方法文章

Au- Slp1 聚合物与单层膜的相互作用 Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D、ICP-MS 和 AFM 作为生物分子-金属相互作用研究的工具

DOI：

10.3791/53572

⸱

2016年1月19日

 ,  , 
1Helmholtz Institute Freiberg for Resource Technology, Helmholtz-Zentrum Dresden-Rossendorf, 2Institute for Resource Ecology, Helmholtz-Zentrum Dresden-Rossendorf

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

为了获得金从水相体系中吸附与回收的基础信息，研究了Au(III)和Au(0)纳米颗粒与S层蛋白的相互作用。蛋白质聚合物的吸附行为通过ICP-MS进行分析，而蛋白质单分子层的吸附行为则采用QCM-D技术研究。随后通过AFM对所形成的纳米结构进行成像观察。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文描述了球形赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus sphaericus）JG-B53 表面层（S-layer）蛋白（Slp1）对金的吸附行为。这些生物分子可在表面形成准晶态的二维阵列，具有结合金属的能力，因此在多种生物技术应用中具有重要意义，例如作为生物吸附材料，用于从环境或工业流程中去除或回收不同元素。通过S层介导的合成1或纳米颗粒吸附的方式，在S层上沉积零价金（Au(0)）纳米颗粒，为多种传感应用开辟了新的可能性。尽管已有大量研究报道了S层的生物吸附特性2-5，但对蛋白质-蛋白质及蛋白质-金属相互作用的深入理解仍具挑战性。在本研究中，采用电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）检测悬浮S层对金属的吸附情况，并结合石英晶体微天平耗散监测技术（QCM-D）进行分析。QCM-D可实现对蛋白质单分子层形成及金属沉积过程的在线检测，从而更深入地理解金属结合机制。

ICP-MS 结果表明，Au(III) 与悬浮 S 层聚合物的结合具有 pH 依赖性，在 pH 4.0 时达到最大结合量。in situ 实验期间，QCM-D 研究实现了对 Au(III) 吸附以及 Au(0) 纳米颗粒沉积的实时检测。此外，该方法还允许研究金属结合对 Slp1 蛋白晶格稳定性的影响。在 QCM-D 实验结束后，可直接利用原子力显微镜（AFM）观察其结构特性和蛋白层的稳定性。综上所述，结合这些不同方法可更深入地理解细菌 S 层蛋白在悬浮状态或作为单层膜附着于细菌细胞或再结晶表面时对金属的结合行为。

引言

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由于黄金在电子、催化剂、生物传感器或医疗设备等多种应用中的使用日益增加，近年来这种贵金属的需求不断增长 6-9金以及许多其他贵金属和重金属通过工业废水以稀释浓度排放、采矿活动和废物处置进入环境 7,8,10，尽管重金属或贵金属对环境的污染主要是由技术活动引起的持续过程。这会导致自然生态系统受到显著干扰，并可能威胁人类健康。 9了解这些负面影响推动了寻找从受污染生态系统中去除金属的新技术，以及改进从工业废水中回收金属的方法。已建立的物理化学方法（如沉淀法或离子交换法）在高稀释溶液中效果较差。 7,8,11生物吸附，无论是利用活体还是死体生物量，都是废水处理的一种有吸引力的替代方法 10,12. 此类生物材料的使用可减少有毒化学物质的消耗。已有许多微生物被报道具有积累或固定金属的能力。例如，细胞 Lysinibacillus sphaericus (L. sphaericus）JG-A12 对贵金属表现出高结合能力， 例如， Pd(II)、Pt(II)、Au(III) 以及其他有毒金属如 Pb(II) 或 U(VI) 4,13，Lysinibacillus sphaericus JG-B53 的细胞 巨大芽孢杆菌 用于 Cr(VI) 14，Lysinibacillus sphaericus JG-B53 的细胞 酿酒酵母 用于 Pt(II) 和 Pd(II) 15，以及 普通小球藻 Au(III) 和 U(VI) 16,17之前已有关于Au(III)、Pd(II)和Pt(II)等金属结合的报道 脱硫弧菌（Desulfovibrio desulfuricans）18 以及用于 L. sphaericus JG-B53 19,20然而，并非所有微生物都能结合大量金属，因此其作为吸附材料的应用受到限制 12,21此外，金属结合能力取决于多种参数， 例如， 细胞组成、所用生物组分或环境与实验条件（pH、离子强度、温度等）。对分离的细胞壁碎片的研究 22,23，如膜脂、肽聚糖、蛋白质或其他组分，有助于理解由多种结构组成的完整细胞的金属结合过程 8,21.

本研究关注的细胞组分为S层蛋白。S层蛋白是许多细菌和古菌外层细胞包膜的组成部分，约占这些生物体总蛋白质量的15 - 20%。作为与外界环境的首个界面，这些细胞组分显著影响细菌的吸附特性。 3S层蛋白的分子量范围从四十到数百kDa，在细胞内合成，但在细胞外组装，能够在脂质膜或聚合物细胞壁组分上形成层状结构。分离后，几乎所有S层蛋白均具有在溶液中、界面处或表面自发自组装形成平面或管状结构的内在特性。 3蛋白质单层的厚度取决于细菌种类，范围在5 - 25 nm之间。 24。通常，形成的S层蛋白结构可以呈斜方形（p1 或 p2）、方形（p4）或六边形（p3 或 p6) 晶格常数为 2.5 至 35 nm 的对称性 3,24晶格的形成在许多情况下似乎依赖于二价阳离子，尤其是钙离子2+ 25,26，Raff, J. 等。基于S层的纳米复合材料在《基于蛋白质的工程化纳米结构》中的工业应用。（编者：Tijana Z. Grove） & Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016（投稿中）)然而，单体折叠、单体间相互作用、晶格形成以及不同金属（特别是如 Ca²⁺ 等二价阳离子）作用的完整反应级联过程2+ 和 Mg2+仍不完全清楚。

革兰氏阳性菌株 L. sphaericus JG-B53（原名 短小芽孢杆菌 在新的系统发育分类之后 27 从铀矿开采废料堆中分离得到 "Haberland" （德国萨克森州约翰格奥尔根施塔特） 4,28,29其功能性的S层蛋白（Slp1）具有方形晶格结构，分子量为116 kDa 30，以及一个厚度 ≈ 活细菌细胞上10 nm 31. 在之前的研究中， 体外 在不到10分钟内即形成了厚度约为10 nm的完整且稳定的蛋白质层 19. 相关菌株 L. sphaericus JG-A12，同样是从 "哈贝兰德" 堆，具有高金属结合能力，其分离出的S层蛋白对金(III)、铂(II)和钯(II)等贵金属表现出良好的化学和机械稳定性以及优异的吸附速率 4,32,33这种对贵金属的结合在一定程度上对某些金属具有选择性，其结合能力取决于聚合物外表面和内表面以及其孔隙中功能基团的可及性、离子强度和pH值。蛋白质与金属相互作用的相关功能基团包括COOH-、NH2-、OH-、PO4-，SO4- 和 SO-。原则上，金属结合能力为广泛应用开辟了广阔前景，Raff, J. 等。基于S层的纳米复合材料在蛋白质工程纳米结构中的工业应用。// Tijana Z. Grove（编）《基于蛋白质的工程纳米结构》 & Aitziber L. Cortajarena)（Springer，2016年（已提交））例如， 作为去除或回收溶解性有毒或有价值金属的生物吸附组分，用于催化反应中合成或有序沉积规则结构金属纳米颗粒（NPs）的模板，以及其他生物工程材料如生物传感层 3,5,18,33规则排列的纳米粒子阵列（如 Au(0)-NPs）可广泛应用于分子电子学、生物传感器、超高密度存储器件以及一氧化碳氧化反应催化剂等领域。 34-37此类应用的开发及这些材料的智能设计需要对潜在的金属结合机制有更深入的理解。

开发此类生物基材料的前提是，在生物分子与技术表面之间可靠地构建一层界面层38,39。例如，已采用逐层自组装（LbL）技术构建的聚电解质40,41作为S层蛋白再结晶的界面层39。此类界面为以可重复且定量的方式进行蛋白质包被提供了相对简便的方法。通过开展有无黏附促进剂修饰条件下的不同实验，可对包被动力学、层稳定性以及金属与生物分子之间的相互作用做出判断19,42,Raff, J. et al. S-layer based nanocomposites for industrial applications in Protein-based Engineered Nanostructures. (eds Tijana Z. Grove & Aitziber L. Cortajarena) (Springer, 2016 (submitted))。然而，蛋白质吸附及蛋白质-表面相互作用的复杂机制尚未被完全阐明。尤其是关于构象、排列取向和包被密度的信息仍属缺乏。

近年来，石英晶体微天平耗散监测（QCM-D）技术作为一种研究蛋白质吸附、涂层动力学以及纳米尺度相互作用过程的工具，受到了广泛关注19,43-45。该技术能够实时、详细地检测质量吸附过程，可用于指示蛋白质自组装过程以及功能分子在蛋白质晶格上的偶联情况19,20,42,46-48。此外，QCM-D测量还为在天然生物条件下研究金属与蛋白质层之间的相互作用过程提供了可能。在最近的一项研究中，已利用QCM-D技术研究了S层蛋白与Eu(III)、Au(III)、Pd(II)和Pt(II)等特定金属的相互作用19,20。所吸附的蛋白质层可作为革兰氏阳性细菌细胞壁的简化模型，对该单一组分的研究有助于更深入地理解金属相互作用。然而，仅靠QCM-D实验无法对表面结构及金属对蛋白质的影响作出判断，还需借助其他技术来获取此类信息。原子力显微镜（AFM）即为一种可用于成像生物纳米结构并获取结构特性信息的方法。

本研究的目的是探讨金（Au(III)和Au(0)-NPs）在S层蛋白，特别是芽孢杆菌Lysinibacillus sphaericus JG-B53的Slp1蛋白上的吸附行为。 L. sphaericus JG-B53。实验在pH 2.0–5.0范围内进行，采用批处理方式，对悬浮蛋白使用ICP-MS分析，对固定化S层使用QCM-D分析。此外，通过后续的AFM研究考察了金属盐溶液对晶格稳定性的影响。这些技术的结合有助于更深入理解 体外 将金属相互作用过程作为研究工具，以深入了解整个细菌细胞上与特定金属亲和性相关的结合事件。这一知识不仅对开发可用于金属回收的实用过滤材料至关重要，而且对环境保护和资源节约也具有重要意义 49，还可用于开发高度有序的金属纳米颗粒阵列，以满足多种技术应用的需求。

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方案

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1. 微生物及培养条件

注意：所有实验均在无菌条件下进行。L. sphaericus JG-B53 来源于冻存培养物29,30。

  1. 将冻存的菌种（1.5 ml）在洁净工作台中转移至300 ml无菌营养肉汤（NB）培养基（含3 g/L肉浸膏、5 g/L蛋白胨、10 g/L NaCl）中。随后，在30°C条件下，持续振荡培养至少6小时 30 °C 用于获得培养用的预培养物。
  2. 在pH = 7.0的NB培养基中，于有氧条件下培养细菌， 30 °C 在70 L规模的在位蒸汽灭菌生物反应器中进行。因此，向反应器中加入约57 L去离子水。将NB培养基固体直接加入生物反应器并溶解（浓度见上文）。
    1. 此外加入消泡剂（30 µl/L NB培养基）加入培养基中以抑制培养过程中泡沫的产生，然后进行高压灭菌（122 °C，反应器内培养基的保温时间30分钟）
  3. 冷却培养基并进行充分的氧气饱和。用1 M HCl调节pH至7.02SO4 以及 2 M NaOH）并启动 300 ml 预培养物的自动接种。在接种时点开始记录培养参数数据。记录 在线 参数 例如， 溶解氧水平（dO2）、酸和碱的添加，以及培养过程中的pH值。
    1. 监测细菌生长 在线 通过非侵入性浊度测量。
  4. 在培养过程中的每小时后进行额外取样，并测定其他参数，如生物干重（BDW）和 离线 光密度（OD）。因此，需在无菌条件下，于每个取样点收集20 ml培养液。
    1. 通过分光光度法在600 nm波长下测定吸光度以离线测定OD值，使用无菌过滤的NB培养基作为空白对照。吸光度达到后 >根据朗伯-比尔定律的线性关系，将细胞悬液稀释至0.4。
    2. 为测定细菌干重（BDW），在室温下将1至5 ml细菌悬液（根据细胞密度确定体积）于5,000 x g离心5 min。将获得的细胞沉淀干燥 105 °C 在烘箱中加热至质量恒定，称量沉淀物质量。
  5. 使用相差显微镜在400倍和1,000倍放大倍数下（分别对应相差聚光镜2和3）拍摄显微图像，用于检测细菌生长情况并作为交叉污染的对照。
  6. 指数生长期检测到后 在线 dO2 和 在线 浊度，通过流穿式离心在15,000 x g条件下收获生物量， 4 °C 并用标准缓冲液（50 mM TRIS, 10 mM MgCl）洗涤生物量两次2，3 mM NaN3，pH = 7.5）。
    注意：所获得的生物量沉淀物可于 -18 °C 直至进一步用于分离。

2. S层蛋白的分离与纯化

注意：根据先前描述的改进方法纯化 Slp1 多聚体2,19,30,32,50,51。

  1. 在4 °C冰浴冷却条件下，将来自培养的标准缓冲液（1:1 (w/v)）中洗涤并解冻的粗生物量使用分散器（3级，10分钟）进行均质化处理，以去除鞭毛。
  2. 将悬浮液在8,000 × g、4 °C条件下离心20分钟，并用标准缓冲液（1:1 (w/v)）将所得沉淀洗涤两次。洗涤后再次离心（8,000 × g，4 °C，20分钟），将沉淀重悬于标准缓冲液（1:1 (w/v)）中，加入DNase II和RNase（每克生物量0.4单位），并在高压均质机中于1,000 bar条件下裂解细胞。随后在27,500 × g、4 °C条件下离心1小时。
    注意：使用研究显微镜检查细胞悬浮液。当在400倍放大倍数下显微镜视野中可见的完整细胞少于2–3个时，表明细胞裂解已完成。
  3. 用标准缓冲液（1:1 (w/v)）将沉淀洗涤两次，并再次进行离心。之后将沉淀重悬于含有1% Triton X-100的标准缓冲液（2:1 (w/v)）混合液中，并在连续振荡（100 rpm）条件下孵育20分钟，以溶解脂质沉积物。
  4. 将溶液在27,500 × g、4 °C条件下离心1小时，并用标准缓冲液（1:1 (w/v)）将所得沉淀洗涤三次。
  5. 将经额外离心（27,500 × g，4 °C，1小时）后获得的沉淀在含有0.2 g/L溶菌酶的标准缓冲液（1:1 (w/v)）中孵育6小时，以水解肽聚糖中的连接键50。同时向悬浮液中添加DNase II和RNase（每克生物量各0.4单位）。
  6. 离心后（45,500 × g，4 °C，1小时），用含有蛋白亚基的少量上清液（<30 ml）重悬上层白色蛋白相。
  7. 将白色悬浮液与6 M盐酸胍溶液（6 M GuHCl，50 mM TRIS，pH = 7.2）按1:1比例混合，使其溶解。溶液将变得透明明亮。
  8. 对经GuHCl处理的溶液进行无菌过滤（0.2 µm），随后进行额外的高速离心（45,500 × g，4 °C，1小时）。
  9. 将上清液转移至透析膜管（截留分子量50,000道尔顿），并在重结晶缓冲液（1.5 mM TRIS，10 mM CaCl2，pH = 8.0）中透析48小时。
  10. 将白色重结晶的蛋白聚合物溶液转移至离心管中，在45,500 × g、4 °C条件下离心1小时。将沉淀用少量超纯水（<30 ml）重悬。
  11. 随后将悬浮液转移至透析膜管中，在超纯水中透析24小时，以去除缓冲液成分。
    注意：透析过程中多次更换缓冲液或超纯水是必不可少的。
  12. 将纯化的Slp1在冷冻干燥机中进行冻干处理。

3. 实验用 Slp1 的表征与定量

注意：Slp1 在吸附和包被实验中的浓度通过紫外-可见分光光度法进行定量。

  1. 移液器 2 µl 将溶解的Slp1样品直接加入光度计的下部测量底座中。在280 nm波长处测定蛋白质的吸光度最大值，该波长为蛋白质的特征吸收峰。使用消光系数0.61计算Slp1浓度。以不含Slp1的溶液作为空白对照进行参比测量。
  2. 用缓冲液将蛋白质稀释至实验所需浓度（批式吸附实验使用0.9% NaCl，pH = 6.0；QCM-D实验使用重结晶缓冲液，pH = 8.0），浓度分别为1 g/L和0.2 g/L。
  3. 采用 Laemmli, U. K. 描述的标准生物分析方法十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析 Slp1 的质量和分子量。 52.
    1. 在将 Slp1 用于实验之前，先进行 SDS-PAGE 例如， 使用10%聚丙烯酰胺分离凝胶进行Au(0)-NP孵育后。
    2. 对于SDS样品，混合≈10 µl 将培养物或蛋白质样品与样品缓冲液（1.97 g TRIS，5 mg 溴酚蓝，5.8 ml 甘油，1 g SDS，2.5 ml β-巯基乙醇，用超纯水定容至 50 ml）按 1:1（v/v）比例混合，室温孵育 4 分钟后，用移液器吹打混匀 95 °C 加样至凝胶孔中。
    3. 以60 V电压运行SDS-PAGE 30分钟，直至样品通过浓缩胶，进入分离胶后将电压改为120 V。
    4. 从凝胶系统中取出凝胶，用超纯水冲洗后，置于固定液（10% 乙酸，50% 无水乙醇）中固定 1 小时。随后，用超纯水冲洗凝胶。
    5. 采用改良的非特异性胶体考马斯亮蓝法染色凝胶 53,54脱色后72,73使用凝胶成像系统，按照制造商说明书拍摄SDS-PAGE图像。

4. 批量模式下的吸附实验及金属定量

  1. 进行批量吸附实验时，使用 HAuCl4 ∙ 3 H2O 配制 Au(III) 储备液，将金属盐稀释后与 Slp1/NaCl 溶液混合，使初始金属浓度为 1 mM，最终 Slp1 浓度为 1 g/L。每组实验设三个重复，并增设一个不含 Slp1 的阴性对照组。吸附实验总体积为 5 ml。
  2. 将悬浮液在室温下连续振荡 24 小时，pH 值预先调节为 2.0 至 5.0 的不同水平（使用低浓度 HCl 和 NaOH 溶液调节 pH）。
  3. 吸附完成后，在 15,000 × g、4 °C 条件下离心 20 分钟，使 Slp1 与上清液分离。
  4. 将上清液转移至超滤管（截留分子量 50,000 Da），在 15,000 × g、4 °C 条件下再次离心 20 分钟，以去除溶解的蛋白质单体。
  5. 采用 ICP-MS 19,20 测定滤液中的金属浓度，并根据 Slp1 干重反推吸附的金属量。该方法的测量原理、应用优势以及所用 ICP-MS 仪器的组成部件已在文献中描述 55。
    1. 使用 1% HNO3 作为基质，并以 1 mg/ml 铑作为内标，制备 ICP-MS 测量所需的样品和参比溶液。

5. 金纳米颗粒的合成及粒径测定

注意：柠檬酸盐稳定的 Au(0)-NP 是根据 Mühlpfordt, H. 等人（1982 年）先前描述的改进方法合成的，以获得直径为 10 - 15 nm 的球形颗粒56,57。

  1. 制备稳定的 25 mM HAuCl₄ 溶液4 ∙ 3H2用于NP形成的O储备液。
  2. 稀释 250 µl 将该储备液加入19.75 ml超纯水中，并于指定条件下孵育 61 °C 在连续振荡下孵育15分钟。
  3. 配制5 ml第二种储备液（12 mM单宁酸，7 mM柠檬酸钠二水合物，0.05 mM K2CO3）并在 2℃ 下孵育nd 溶液分别在 61 °C 15 分钟。
  4. 在持续搅拌下加入2nd 将储备液加入溶液一中。在室温下搅拌反应混合物至少10分钟。 61 °C随后将溶液冷却，并用于QCM-D实验中Slp1晶格上的纳米颗粒包被。
    注意：所制备的 Au(0)-NP 通过紫外-可见光谱在 520 nm 吸收峰处进行表征，该波长通常用于检测生成的 Au(0)-NP 58. 溶液可在 4 °C.
  5. 通过光子相关光谱法（PCS，也称为动态光散射）分析所形成的 Au(0) 纳米颗粒的尺寸。
    1. 为测定纳米颗粒（NP）尺寸，在超净工作台的无尘条件下，将1.5 ml合成的Au(0)-NP溶液转移至比色皿中，并使用粒径与Zeta电位分析仪进行分析。PCS技术及样品制备的详细说明见Schurtenberger, P. et al. (1993) 59 和 Jain, R. 等人（2015） 60.

6. QCM-D 实验——Slp1 在表面的包被及金纳米颗粒在 Slp1 晶格上的吸附

注意：实验使用配备多达四个流控模块的石英晶体微天平-耗散（QCM-D）系统进行测量。所有QCM-D实验均在25 °C条件下以125 µl/min的恒定流速进行。Slp1包被以及金属/纳米颗粒（NP）孵育步骤均在二氧化硅（SiO2）压电AT切型石英传感器（直径14 mm）上进行，其基频约为5 MHz。冲洗步骤和溶液添加在代表性结果部分的图中已作标记。QCM-D实验可按步骤描述：首先对所用传感器进行清洗和表面修饰，随后进行Slp1重结晶，最后研究金属及金属纳米颗粒的相互作用。

  1. 清洗程序：
    1. 为流体池安装传感器假体。将至少20 ml（每个模块各20 ml）的碱性液体清洗剂（2%清洗剂溶于超纯水中，v/v）泵入QCM-D及管路系统中。随后，将五倍体积（每个模块各五倍体积）的超纯水以不超过300 µl/min的流速泵入系统。按照制造商提供的操作规程执行清洗。
    2. 将SiO2传感器从流动模块中取出，置于2% SDS溶液中孵育（至少20分钟）以进行外部清洗，之后用超纯水反复冲洗传感器61,62。
    3. 使用过滤压缩空气将晶体吹干，并将其放入臭氧清洗室中处理20分钟63,64。
    4. 重复上述清洗步骤两次，以彻底去除所有有机污染物。
    5. 为去除传感器表面结合的金属离子，使用1 M HNO3冲洗传感器，随后所有冲洗步骤均使用超纯水进行。
  2. 通过聚电解质对传感器表面进行修饰：
    注意：表面修饰可在流动模块内部（流通法）或外部（逐层自组装法，LbL）进行。本实验采用以下方式对表面进行修饰。
    1. 采用浸涂法，利用逐层自组装技术（LbL），在传感器表面交替修饰聚乙烯亚胺（PEI，分子量25,000）和聚苯乙烯磺酸盐（PSS，分子量70,000），浓度为3 g/L40,41，具体方法参照Suhr, M. 等人（2014）文章中针对该特定系统所描述的方法19。
    2. 将传感器置于深孔板中的相应聚电解质溶液中，在室温下孵育10分钟。
    3. 将传感器从聚电解质溶液中取出，每次浸涂步骤之间均需用超纯水充分冲洗。
      注意：新的表面修饰应至少包含三层聚电解质，最外层为带正电荷的PEI。
    4. 完成外部修饰后，将传感器装入流动模块中，并在实验开始前用超纯水冲洗以达到平衡状态。
  3. Slp1单分子层再结晶：
    1. 将Slp1溶解于4 M尿素中，使聚合物解聚为单体。
    2. 将解聚后的蛋白溶液在15,000 × g、4 °C条件下离心1小时，以去除较大的蛋白聚集体。
    3. 将溶解并离心后的Slp1上清液与再结晶缓冲液混合，使最终蛋白浓度为0.2 g/L。
      注意：Slp1的钙依赖性再结晶（自组装过程）在加入再结晶缓冲液后即开始。因此，应立即将混合溶液以125 µl/min的流速泵送至流动模块内的传感器表面。当QCM-D实验中检测到频率和耗散值稳定时，表明再结晶过程已完成。
    4. 在流动模块内的聚电解质修饰传感器表面成功形成蛋白再结晶层后，使用再结晶缓冲液或超纯水以125 µl/min的流速对修饰后的传感器进行充分冲洗，直至频率和耗散值稳定。
      注意：用于后续Slp1单分子层吸附实验及AFM研究的SiO2表面聚电解质修饰过程如图1所示。

QCM-D传感器示意图，显示聚电解质、PEI/PSS层和金属纳米颗粒溶液。
图1. PE表面修饰及Slp1单分子层包被的示意图；本图经Springer授权，改编自Suhr, M. 等人 (2015)19。请点击此处查看此图的放大版本。

  1. 金属与金属纳米颗粒相互作用：
    注意：在 0.9% NaCl 溶液中，于 pH = 6.0 条件下，使用金金属盐溶液（HAuCl4 ∙ 3 H2O）以 1 mM 或 5 mM 的浓度进行吸附实验。Au-NP 吸附实验则使用未稀释的 Au-NP，在 1.6 mM 柠檬酸三钠缓冲液中于 pH ≈ 5.0 条件下进行。
    1. 在流控模块中成功完成 Slp1 涂覆后，用 0.9% NaCl 溶液充分冲洗所获得的 Slp1 层，直至频率和耗散变化值稳定。
    2. 以 125 µl/min 的流速将配制好的金属溶液（1 mM）和纳米颗粒溶液泵入流控模块，并监测其在 Slp1 层上的质量吸附情况。通过追踪频率变化并参照 Sauerbrey 方程（公式 1），可直接检测质量吸附。
    3. 完成金属及金属纳米颗粒相互作用后，使用不含金属/纳米颗粒的缓冲液冲洗该层，以去除弱结合或松散附着的金属或纳米颗粒。
      注意：实验装置示意图见 图 2。

带有蠕动泵、电压源、吸附过程和QFM 401装置的流动模块示意图。
图2. 使用流动模块QFM 401的QCM-D装置示意图*66。 请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 数据记录与评估:
    1. 记录频率的变化，单位为赫兹（Δf）n）和耗散（ΔDn使用QCM-D专用软件在QCM-D实验中进行分析。
    2. 用于通过 Sauerbrey 方程/模型评估吸附质量灵敏度（Δm）公式 1) 65 66 适用于无摩擦耦合于传感器表面的薄而刚性薄膜的 nth 泛音。所用5 MHz AT切型石英传感器的C值（Sauerbrey常数）为17.7 ng ∙ Hz-1 ∙ cm-268对于刚性、均匀分布且足够薄的吸附层，使用 公式 1 作为良好的近似。
      Δm=-C(1/n)Δfn equation, mass change analysis, scientific calculation, educational formula.
    3. 根据适用于粘弹性分子的 Kelvin-Voigt 模型进行额外的建模分析 68-71 使用制造商专用软件分析数据，并将结果与Sauerbrey模型的计算结果进行比较。
    4. 用于计算层厚度和质量吸附时，吸附层密度作为重要的建模参数，取值为 1.35 g ∙ cm-3 对应于先前报道的S层蛋白的数值 72-75. 在计算金属与蛋白质层相互作用时，使用相同的数值。

7. 原子力显微镜测量

  1. 在倒置光学显微镜上使用功能完备的原子力显微镜进行研究。
    1. 在涂覆的 QCM-D 传感器上，使用重结晶缓冲液或超纯水直接记录液体中的原子力显微镜（AFM）图像。
    2. 用超纯水冲洗传感器，完成QCM-D实验后将其放入AFM液体池中。使用总体积约为1.5 ml的封闭式液体池，并将液体池的温度保持恒定 30 °C.
    3. 使用在水中共振频率约为 25 kHz、刚度为 <0.1 N/m。将扫描速度调节至2.5到 10 µm/sec.
    4. 在压电陶瓷以悬臂梁共振频率激发其振动的情况下，采用动态接触模式进行成像。通过振荡阻尼程度确定悬臂梁与样品表面之间的距离。 76.
      注意：高度图像显示了z轴比例，而z值表示表面的精确形貌。振幅（伪3D）图像未显示z轴比例，因为振幅的z值依赖于扫描参数，所含信息有限。图像分析使用了三种不同的评估软件。 77.

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结果

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微生物培养与Slp1蛋白表征

细菌生长记录数据显示，指数生长期在约5小时结束。先前研究表明，从该收获时间点可分离获得Slp1（湿菌体生物量为4.36 g/L（≈1.45 g/L（BDW）），达到最大产量 19然而，通过使用成分明确的培养基或补料分批培养策略来优化培养过程，将获得更高的生物量产量。这对于工业应用中大量生物量的使用是不可或缺的。来自 在线 和 离线 记录的培养参数汇总于 图3A显微镜检查（图3B收获时显示为未孢子化的细胞 L. sphaericus JG-B53

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讨论

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本研究采用多种分析方法相结合的方式，探讨了金（Au）与S层蛋白的结合特性。特别是，金的结合不仅在从矿井水或工艺溶液中回收金方面具有重要意义，而且在材料构建方面也极具吸引力， 例如， 传感表面。为了研究金（Au(III) 和 Au(0)-NPs）与悬浮态及重结晶单分子层 Slp1 的相互作用，需先分离该蛋白。因此，本研究展示了革兰氏阳性菌株的 successful cultivation L. sphaericus JG-B53 及其表面层蛋白 Slp1 的分离。然而，该菌的培养和蛋白分离仍具有挑战性，需进一步优化。大规模生产生物量和表面层蛋白是实现两者工业化应用的前提。 例如， 用于制备金属选择性过滤材料。在去除工艺水、废水或排水中的有毒金属，或回收其中溶解的有价金属方面，其应用潜力无疑很高。此外，考虑到S层在其他仿生材料（如生物传感器和催化剂）中的额外应用潜力，其应用前景更为广阔。

悬浮的 Slp1 聚合物的批式吸附实验表明，在 pH 2.0 至 5.0 的考察范围内，对 Au(III) 具有高且稳定的结合能力，金属去除率最高...

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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本工作部分由IGF项目资助 "S-Sieve" （490 ZBG/1）由德国联邦经济事务和气候行动部（BMWi）和德国联邦教育与研究部（BMBF）项目资助 "Aptasens" （BMBF/DLR 01RB0805A）。特别感谢 Tobias J. Günther 在原子力显微镜研究过程中提供的宝贵帮助，感谢以英语为母语的 Erik V. Johnstone 对稿件的审阅。此外，本文作者还感谢 Aline Ritter 和 Sabrina Gurlit（来自资源生态学研究所）在 ICP-MS 测量方面的协助，以及 Manja Vogel、Nancy Unger、Karen E. Viacava 和弗莱贝格赫姆霍兹研究所资源技术生物技术团队的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
仪器和软件
70升中试规模在位灭菌生物反应器系统Applikon Biotechnology，荷兰Z6X包含Applikon Biotechnology的dO2、pH传感器及BioXpert软件V2版本
非侵入式生物量监测仪BugEye 2100BugLab，美国加利福尼亚州康科德Z9X---
分光光度计Ultrospec 1000Amersham Pharmacia Biotech，英国80-2109-10该公司现为GE Healthcare Life Sciences
MiniStar微型离心机VWR，德国521-2844用于培养样品的离心
研究级显微镜BX-61Olympus Germany LLC，德国037006与成像软件联用的显微镜
Cell^P（版本3.1）Olympus Soft Imaging Solutions LLC，德国明斯特ü---与显微镜配套使用
Powerfuge Pilot分离系统Serie 9010-SCarr Centritech，美国佛罗里达州9010PLT用于生物量收获
T18 basic Ultra TurraxIKA Labortechnik，德国431-2601用于鞭毛去除和样品均质化
Sorvall Evolution RC超速离心机Thermo Fisher Scientific，美国728411用于蛋白质分离
移动式高剪切流体处理器M-110EH-30 PilotMicrofluidics，美国马萨诸塞州M110EH30K用于细胞破碎
Alpha 1-4 LSC冷冻干燥机Martin Christ Freeze dryers LLC，德国奥斯托罗德102041---
紫外-可见分光光度计（NanoDrop 2000c）Thermo Fisher Scientific，美国91-ND-2000C-L用于蛋白质浓度测定
Mini-PROTEAN垂直电泳槽Bio-Rad Laboratories GmbH，德国慕尼黑165-3322用于SDS-PAGE
VersaDoc成像系统3000Bio-Rad Laboratories GmbH，德国慕尼黑1708030用于SDS-PAGE凝胶成像
ICP-MS Elan 9000PerkinElmer，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆N8120536用于金属浓度测定
Zetasizer Nano ZSMalvern Instruments，英国伍斯特郡ZEN3600用于纳米颗粒尺寸测定
Q-Sense E4设备 Q-Sense AB，瑞典哥德堡QS-E4通过LOT quantum design订购（软件随E4平台提供）
Q-Soft 401（数据记录）Q-Sense AB，瑞典哥德堡
Q-Tools 3（数据分析与建模）Q-Sense AB，瑞典哥德堡
QCM-D流控模块QFM 401 Q-Sense AB，瑞典哥德堡QS-QFM401通过LOT quantum design订购
QSX 303 SiO2压电AT切割石英传感器Q-Sense AB，瑞典哥德堡QS-QSX303通过LOT quantum design订购
臭氧清洗室Bioforce Nanoscience，美国爱荷华州艾姆斯QS-ESA006通过LOT quantum design订购
原子力显微镜MFP-3D Bio AFMAsylum Research，美国加利福尼亚州圣塔芭芭拉MFP-3DBio用于AFM测量及成像软件
Asylum Research AFM软件AR版本120804+1223Asylum Research，美国加利福尼亚州圣塔芭芭拉---成像软件，包含在货号MFP-3DBio中
Igor Pro 6.3.2.3软件WaveMetrics, Inc.，美国---成像软件，包含在货号MFP-3DBio中
BioHeaterAsylum Research，美国加利福尼亚州圣塔芭芭拉BioheaterAFM测量用样品加热器
Biolever mini悬臂梁， BL-AC40TS-C2Olympus Germany LLC，德国 BL-AC40TS-C2推荐用于AFM测量的悬臂梁
WSxM 5.0 Develop 6.5 (2013)Nanotec Electronica S.L.，西班牙免费软件AFM分析软件
名称公司货号备注
洗涤剂及其他设备
乙酸，100%，分析纯CARL ROTH GmbH+CO.KG3738.5危险品，易燃且具腐蚀性液体和蒸气，可导致严重皮肤灼伤和眼睛损伤。
消泡剂204Sigma-Aldrich Co. LLC.A6426用于抑制泡沫
溴酚蓝钠盐Sigma-Aldrich Co. LLC.B5525---
考马斯亮蓝R（C45H44N3NaO7S2）CARL ROTH GmbH+CO.KG3862.1---
猪脾脱氧核糖核酸酶IISigma-Aldrich Co. LLC.D4138IV型，2,000 - 6,000 Kunitz单位/毫克蛋白质
乙醇，95%VWR，德国20827.467危险品，易燃
甘油，分析纯CARL ROTH GmbH+CO.KG3783.1---
盐酸胍（GuHCl）CARL ROTH GmbH+CO.KG0037.1---
Hellmanex IIIHellma GmbH & Co. KG9-307-011-4-507---
盐酸（HCl）（37%）CARL ROTH GmbH+CO.KG4625.2危险品；具腐蚀性，用于pH调节
溶菌酶（来自鸡蛋清）Sigma-Aldrich Co. LLC.L6876 冻干粉末，蛋白质含量≥90%，活性≥40,000单位/毫克蛋白质（Sigma） 
带加热磁力搅拌器， MR 3000KHeidolph Instruments GmbH & Co.KG，德国504.10100.00实验中标准搅拌器
NB-Media DM180Mast Diagnostica GmbH121800---
硝酸（HNO3）CARL ROTH GmbH+CO.KGHN50.1危险品；氧化性、腐蚀性
PageRuler未染色蛋白MarkerThermoScientific-Pierce26614---
聚（4-苯乙烯磺酸钠）（PSS）Sigma-Aldrich Co. LLC.243051平均分子量约70,000
聚乙烯亚胺（PEI），支化型Sigma-Aldrich Co. LLC.408727警告；有害、刺激性、对环境有害；平均分子量约25,000
无水碳酸钾（K2CO3）Sigma-Aldrich Co. LLC.60108警告；有害
牛胰核糖核酸酶A Sigma-Aldrich Co. LLC.R5503I-AS型，50 - 100 Kunitz单位/毫克蛋白质 
叠氮化钠（NaN3）Merck KGaA106688危险品；剧毒且对环境有害
氯化钠（NaCl）CARL ROTH GmbH+CO.KG3957.2---
十二烷基硫酸钠（SDS）Sigma-Aldrich Co. LLC.L-5750危险品；有毒
氢氧化钠（NaOH）CARL ROTH GmbH+CO.KG6771.1危险品；具腐蚀性，用于培养过程中的pH调节及pH调整
Spectra/Por 6透析膜，截留分子量50,000 CARL ROTH GmbH+CO.KG1893.1---
硫酸（H2SO4）CARL ROTH GmbH+CO.KGHN52.2危险品；具腐蚀性，用于培养过程中的pH调节
单宁酸（C76H52O46）Sigma-Aldrich Co. LLC.16201---
TRIS HCl（C4H11NO3HCl）CARL ROTH GmbH+CO.KG9090.2---
Triton X-100CARL ROTH GmbH+CO.KG3051.3警告；有害，对环境有害
VIVASPIN 500，50,000截留分子量超滤管Sartorius AGVS0132---
β-巯基乙醇Sigma-Aldrich Co. LLC.M6250危险品，有毒

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