一种创新的生物制造技术被开发出来，用于构建在结构特征、组分和力学性能方面类似于天然组织的三维结构 体内 组织。该技术采用了一种新开发的牺牲材料——BSA橡胶，可转移精细的空间特征，实现对 体内 多种组织的结构。
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摘要
摘要
组织支架在组织再生过程中发挥着关键作用。理想的支架必须满足多项要求，例如具备适当的组成、特定的模量以及明确的结构特征。能够模拟天然组织内在结构的生物材料 体内 组织对于疾病研究以及修复缺失或畸形的软组织至关重要。本研究开发了一种新型生物制造技术，结合先进的成像技术、三维（3D）打印技术和选择性酶活性，用于构建新一代适用于科研与临床应用的生物材料。所开发的材料——牛血清白蛋白（BSA）橡胶，通过反应注射成型注入具有特定几何结构的模具中。该牺牲性材料可有效将结构特征转移至天然支架材料中。原型包含一个具有4 mm和3 mm通道的三维胶原支架，呈现分支状结构。本文重点阐述该生物制造技术在构建天然组织工程结构中的应用。本方案利用计算机辅助设计软件（CAD）制造实体模具，随后将BSA橡胶进行反应注射成型，再通过酶消化去除橡胶材料，从而在支架材料中保留其原有的结构特征 关键词：组织工程，生物制造，三维打印，牛血清白蛋白橡胶，胶原支架，酶消化，反应注射成型，计算机辅助设计.
引言
在组织工程领域，制备组织支架的能力至关重要。理想的组织支架应具备三维结构，由生物相容性材料构成，并能模拟 在体内 组织结构以促进细胞和组织的生长与重塑。该支架必须允许营养物质的输送和代谢废物的清除1-4生产这些支架的主要障碍之一是将特定的几何特征复制到生物相容性材料中的能力。已有多种生物制造技术被报道用于控制这些支架的几何特征，例如静电纺丝。5-8溶剂浇铸9立体光刻10，以及3D打印11，以及其他技术。这些技术在相对简便地实现可控的内部和外部结构特征转移方面存在不足，且成本较高，分辨率和可打印性也受到限制（例如， 喷嘴规格、材料限制），或需要耗时较长的后期加工技术才能制备出可用的支架12.
在许多商业制造系统中，内部空隙、通道和结构特征的形成通常采用砂子或其他可移除或牺牲性材料。金属或塑料部件在砂模周围成型，待其固化后，再将砂子去除。以类似的方式，下一代生物材料需要一种相当于“生物砂”的替代物。因此，开发了BSA橡胶作为生物砂的替代品。BSA橡胶是一种新配制的材料，由牛血清白蛋白与戊二醛交联而成。其最终目标是将特定的结构特征重建到一种可生物降解的胶原支架中。本文描述了一种牺牲性生物橡胶的特性，该生物橡胶在原始组织模具中能够保持尺寸保真度。
测试了多种BSA....
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方案
1. 测定胶原蛋白批次中固体物的百分比
- 按照先前发表的方法提取胶原蛋白13。解冻至少 20 ml 的胶原蛋白。测定该批次胶原蛋白的初始固体百分比，以便调控所形成水凝胶中的胶原蛋白浓度。
- 裁剪三片铝箔（约 6 × 6 cm），使用 25 ml 烧杯的底部将每片塑造成小盘状。记录每个铝箔盘的重量。
- 向每个铝箔盘中加入少量胶原蛋白，并记录铝箔盘与胶原蛋白的总重量。每个铝箔盘上添加 0.5 - 0.8 g 胶原蛋白。
注意：此步骤完成后，应有三个铝箔盘，每个盘中均含有少量胶原蛋白。务必记录每个（共 3 个）空铝箔盘的重量以及加入胶原蛋白后的总重量。 - 使用以下公式计算每个盘中胶原蛋白的重量：
胶原蛋白重量 = 铝箔盘与胶原蛋白总重量 - 铝箔盘重量 - 将盛有胶原蛋白的三个铝箔盘置于 100 °C 烤箱中加热 24 小时。
- 24 小时后，记录每个铝箔盘及其脱水后胶原蛋白的重量。
- 使用以下公式计算脱水胶原蛋白的重量：
脱水胶原蛋白重量 = 铝箔盘与脱水胶原蛋白总重量 - 铝箔盘重量 - 利用以下公式计算三个样品的固体百分比，以确定胶原蛋白固体浓度：
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结果
结果表明，该生物制造技术在生成可模拟三维空间排列结构的3D支架方面具有高效性 体内 组织。其结构特征是组织工程应用中的关键参数，在组织工程中起着至关重要的作用 体内 细胞相互作用及组织的功能特性。
BSA 橡胶的一致性和可混匀性是制备均匀且能保持预期形状的 BSA 橡胶的重要参数。蛋白质的溶解度由分子间作用力决定，例如蛋白质-蛋白质相互作用以及蛋白质与溶剂之间的相互作用，这些作用会引发蛋白质整体行为的变化。测定了 BSA 溶液的电导率，该数值可反映溶液中盐浓度的高低。表 1 列出了所测试的 BSA、溶剂和戊二醛的组合。与预期一致，电导率最高的样品（2x PBS 溶剂）更有利于 BSA 的溶解。
确定该牺牲材料合适制备条件的另一个参数是反应速率。如预期所示，随着戊二.......
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讨论
生物制造是一个高度跨学科的领域，生物学与工程学原理在此融合，以生成模拟天然组织的复杂材料。为了实现这一目标，需要开发能够利用从以下方面获取信息的技术 体内 组织并将其转化为 体外 支架。通过这种方式，可构建一个在结构、功能和力学特性上均高度模拟目标组织的平台 在体内 组织。理想的支架材料应具备某些特性，例如具有生物相容性、能够模拟目标组织的力学性能、可实现可控降解、能够支持细胞存活，并允许组织重塑。2,3.
已开发出多种制造技术以生成可存活的三维结构。这些技术可分为两大类：传统技术和先进技术。传统技术包括使用合成和天然的传统材料来制备多孔结构，例如溶剂浇铸、冷冻干燥和熔融成型。这些技术的缺点包括对结构内部孔隙率（孔径大小及孔隙连通性）的控制较差，以及难以在支架内部形成通道。先进技术则包括立体光刻、成型、三维打印和静电纺丝等。1这些技术存在一些缺点，例如缺乏长程微结构通道、材料选择需在提供最佳机械强度的同时能够通过小直径喷嘴挤出、工艺优化依赖于材料特性、需要复杂的后处理步骤（可能具有毒性.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院-国家牙科与颅面研究所（NIH-NIDCR）资助项目 IRO1DE019355（MJ Yost，项目负责人）以及美国国家科学基金会-实验性项目伙伴计划（NSF-EPSCoR，EPS-0903795）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Ⅰ型胶原蛋白 | 从小牛皮中提取的胶原蛋白 | ||
| 盐酸（HCl） | Sigma-Aldrich | 7647-01-0 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS片剂） | MP Biomedical | U5378 | 每100 ml使用1片可配制1x PBS |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| 戊二醛 | Sigma-Aldrich | G5882 | 有毒 |
| 猪油 | Fields | 3090 | |
| 不锈钢模具 | 使用Microlution机床加工 | ||
| 喷枪套装 | Central Pneumatic | 47791 | |
| 双筒注射器混合头 | Medmix | ML2.5-16-LLM | 混合器，DN2.5X16，4:1 棕色，中等 |
| 双筒注射器小型O型圈 | Medmix | PPB-X05-04-02SM | 活塞B，5 ml，4:1，PE天然 |
| 双筒注射器盖帽 | Medmix | VLX002-SM | 盖帽，4:1/10:1，PE棕色，中等 |
| 双筒注射器大型O型圈 | Medmix | PPA-X05-04-02SM | 活塞A，5 ml，4:1 |
| 双筒注射器 | Medmix | SDL X05-04-50M | 双筒注射器，5 ml，4:1 |
| 双筒注射器分配器 | Medmix | DL05-0400M | 分配器，5 ml，4:1，中等，普通型 |
| 层粘连蛋白 | 3.6 mg/ml —— USC实验室提取 | ||
| 20 ml 注射器鲁尔锁头 | BD | 302830 | |
| 鲁尔锁帽 | Fisher | JGTCBLLX | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Gibco最低必需培养基10x（MEM） | Life Technologies | 1143-030 | |
| 胰蛋白酶 | Life Technologies | 27250-018 | |
| UV交联仪 | Spectroline UV | XLE1000 | |
| 氯化钠（NaCl） | Fisher | S271-10 | 用于配制Mosconas |
| 氯化钾（KCl） | Sigma-Aldrich | P5405-250 | 用于配制Mosconas |
| 碳酸氢钠（NaH3） | Fisher | BP328-500 | 用于配制Mosconas |
| 葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G-8270 | 用于配制Mosconas |
| 磷酸二氢钠（NaH2PO4） | Sigma-Aldrich | S-7907 | 用于配制Mosconas |
| 注射器用无菌滤器 | Corning | 431224 |
参考文献
- Kundu, J., Pati, F., Hun Jeong, Y., Cho, D. W., Cho, D. W. Biofabrication. Forgacs, G. abor, Sun, W. ei , William Andrew Publishing. 23-46 (2013).
- Vats, A., Tolley, N. S., Polak, J. M., Gough, J. E. Scaffolds and biomaterials for tissue engineering: a review of clinical applications. Clin. Otolaryngol. 28, 165-1....
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