视网膜疾病评估中的定量眼底自发荧光技术

摘要

视网膜色素上皮（RPE）通过回收视觉循环副产物支持感光视网膜，这些副产物会以脂褐素形式累积。这些物质具有自发荧光性，可进行定性成像 体内本文介绍了一种利用共焦扫描激光眼底成像技术对视网膜色素上皮细胞脂褐素进行定量成像的方法。

摘要

视网膜色素上皮（RPE）位于其上方的感觉视网膜邻近处，对视觉系统的功能起支持作用。RPE 执行的功能包括通过溶酶体来源的细胞器吞噬并处理光感受器外节段。这些降解产物被储存起来，称为脂褐质颗粒，其成分部分为双视黄醇类化合物，具有广泛的荧光吸收和发射光谱，临床上可通过共焦扫描激光检眼镜（cSLO）检测为眼底自发荧光。脂褐质的积聚与年龄增长相关，但也可见于多种获得性和遗传性视网膜变性疾病中，且呈现不同模式。因此，研究其积聚模式，并将这些模式与上方感觉视网膜的变化进行关联分析，对于理解视网膜疾病的病理生理机制及进展至关重要。本文中，我们介绍一种本实验室及其他研究团队所采用的技术，即利用 cSLO 对健康和病变眼中的 RPE 脂褐质水平进行定量分析。

引言

视网膜色素上皮（RPE）通过多种过程支持感觉视网膜的功能¹。年龄相关性黄斑变性（AMD）是工业化国家中不可治疗失明的最主要原因，其特征是RPE发生改变，包括色素丢失、功能丧失和萎缩。在AMD以及正常衰老过程中，RPE会积聚含有吞噬的光感受器片段的荧光性溶酶体来源细胞器，这些细胞器被称为脂褐素颗粒。RPE脂褐素的积聚曾被认为提示氧化功能障碍¹，但最近的研究表明，在脂褐素水平较高的老年眼睛中，RPE形态仍保持正常²。然而，脂褐素分布的异常模式，特别是脂褐素的丢失，已在组织学和临床上被确认为AMD及其进展的标志物^3,4

已有研究表明，某些遗传性视网膜变性疾病中也存在视网膜色素上皮（RPE）脂褐素加工异常。Stargardt病（STGD）患者在年轻时即出现RPE中脂褐素的积聚，最终导致视力下降，其表现与年龄相关性黄斑变性（AMD）相似⁵。这些发现提示，脂褐素的积聚本身可能具有毒性，并可导致RPE功能障碍^6,7。然而，一项针对STGD患者长期随访的详细成像研究并未证实局灶性脂褐素积聚会继而导致RPE细胞丢失⁸。因此，尽管脂褐素异常是视网膜变性疾病的标志物，但其是否具有直接毒性作用仍有待证实。

视网膜色素上皮（RPE）是视网膜最靠后的细胞层，但却是眼底荧光信号的主要来源。利用共焦扫....

方案

伦理声明：所有参与本研究的患者均根据纽约大学医学院机构审查委员会的批准监督进行。

1. 成像检查的患者选择与初始准备

注意：需要以下材料：0.5% 托吡卡胺滴眼液、2.5% 去氧肾上腺素滴眼液、配备谱域光学相干断层扫描（SD-OCT）的共焦扫描激光检眼镜（cSLO），以及内部荧光参考标准。

1. 成像前，根据制造商的说明正确设置共焦扫描激光检眼镜（cSLO），以进行数据采集。
2. 在cSLO中安装内部荧光参考物。注意：该内部荧光参考物由制造商提供，安装于一个金属环内，应直接置于相机镜头后方。若使用其他制造商的cSLO设备，其配置可能与本方案所述不同。
   1. 为将参考物插入cSLO，需旋转并取下镜头，拧下设备原有的金属环，更换为含有参考物的新金属环。
      注意：内部荧光参考物对定量自发荧光（qAF）技术至关重要，可用于校正激光功率以及探测器灵敏度/增益的变异。
3. 纳入接受成像的患者，需先进行常规散瞳眼底检查，并收集其既往眼部病史及可能表现为眼部异常的全身性疾病等背景信息。
4. 使用0.5%托吡卡胺和2.5%去氧肾上腺素进行散瞳。关键步骤：瞳孔直径必须散大至至少6 mm。注意：充分散瞳对于光线的无阻碍通过至关重要，从而确保眼底的最佳可视化与准确测量。
5. 成像前，正确安置患者于cSLO....

结果

该技术已被用于研究健康¹³和疾病状态^10-12下的定量自发荧光（qAF）。在健康眼（图1）中，来自视网膜色素上皮（RPE）的自发荧光在整个眼底分布相对均匀（图1A）。由于黄斑色素对光的遮挡，中央黄斑区域的荧光强度降低；图像的边缘和角落强度降低则是由于眼球和相机的光学特性所致。血管呈现为暗色，在成像质量良好的图像中应清晰对焦。图1B展示了来自图1A的qAF水平对应的热图表示，冷色调对应较低强度区域，暖色调对应较高强度区域。最高强度通常出现在第二个同心八分环区域（如图1B所示）。该区域受成像相关变异的影响较小，且位于黄斑色素对qAF水平影响较大的中央区域之外。因此，大多数数据分析均采用此环的平均强度值¹³。图2展示了一例年龄相关性黄斑变性（AMD）伴地理样萎缩（GA）——一种晚期AMD——的代表性分析。这种形式.......

讨论

视网膜色素上皮（RPE）脂褐素分布异常，无论是增加还是减少，均为视网膜疾病的敏感标志，通常与感觉视网膜功能丧失相关。本文介绍了利用定量自发荧光（qAF）技术评估RPE脂褐素的方法。通过引入内部荧光参考物以校正激光功率和探测器灵敏度的差异⁹，并结合我们标准化的成像技术，可实现对自发荧光（AF）水平的可靠定量。我们期望该方法有助于视网膜疾病的诊断与监测，并最终用于评估药物治疗或基因治疗等干预措施的疗效。qAF还可用于对年龄相关性黄斑变性（AMD）等疾病高风险个体进行分层评估。

我们已建立了一个大型的定量自发荧光（qAF）正常值数据库，可作为解读视网膜病变的参考工具¹³，并已在多种疾病状态下描述了qAF特征，包括Stargardt病¹⁰、靶心样黄斑病变¹²和Best病¹¹。在健康视网膜中，不同种族群体之间的qAF水平存在差异，白人的qAF显著高于黑人和亚洲人，且女性的qAF水平高于男性。或许最引人注目的是，随着患者年龄增长，qAF水平升高，这与既往通过光谱荧光测定法测得的视网膜色.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
光谱域HRA + OCT	Heidelberg Engineering
0.5% 托吡卡胺滴眼液			可使用任何品牌
2.5% 去氧肾上腺素滴眼液			可使用任何品牌
内置荧光参考源	Heidelberg Engineering
IGOR Pro 软件	WaveMetrics