视网膜疾病评估中的定量眼底自发荧光技术

摘要

视网膜色素上皮（RPE）通过回收视觉循环副产物支持感光视网膜，这些副产物会以脂褐素形式累积。这些物质具有自发荧光性，可进行定性成像 体内本文介绍了一种利用共焦扫描激光眼底成像技术对视网膜色素上皮细胞脂褐素进行定量成像的方法。

摘要

视网膜色素上皮（RPE）位于其上方的感觉视网膜邻近处，对视觉系统的功能起支持作用。RPE 执行的功能包括通过溶酶体来源的细胞器吞噬并处理光感受器外节段。这些降解产物被储存起来，称为脂褐质颗粒，其成分部分为双视黄醇类化合物，具有广泛的荧光吸收和发射光谱，临床上可通过共焦扫描激光检眼镜（cSLO）检测为眼底自发荧光。脂褐质的积聚与年龄增长相关，但也可见于多种获得性和遗传性视网膜变性疾病中，且呈现不同模式。因此，研究其积聚模式，并将这些模式与上方感觉视网膜的变化进行关联分析，对于理解视网膜疾病的病理生理机制及进展至关重要。本文中，我们介绍一种本实验室及其他研究团队所采用的技术，即利用 cSLO 对健康和病变眼中的 RPE 脂褐质水平进行定量分析。

引言

视网膜色素上皮（RPE）通过多种过程支持感觉视网膜的功能¹。年龄相关性黄斑变性（AMD）是工业化国家中不可治疗失明的最主要原因，其特征是RPE发生改变，包括色素丢失、功能丧失和萎缩。在AMD以及正常衰老过程中，RPE会积聚含有吞噬的光感受器片段的荧光性溶酶体来源细胞器，这些细胞器被称为脂褐素颗粒。RPE脂褐素的积聚曾被认为提示氧化功能障碍¹，但最近的研究表明，在脂褐素水平较高的老年眼睛中，RPE形态仍保持正常²。然而，脂褐素分布的异常模式，特别是脂褐素的丢失，已在组织学和临床上被确认为AMD及其进展的标志物^3,4

已有研究表明，某些遗传性视网膜变性疾病中也存在视网膜色素上皮（RPE）脂褐素加工异常。Stargardt病（STGD）患者在年轻时即出现RPE中脂褐素的积聚，最终导致视力下降，其表现与年龄相关性黄斑变性（AMD）相似⁵。这些发现提示，脂褐素的积聚本身可能具有毒性，并可导致RPE功能障碍^6,7。然而，一项针对STGD患者长期随访的详细成像研究并未证实局灶性脂褐素积聚会继而导致RPE细胞丢失⁸。因此，尽管脂褐素异常是视网膜变性疾病的标志物，但其是否具有直接毒性作用仍有待证实。

视网膜色素上皮（RPE）是视网膜最靠后的细胞层，但却是眼底荧光信号的主要来源。利用共焦扫描激光检眼镜（cSLO）可实现源自RPE的自发荧光（AF）的产生与检测，从而可视化眼底AF的空间分布。某些视网膜变性疾病表现出特征性的眼底AF模式，AF成像有助于这些疾病的诊断与监测。尽管标准AF成像在临床上具有重要意义，定量AF（qAF）已成为评估RPE健康状况的重要手段。我们及其他研究者已建立了一种标准化方法，可可靠地测定特定视网膜位置的qAF水平⁹。qAF在视网膜疾病的诊断与监测中具有潜在应用价值，也可能用于预后判断和风险分层。此外，已有研究报道qAF在某些视网膜疾病中的诊断能力^10-12。本文中，我们逐步详细介绍该技术的操作流程，并通过视觉示例展示其在健康眼和病变眼评估中的应用。

方案

伦理声明：所有参与本研究的患者均根据纽约大学医学院机构审查委员会的批准监督进行。

1. 成像检查的患者选择与初始准备

注意：需要以下材料：0.5% 托吡卡胺滴眼液、2.5% 去氧肾上腺素滴眼液、配备谱域光学相干断层扫描（SD-OCT）的共焦扫描激光检眼镜（cSLO），以及内部荧光参考标准。

1. 成像前，根据制造商的说明正确设置共焦扫描激光检眼镜（cSLO），以进行数据采集。
2. 在cSLO中安装内部荧光参考物。注意：该内部荧光参考物由制造商提供，安装于一个金属环内，应直接置于相机镜头后方。若使用其他制造商的cSLO设备，其配置可能与本方案所述不同。
   1. 为将参考物插入cSLO，需旋转并取下镜头，拧下设备原有的金属环，更换为含有参考物的新金属环。
      注意：内部荧光参考物对定量自发荧光（qAF）技术至关重要，可用于校正激光功率以及探测器灵敏度/增益的变异。
3. 纳入接受成像的患者，需先进行常规散瞳眼底检查，并收集其既往眼部病史及可能表现为眼部异常的全身性疾病等背景信息。
4. 使用0.5%托吡卡胺和2.5%去氧肾上腺素进行散瞳。关键步骤：瞳孔直径必须散大至至少6 mm。注意：充分散瞳对于光线的无阻碍通过至关重要，从而确保眼底的最佳可视化与准确测量。
5. 成像前，正确安置患者于cSLO设备上，使其下颌置于下颌托上，前额紧贴额托，并将外眦准确对齐定位指示标记。

2. 眼底基线成像

1. 首先，使用近红外反射光（IR，波长为 820 nm）对眼底成像，以将相机对准黄斑中心并获得初步聚焦。
   1. 在患者体位正确的情况下，将控制面板上的硬件设置切换至 IR 成像模式，手动调整相机位置直至眼底图像完全聚焦，然后采集图像
   2. 将控制面板上的设置调整为 "IR-OCT"，该模式结合光谱域光学相干断层扫描（SD-OCT）与红外成像，用于评估黄斑区潜在病变。
   3. 利用成像窗口中的参考线，将 OCT 图像正确对齐至眼底的 IR 图像。为获得最佳 SD-OCT 图像质量，应调整相机位置，使 OCT 图像位于成像窗口的上三分之一区域。至少采集一条穿过中心凹并覆盖整个成像视野的水平线扫描图像。

3. 设置 qAF 成像

1. 使用"高速"图像采集模式。注意：该设置可实现更快的图像采集，从而降低因患者移动导致虹膜或眼睑遮挡光线而引起的信号丢失风险。
2. 使用"9帧平均"模式。注意：该设置可快速连续捕获9帧图像，随后可将这些图像"平均"以减少噪声和伪影（见下文）。
3. 使用"30 × 30度"视野。注意：这指的是图像采集过程中所捕获的视网膜区域的角度范围。
4. 成像前，应提前告知患者将出现蓝光，以防初次接触时产生惊吓。
5. 开启自发荧光（AF）模式，并调整相机轴线，使屏幕上尽可能"充满"视网膜自发荧光信号（图像边缘和角落的变暗程度最小）。
   1. 若患者难以耐受强蓝光，可先从距离眼睛较远的位置开始成像，然后缓慢将相机移近患者，直至视网膜完全可见。
      关键步骤：若进入或离开眼睛的光线受阻，将导致信号减弱。局部信号减弱表现为图像一侧或一角出现不对称的暗区；当眼球运动单独阻碍光线通过时，则表现为整体性信号丢失。
6. 调整相机位置，使整个视野内的自发荧光信号达到最强。应以获得最大信号强度为目标，而非追求最清晰的图像，尽管两者通常大致相关。通过移动共聚焦扫描激光检眼镜（cSLO）的手动装置或使用检眼镜操纵杆来调节相机焦点，以重新定位相机。
7. 调节灵敏度/增益，使视网膜自发荧光信号清晰可见，但应避免过饱和。在图像采集过程中，若内部参考区域（位于图像顶部）或视网膜区域出现彩色像素，则提示已发生过饱和，从而导致信号丢失。

4. 图像采集

注意：关键步骤：图像采集的目标应是在每次会话中获得2组高质量的9帧图像堆栈，以控制会话内图像之间的变异性。在重新定位患者和相机后，再进行第二次会话，采集两组图像，以评估并控制变异性。所有图像最终都将校准至内部参考标准（见下文描述）。

1. 至少等待 20 秒后，再开始采集图像 "漂白" （使视网膜完全暴露于AF光下）以最大限度减少感光视网膜中视紫红质对光的吸收 ⁹.
   1. 利用此阶段优化相机的对准、聚焦和灵敏度。
2. 在每次图像采集前让受试者眨眼，以形成新鲜的泪膜，从而提高信号质量。
3. 避免将眼睑纳入采集平面。
   注意：对于较难配合的患者，可手动翻开眼睑，作者建议由助手完成此操作。
4. 每次图像采集前优化对焦，以确保光线不被虹膜遮挡，从而避免信号减弱。
   注意：由于轻微移动非常常见，作者建议在每次图像采集前根据需要进行精细的重新对准。成像过程中对患者进行引导和鼓励有助于减少移动。作者还建议使用设备的脚踏板作为 "采集按钮" 以尽量减少操作人员的分心。
5. 通过计算进行图像后处理 "平均值" 对9帧图像堆栈进行平均以提高信噪比。在cSLO软件中选择计算平均值的选项，对堆栈进行平均计算。
   注意：某些堆栈中可能存在部分帧的质量未达到最佳（即，其信号强度相对于最佳帧出现局部或整体减弱），因此在计算平均值前，需仔细检查每帧图像，并剔除质量不佳的帧。
   注意：至少需要3帧图像才能处理出信噪比较为理想的平均图像。由于cSLO设备本身的局限性，每幅图像的边缘和角落区域的信号强度通常低于中央20度区域，此现象属于正常情况。
   1. 如果软件询问操作者是否要对灰度值进行归一化处理（即在0到255之间拉伸直方图，选择 "无"这可保持灰度水平不变，以便进行分析。

5. 图像分析

1. 使用为 qAF 技术开发的图像分析软件（IGOR；⁹），按照先前所述方法分析自发荧光（AF）图像。以下简要描述使用该软件进行典型图像分析的步骤。
   1. 在 IGOR 中加载 qAF 程序，并导入从 cSLO 软件导出的图像（.bmp 格式），图像像素纵横比为 768 x 768（默认输出参数）。
   2. 在下拉菜单中选择图像，并启动分析。
   3. 重新定位图像上的校准指示符，使"十字线"覆盖黄斑中心凹，"方括号"紧贴视盘边缘（这些指示符用于缩放和定位感兴趣区域 ROI）。正确放置后，根据软件提示在图像上生成围绕黄斑中心凹的环形感兴趣区域（见图 1、图 2）。
   4. 在 IGOR 中选择将每幅图像的整体灰度水平校准至内部荧光参考物灰度水平的选项。注意：此步骤可校正与设备相关的因素，包括每幅图像的电子零点水平和每台设备的内部参考校准系数，以及与患者相关的因素，如年龄、屈光状态和角膜曲率。
      注意：分析软件随后在结果图像上显示固定的区域，并在每个区域内显示相应的 qAF 值。qAF 值也会自动填入另一个窗口中的电子表格格式。"
   5. 通过命令提示中的选项生成 qAF "热图"。通过选择相应选项，可将所有图像和数据从 IGOR 软件导出为 Excel 电子表格格式。

结果

该技术已被用于研究健康¹³和疾病状态^10-12下的定量自发荧光（qAF）。在健康眼（图1）中，来自视网膜色素上皮（RPE）的自发荧光在整个眼底分布相对均匀（图1A）。由于黄斑色素对光的遮挡，中央黄斑区域的荧光强度降低；图像的边缘和角落强度降低则是由于眼球和相机的光学特性所致。血管呈现为暗色，在成像质量良好的图像中应清晰对焦。图1B展示了来自图1A的qAF水平对应的热图表示，冷色调对应较低强度区域，暖色调对应较高强度区域。最高强度通常出现在第二个同心八分环区域（如图1B所示）。该区域受成像相关变异的影响较小，且位于黄斑色素对qAF水平影响较大的中央区域之外。因此，大多数数据分析均采用此环的平均强度值¹³。图2展示了一例年龄相关性黄斑变性（AMD）伴地理样萎缩（GA）——一种晚期AMD——的代表性分析。这种形式...

讨论

视网膜色素上皮（RPE）脂褐素分布异常，无论是增加还是减少，均为视网膜疾病的敏感标志，通常与感觉视网膜功能丧失相关。本文介绍了利用定量自发荧光（qAF）技术评估RPE脂褐素的方法。通过引入内部荧光参考物以校正激光功率和探测器灵敏度的差异⁹，并结合我们标准化的成像技术，可实现对自发荧光（AF）水平的可靠定量。我们期望该方法有助于视网膜疾病的诊断与监测，并最终用于评估药物治疗或基因治疗等干预措施的疗效。qAF还可用于对年龄相关性黄斑变性（AMD）等疾病高风险个体进行分层评估。

我们已建立了一个大型的定量自发荧光（qAF）正常值数据库，可作为解读视网膜病变的参考工具¹³，并已在多种疾病状态下描述了qAF特征，包括Stargardt病¹⁰、靶心样黄斑病变¹²和Best病¹¹。在健康视网膜中，不同种族群体之间的qAF水平存在差异，白人的qAF显著高于黑人和亚洲人，且女性的qAF水平高于男性。或许最引人注目的是，随着患者年龄增长，qAF水平升高，这与既往通过光谱荧光测定法测得的视网膜色...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
光谱域HRA + OCT	Heidelberg Engineering
0.5% 托吡卡胺滴眼液			可使用任何品牌
2.5% 去氧肾上腺素滴眼液			可使用任何品牌
内置荧光参考源	Heidelberg Engineering
IGOR Pro 软件	WaveMetrics