调控效应CD4+ T细胞在炎症部位间质迁移的机制尚不明确。我们提出一种非侵入性方法，用于可视化观察并操控 体外-引发的CD4 T细胞在炎症耳部真皮中的动态行为研究 原位.
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
CD4 T细胞发挥效应功能的能力依赖于这些细胞通过某种尚未明确的机制，在炎症外周组织中快速而高效地迁移。将多光子显微技术应用于免疫系统研究，为在完整组织内测量免疫应答动态提供了有力工具。本文介绍了一种非侵入性活体多光子成像小鼠炎症耳部真皮中CD4 T细胞的实验方案。通过使用定制的成像平台和静脉导管，可实现对真皮间质中CD4 T细胞动态行为的可视化，并能够通过添加针对运动相关关键分子成分的阻断抗体，实时探究这些细胞的行为。该系统相较于传统方法具有多项优势 体外 模型和侵入性外科成像技术。深入了解CD4 T细胞运动所依赖的通路，最终可能揭示CD4 T细胞的基本功能，以及自身免疫性疾病和慢性感染所致病理的发病机制。
引言
CD4 T细胞的效应功能在很大程度上依赖于其快速进入并穿越多种外周组织的能力，以监测组织损伤、定位感染病灶，或在慢性感染及自身免疫状态下引发病理反应。尽管向炎症部位归巢的过程1-4 和外渗5-7 从血管进入组织的过程已被充分表征，但驱动和调控T细胞间质迁移的因素仍不明确。T细胞在复杂三维环境中的迁移已被研究 体外 通过使用人工基质8-10 或微流控装置11,12，但这些方法无法重现复杂且动态的体内环境 体内 系统。直到最近，随着高分辨率多色活体成像技术的出现，才使得研究免疫细胞的动态行为成为可能 原位，有助于更深入地理解完整的免疫应答。
十多年前，一些具有重要影响的研究首次利用双光子显微镜来解决免疫学问题并相继发表。早期的研究主要关注免疫细胞在离体淋巴器官中的行为13-16，随后很快发展出对麻醉小鼠暴露淋巴结进行成像的技术17。成像技术使得研究人员能够首次观察到T细胞在淋巴结中启动过程的各个阶段18、T细胞在次级淋巴器官中迁移的机制19、T细胞与其他免疫细胞之间的相互作用20,21，以及T细胞在淋巴结内的动态定位22。尽管早期许多研究集中于淋巴结内的动态过程，但活体成像技术此后已被广泛应用于多种外周组织中的....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
所有涉及小鼠的操作均经罗切斯特大学机构动物照护与使用委员会批准，并严格遵守美国农业部《动物福利法》以及美国国立卫生研究院实验室动物福利办公室管理的《公共卫生服务关于实验动物人道照护与使用的政策》执行。
1. 效应CD4 T细胞的制备
注意：BALB/c TCR转基因DO11.10小鼠可特异性识别来自鸡卵清蛋白的肽段（pOVA：ISQAVHAAHAEINEAGR）。其他TCR转基因系统也可替代使用，只需在指定位置用相应的同源肽段替代pOVA即可。
- 纯化初始型 CD4 T 细胞
- 通过将一只 6-8 周龄的雌性 DO11.10 BALB/c 小鼠暴露于 2 L/min 的 CO2 中，直至其连续 1 分钟无任何运动或呼吸迹象，随后进行颈椎脱位，或按照当地机构动物护理与使用委员会的指南实施安乐死。用 70% 乙醇溶液喷洒小鼠，并从其下颌开始沿腹部向下约三分之二处做一条长约 7 cm 的皮肤切口。从腹部切口末端向后肢方向做 2-3 cm 的皮肤切口。注意不要切开腹膜。
- 用镊子轻轻牵拉，小心地将皮肤与腹膜分离。腹股沟淋巴结位于皮肤上靠近后肢与躯干连接处的位置。用镊子夹取并摘除淋巴结，放入含 8 ml HBSS 并补充 2% 新生牛血清（NCS）的溶液中。
- 用镊子轻轻夹取并摘除小鼠的腋窝和臂部淋巴结，放入与腹股沟淋巴结相同....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
研究免疫反应的能力 原位 在不改变免疫环境的情况下，研究效应T细胞与炎症组织的实时相互作用至关重要。通过本方案对完整耳部真皮进行成像，其步骤概述如下： 图1A 和 B，可实现对迁移至真皮间质的荧光标记T效应细胞的可视化观察。这使得高分辨率（图1C）以及延时（图1D, 视频 1炎症真皮中效应T细胞动态的图像。
图1. 在完整真皮间质中对T效应细胞进行高分辨率及4D成像
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
意义
在此，我们提供了一套完整的方案，用于在完整小鼠耳部真皮中对转移的抗原特异性效应性Th1细胞进行4D可视化成像。该方法相较于当前一些成像技术具有多项优势。通过成像耳部腹侧真皮，可避免在对其他皮肤部位进行成像时通常所需的脱毛步骤。尽管脱毛剂通常较为温和，但已有研究表明其可能破坏皮肤屏障功能。 42，这一过程可刺激免疫反应 43,44通过避免采用侵入性外科手术暴露真皮或皮下组织，该方案可防止损伤诱导的炎症反应及中性粒细胞的快速募集。37 以及其它免疫细胞进入真皮。该系统采用静脉导管递送针对关键分子的阻断抗体，可实时探究CD4 T细胞的动态行为。该成像方案的应用揭示了CD4 T细胞在间质中运动所必需的关键条件。30 未在其中检测到的 体外 系统8.
实验步骤中的关键环节
任何成像方案中的一个关键步骤是确保组织样本.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢罗切斯特大学多光子显微镜核心设施在活体成像方面提供的帮助。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号分别为 AI072690 和 AI02851（授予 DJF）；AI114036（授予 AG）以及 AI089079（授予 MGO）。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| BALB/c小鼠 | 杰克逊实验室 | 000651 | 实验所用小鼠为本单位自行繁育 |
| DO11.10 小鼠 | 杰克逊实验室 | 003303 | 实验所用小鼠为本实验室自行繁育 |
| HBSS | Fisher | 10-013-CV | 多个等效 |
| 新生牛血清（NCS） | 赛默飞/海克隆 | SH30118.03 | 56℃热灭活 °30 分钟，37°C |
| 豚鼠补体 | Cedarlane | CL-5000 | |
| 抗CD8抗体 | ATCC | 3.155 (ATCC TIB-211) | 源自的抗体 该杂交瘤 |
| 抗MHC II类抗体 | ATCC | M5/114.15.2 (ATCC TIB-120) | 源自的抗体 该杂交瘤 |
| 抗CD24抗体 | ATCC | J11d.2 (ATCC TIB-183) | 源自的抗体 该杂交瘤 |
| 抗Thy1.2抗体 | ATCC | J1j.10 (ATCC TIB-184) | 源自的抗体 该杂交瘤 |
| Ficoll（Fico/Lite-LM） | Atlanta Biologicals | I40650 | |
| PBS | Fisher | 21-040-CV | 多个等效项 |
| EDTA | Fisher | 15323591 | |
| 生物素标记的抗CD62L抗体（克隆MEL-14） | BD | 553149 | |
| 链霉亲和素磁性分离珠 | Miltenyi | 130-048-101 | |
| MACS LS 分离柱 | Miltenyi | 130-042-401 | |
| 重组人IL-2 | Peprotech | 200-02 | |
| 重组小鼠IL-4 | Peprotech | 214-14 | |
| 重组小鼠IL-12 | Peprotech | 210-12 | |
| 抗IFNγ抗体（克隆XMG 1.2） | eBioscience | 16-7311-85 | |
| 抗IL-4抗体（克隆11b11） | eBioscience | 16-7041-85 | |
| RPMI | VWR | 45000-412 | |
| 青霉素/链霉素 | Fisher | 15303641 | |
| L-谷氨酰胺 | Fisher | 15323671 | |
| 2-巯基乙醇 | 伯乐（Bio-Rad） | 161-0710 | |
| 卵清蛋白肽 | 生物活性肽 | ISQAVHAAHAEINEAGR-OH 肽 | |
| 胎牛血清（FCS） | Thermo/HyClone | SV30014.03 | 56℃热灭活 °30 分钟，37°C |
| 24孔培养板 | LPS | 3526 | 多个等效 |
| CFSE | Life Technologies | C34554 | |
| CMTMR | Life Technologies | C2927 | |
| 28 支 G1/2 规格胰岛素注射器，1 ml | BD | 329420 | |
| 28 G1/2 胰岛素注射器，300 支μl | BD | 309301 | |
| 27 支 G1/2 TB 注射器，1 ml | BD | 309623 | |
| 30 G1/2 针头 | BD | 305106 | |
| PE-10 医用导管 | BD | 427400 | |
| 氰基丙烯酸酯兽用粘合剂（Vetbond） | 3M | 1469SB | |
| 加热板 | WPI | 61830 | |
| 加热板控制器 | WPI | ATC-2000 | |
| 水毯控制器 | 盖玛尔 | TP500 | 已停产，有更新的等效产品可供选择 |
| 水毯 | Kent Scientific | TP3E | |
| 异氟烷蒸发器 | LEI 医疗 | Isotec 4 | 已停止生产，有更新的等效产品可供选择 |
| 异氟烷 | Henry Schein | 通过兽医人员订购 | |
| 微量离心管 | VWR | 20170-038 | 多个等效项 |
| 医用胶带 | 3M | 1538-0 | |
| 异氟烷鼻罩 | 自行构建，见图2 | ||
| 成像平台 | 自行构建，见图2 | ||
| 弯头镊子 | WPI | 15915-G | 多个等效项 |
| 剪刀 | Roboz | RS-6802 | 多个等效项 |
| 玻璃盖玻片 | VWR | 多个等效项 | |
| 高真空润滑脂 | Fisher | 146355D | |
| 棉签 | 多个等效 | ||
| 精细操作擦拭 | Fisher | 34155 | 多个等效项 |
| 奥林巴斯Fluoview 1000 AOM-MPM直立显微镜，配备Spectra-Physics MaiTai HP DeepSee Ti:Sa激光器 | 奥林巴斯 | 询价 | |
| 带振动控制的光学平台 | 纽波特 | 索取报价 | |
| 25倍 NA 1.05 水浸物镜，用于多光子成像 | 奥林巴斯 | XLPLN25XWMP2 | |
| 目标加热器 | Bioptechs | PN 150815 | |
| 检测滤光片组 | Olympus | FV10-MRVGR/XR | 专用滤光立方体，可通过单个滤光片/二向色镜组合近似实现 |
| 抗整合素 β1 抗体（克隆 hMb1-1） | eBioscience | 16-0291-85 | 无叠氮化物，低内毒素 |
| 抗整合素 β3 抗体（克隆 2C9.G3） | eBioscience | 16-0611-82 | 无叠氮化物，低内毒素 |
| Texas Red 葡聚糖（70,000 MW） | Life Technologies | D-1830 |
参考文献
- Denucci, C. C., Mitchell, J. S., Shimizu, Y. Integrin function in T-cell homing to lymphoid and nonlymphoid sites: getting there and staying there. Critical reviews in immunology. 29 (2), 87-109 (2009).
- Gehad, A., et al.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
