元诱发的动作电位方面的性能，应在全细胞电流钳构型下对细胞进行成像。

4. 数据采集

1. ΔF/F 的计算
   1. 启动成像软件。点击 [文件] - [读取数据文件] 打开待分析的数据文件。在右侧观察细胞的静息光强度（RLI）图像
      注：软件会取前 5 帧的平均值来确定记录中的 RLI。
   2. 点击“显示 BNCs”以将测得的电流和电压值显示在屏幕上。
   3. 将页面模式从“RLI 帧”更改为“帧相减”，以使用帧相减功能识别具有响应性光学信号的像素。这是成像技术的真正优势所在，因为每个像素的荧光变化均可被单独检测。
   4. 选择两个时间点（F₀ 和 F₁）进行相减，以确定细胞中哪些区域对膜电位变化产生响应信号。
      注：通过为每个时间点选择多个帧进行时间平均，可提高帧相减图像的信噪比（SNR）。软件会计算所选帧的平均光强度并进行相减，得出 F₁ - F₀ 值（ΔF）。通常选择一个在钳制电位下获取的时间点和另一个在刺激期间获取的时间点。
   5. 使用鼠标拖拽或逐个点击的方式选定需要分析的像素区域。在软件窗口左侧观察所选像素的平均荧光强度的图形表示。图 4B 和图 5B 展示了帧相减分析的代表性图像。
   6. 将相减后的像素值除以 RLI（F₀）。点击 [除以 RLI] 以获得 ΔF/F 值。
2. 导出数据
   1. 计算每个电压步阶对应的 ΔF/F 值，以进一步分析 GEVI 的电压感应特性。利用这些值绘制如 ΔF/F 随电压变化的曲线图，用于后续数据分析。
   2. 取消勾选“显示 BNCs”菜单以移除电流和电压图。进入 [输出] - [按显示保存轨迹（ASCII）]，将荧光轨迹以 ASCII 文件格式导出，以便使用标准绘图软件进行曲线拟合分析。

5. 数据分析

1. GEVI 的电压感应特性
   1. 在数据分析程序中，以 ΔF/F 值对电压作图，绘制荧光变化与电压的关系曲线（F-V 曲线）。通过点击 [Analysis] - [Fitting] - [Sigmoidal fit] - [Open dialog]，选择 Boltzmann 函数（表 2）对曲线进行拟合，以确定光学信号的电压响应范围。
      注意：对函数进行拟合有助于表征不同电压探针的电压感应特性，或比较其在不同细胞中的性能表现。由于本文所测试探针的 F-V 曲线呈 S 形，因此可采用 Boltzmann 函数进行拟合。
   2. 利用拟合函数计算得到的初始值和终末值（A₁ 和 A₂）对每个 ΔF/F 值进行归一化处理。
      注意：在 Boltzmann 方程中，最小值为 A₁，最大值为 A₂。进行归一化时，可使用电子表格软件将 A₁ 定义为 0，A₂ 定义为 1，从而调整 ΔF/F 值。对归一化后的 ΔF/F 值进行平均，并计算标准误以用于统计分析。
   3. 按照第 5.1.1 节所述方法，重新绘制归一化后的 ΔF/F 值与电压的关系曲线。
2. 光学响应速度
   1. 使用数据分析程序打开从步骤 4.2.2) 获得的 ASCII 文件，并绘制 ΔF/F 信号随时间变化的轨迹图。
   2. 在数据分析软件中点击“Data selector”，选择一个对应于阶跃电压脉冲起始时刻的时间点，以及另一个对应于光学信号达到稳态的时间点。通过点击 [Analysis] - [Fitting] - [Exponential fit] - [Open dialog]，选择单指数或双指数衰减函数对该区间进行拟合，并报告拟合效果更优的结果。
      注意：通过单指数或双指数衰减函数拟合，可获得以 τ 表示的量化时间常数，有助于实验人员比较使用不同电压指示剂所测得数据的动力学特征。荧光轨迹可能包含快相和慢相成分，可用双指数衰减函数描述；此时，拟合结果将产生两个具有不同振幅的时间常数。
   3. 计算加权 τ 常数，以便将具有两个时间成分的探针动力学特性与仅具单一成分的探针进行比较。
      注意：加权 τ 的计算公式为 τ₁ 乘以其相对振幅 A₁，加上 τ₂ 乘以其相对振幅 A₂，再除以总振幅，具体定义如下：

结果

瞬时转染的细胞在荧光强度和细胞膜表面表达程度上可能表现出显著差异。即使在同一盖玻片上，不同细胞的胞内荧光水平也可能各不相同。这很可能与细胞吸收的转染试剂用量有关。偶尔，过量表达会导致细胞发生未折叠蛋白反应，进而引发细胞凋亡²⁷（表现为明亮、圆形且胞内荧光强烈的细胞）。因此，实验人员应注意同时检测荧光强的细胞和荧光弱的细胞，并尽可能选择胞内荧光最少的细胞进行分析，因为胞内表达会产生非响应性荧光，从而降低信噪比（SNR）。

另一个需要考虑的因素是发色团的成熟速率。图3展示了受体发色团（mRuby2）与供体发色团（Clover）之间荧光强度的差异，其中mRuby2的成熟时间比Clover更长。

讨论

神经系统以多种不同方式利用电压，其中抑制作用会引起轻微的超极化，突触输入会引起轻微的去极化，而动作电位则导致相对较大的电压变化。通过基因编码电压指示剂（GEVIs）测量膜电位变化的能力，为同时分析神经元回路的多个组分提供了广阔前景。在本报告中，我们展示了一种利用基因编码电压指示剂成像膜电位变化的基本方法。

对电压变化进行成像的一个关键因素是GEVI在质膜上的高效表达。细胞内表达会产生无响应的荧光，从而降低探针的信噪比（SNR）。优化转染条件可显著提高光学测量结果的一致性。实际上，在测试一种新型GEVI时，建议同时测试一种已知的探针，以确保光学活性的差异完全源于新探针本身，而非细胞实验条件所致。

图6展示了内部荧光对电压成像灵敏度（ΔF/F值）的降低作用。图6B显示了表达基于单荧光蛋白的基因编码电压指示剂Bongwoori的HEK细胞的ΔF值。迹线2来自区域2（蓝色），该区域在图6A中显示出相对较亮的内部荧光。该迹线的ΔF值水平...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
倒置显微镜	Olympus	IX71
60倍物镜（数值孔径 = 1.35）	Olympus	UPLSAPO 60XO
激发滤光片	Semrock	FF02-472/30	用于Bongwoori中超级电击pHluorin的电压成像
二向色镜	Semrock	FF495-Di03-25x36
发射滤光片	Semrock	FF01-497/LP
75 W 氙弧灯	CAIRN	OptoSource Illuminator	LED和激光也是有效的光源
低速CCD相机	Hitachi	KP-D20BU
双端口相机适配器	Olympus	U-DPCAD
高速CCD相机	RedShirtImaging, LLC	NeuroCCD-SM
图像分光器	CAIRN	Optosplit 2
激发滤光片	Semrock	FF01-475/23-25	用于基于Clover和mRuby2组成的FRET对的GEVI电压成像
二向色镜	Semrock	FF495-Di03-25x36
发射滤光片	Chroma	ET520/40
二向色镜	Semrock	FF560-FDi01-25X36
发射滤光片	Chroma	ET645/75
防振系统	Kinetic systems	250BM-IC, 5702E-3036-31
膜片钳记录室	Warner instruments	RC-26G, 64-0235
#0 显微盖玻片（22 × 40 mm）	Electron Microscopy Sciences	72198-20
温度控制器	Warner instruments	TC-344B
#0（0.08 ~ 0.13 mm）- 直径10 mm 玻璃盖玻片	Ted Pella	260366
脂质体转染试剂	Life Technologies	11668-027
磷酸钙转染试剂	Clontech - Takara	631312
膜片钳放大器	HEKA	EPC 10 USB放大器
多通道数据采集软件	HEKA	Patchmaster
图像采集与分析软件	RedShirtImaging	Neuroplex
电子表格应用软件	Microsoft	Microsoft Excel 2010
数据分析软件	OriginLab	OriginPro 8.6.0
减倍镜	Qioptiq LINOS	Optem标准相机耦合器 0.38x SC38 J夹
共聚焦显微镜	Nikon	Nikon A1R共聚焦显微镜
抗荧光淬灭试剂	Life Technologies	P36930