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成像炎症真皮中CD4 T细胞的间质迁移

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DOI：

10.3791/53585

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2016年3月25日

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1David H. Smith Center for Vaccine Biology and Immunology, Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester School of Medicine and Dentistry, Rochester, NY

本文内容

摘要

调控效应CD4+ T细胞在炎症部位间质迁移的机制尚不明确。我们提出一种非侵入性方法，用于可视化观察并操控 体外-引发的CD4 T细胞在炎症耳部真皮中的动态行为研究 原位.

摘要

CD4 T细胞发挥效应功能的能力依赖于这些细胞通过某种尚未明确的机制，在炎症外周组织中快速而高效地迁移。将多光子显微技术应用于免疫系统研究，为在完整组织内测量免疫应答动态提供了有力工具。本文介绍了一种非侵入性活体多光子成像小鼠炎症耳部真皮中CD4 T细胞的实验方案。通过使用定制的成像平台和静脉导管，可实现对真皮间质中CD4 T细胞动态行为的可视化，并能够通过添加针对运动相关关键分子成分的阻断抗体，实时探究这些细胞的行为。该系统相较于传统方法具有多项优势 体外 模型和侵入性外科成像技术。深入了解CD4 T细胞运动所依赖的通路，最终可能揭示CD4 T细胞的基本功能，以及自身免疫性疾病和慢性感染所致病理的发病机制。

引言

CD4 T细胞的效应功能在很大程度上依赖于其快速进入并穿越多种外周组织的能力，以监测组织损伤、定位感染病灶，或在慢性感染及自身免疫状态下引发病理反应。尽管向炎症部位归巢的过程1-4 和外渗5-7 从血管进入组织的过程已被充分表征，但驱动和调控T细胞间质迁移的因素仍不明确。T细胞在复杂三维环境中的迁移已被研究 体外 通过使用人工基质8-10 或微流控装置11,12，但这些方法无法重现复杂且动态的体内环境 体内 系统。直到最近，随着高分辨率多色活体成像技术的出现，才使得研究免疫细胞的动态行为成为可能 原位，有助于更深入地理解完整的免疫应答。

十多年前，一些具有重要影响的研究首次利用双光子显微镜来解决免疫学问题并相继发表。早期的研究主要关注免疫细胞在离体淋巴器官中的行为13-16，随后很快发展出对麻醉小鼠暴露淋巴结进行成像的技术17。成像技术使得研究人员能够首次观察到T细胞在淋巴结中启动过程的各个阶段18、T细胞在次级淋巴器官中迁移的机制19、T细胞与其他免疫细胞之间的相互作用20,21，以及T细胞在淋巴结内的动态定位22。尽管早期许多研究集中于淋巴结内的动态过程，但活体成像技术此后已被广泛应用于多种外周组织中的免疫应答研究，包括脑23-25、肝26、肺27和皮肤28-30。

小鼠耳部真皮非常适合成像，因其耳部皮肤较薄、毛发相对稀疏，且易于与呼吸运动隔离31事实上，耳部真皮已被用于成像树突状细胞的间质行为32,33，T细胞28,29,34,35和中性粒细胞36,37，是研究皮肤炎症的成熟模型位点。近年来，非侵入性操作正逐渐取代包括分层真皮在内的外科皮肤制备方法38,39，侧翼39,40或背部皮肤瓣窗39,41 模型，可诱导局部炎症微环境的变化。采用转输的， 体外-引发的抗原特异性CD4效应T细胞可用于研究在皮肤炎症反应背景下细胞群体的同质性30在此，我们描述了一种非侵入性成像方法，该方法可实现对炎症小鼠耳部真皮间质中抗原特异性效应CD4 T细胞的可视化，并可通过静脉导管实时引入阻断抗体以操控这些细胞。我们证明，该模型可用于追踪CD4 T细胞在真皮中的迁移行为，并探究调控其运动机制的分子途径。

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方案

所有涉及小鼠的操作均经罗切斯特大学机构动物照护与使用委员会批准，并严格遵守美国农业部《动物福利法》以及美国国立卫生研究院实验室动物福利办公室管理的《公共卫生服务关于实验动物人道照护与使用的政策》执行。

1. 效应CD4 T细胞的制备

注意：BALB/c TCR转基因DO11.10小鼠可特异性识别来自鸡卵清蛋白的肽段（pOVA：ISQAVHAAHAEINEAGR）。其他TCR转基因系统也可替代使用，只需在指定位置用相应的同源肽段替代pOVA即可。

  1. 纯化初始型 CD4 T 细胞
    1. 通过将一只 6-8 周龄的雌性 DO11.10 BALB/c 小鼠暴露于 2 L/min 的 CO2 中，直至其连续 1 分钟无任何运动或呼吸迹象，随后进行颈椎脱位，或按照当地机构动物护理与使用委员会的指南实施安乐死。用 70% 乙醇溶液喷洒小鼠，并从其下颌开始沿腹部向下约三分之二处做一条长约 7 cm 的皮肤切口。从腹部切口末端向后肢方向做 2-3 cm 的皮肤切口。注意不要切开腹膜。
    2. 用镊子轻轻牵拉，小心地将皮肤与腹膜分离。腹股沟淋巴结位于皮肤上靠近后肢与躯干连接处的位置。用镊子夹取并摘除淋巴结，放入含 8 ml HBSS 并补充 2% 新生牛血清（NCS）的溶液中。
    3. 用镊子轻轻夹取并摘除小鼠的腋窝和臂部淋巴结，放入与腹股沟淋巴结相同的含 HBSS + 2% NCS 的溶液中。
    4. 用镊子摘除位于小鼠颈部的深部和浅表颈淋巴结，并放入与其他淋巴结相同的 HBSS + 2% NCS 溶液中。
    5. 小心切开腹膜，注意不要损伤肠道。用镊子夹住盲肠和结肠，暴露沿结肠分布的肠系膜淋巴结。用镊子小心摘除肠系膜淋巴结，并与其他淋巴结一同放置。
    6. 在腹腔内定位脾脏，用镊子夹住，同时用手术剪剪断周围结缔组织，小心摘除脾脏。将脾脏与淋巴结一同放置。
    7. 将含有脾脏和淋巴结的 HBSS + 2% NCS 溶液倒入置于 60 × 15 mm 培养皿中的金属筛网上，制备单细胞悬液。用 10 ml 注射器的推杆轻轻将脾脏和淋巴结压过金属筛网，使细胞进入 HBSS + 2% NCS 溶液中。
    8. 用移液器将细胞悬液转移至一个洁净的 50 ml 离心管中。用移液器以额外 10 ml HBSS + 2% NCS 冲洗金属筛网和培养皿，并将冲洗液加入同一 50 ml 离心管中。
    9. 以 600 × g 离心 5 分钟使细胞沉淀，然后用移液器轻轻吹打，将细胞重悬于 10 ml HBSS + 2% NCS 中。除非另有说明，所有离心步骤均应以 600 × g 离心 5 分钟进行。
    10. 取 10 µl 细胞悬液与 90 µl PBS 中的 0.1% 台盼蓝混合，制成 1:10 稀释液。用移液器将 10 µl 混合液加入血细胞计数板边缘的凹槽中。在血细胞计数板中央网格内计数白细胞，忽略体积略小、呈圆形、带红色的红细胞以及呈蓝色的死亡/濒死细胞。将计数所得细胞数乘以 104、稀释倍数（10）和细胞总体积（10 ml），以确定 50 ml 离心管中收集的总细胞数。
    11. 为富集 CD4 T 细胞，先将细胞离心沉淀，然后用移液器轻轻吹打，将细胞重悬于 HBSS + 2% NCS 溶液中，浓度为 2×107 个细胞/ml，溶液中含约 1 µg/ml 抗 CD8 抗体（克隆 3.155）、1 µg/ml 抗 MHC II 类抗体（克隆 M5/114）和 1 µg/ml 抗 CD24 抗体（克隆 J11d） 。
      注：本步骤所用抗体由实验室内部杂交瘤细胞系制备，浓度为估算值。适用于补体裂解的这些抗体的最佳浓度和体积系通过经验确定，不同实验室之间可能存在差异。此外，市面上已有多种可用于纯化初始型 CD4 T 细胞的商用试剂盒，可替代本方案中的补体裂解和 CD62L+ 纯化步骤。若采用其他方法纯化初始型 CD4 T 细胞，可从步骤 1.2 继续本方案。
    12. 冰上孵育 30 分钟。孵育结束时，将豚鼠补体置于 37 °C 水浴中约 2 分钟，迅速解冻。按每 1 ml 抗体溶液加入 100 µl 补体的比例，用移液器将补体直接加入细胞悬液中。将细胞置于 37 °C 水浴中孵育 30 分钟。
    13. 加入 HBSS + 2% NCS，使离心管中细胞总体积达到 20 ml。在细胞悬液下方小心加入 8 ml 室温密度梯度离心介质（密度为 1.086 g/ml）。关闭离心机制动，立即在室温下以 1400 × g 离心 15 分钟。
    14. 用移液管收集界面层细胞，转移至新的 50 ml 离心管中。用 HBSS + 2% NCS 将离心管内体积补至 50 ml，洗涤细胞后离心。
    15. 用移液器轻轻吹打，将细胞重悬于 MACS 缓冲液（含 2% NCS 和 2 mM EDTA 的 PBS）中，并参照步骤 1.1.10 的方法进行细胞计数。
    16. 为富集初始型 CD4 T 细胞，根据步骤 1.1.16 的计数结果，将细胞重悬于 MACS 缓冲液中，浓度为 2×107 个细胞/ml，溶液中含 2.5 µg/ml 生物素标记的抗 CD62L 抗体。冰上孵育 30 分钟。
    17. 加入 10 ml MACS 缓冲液洗涤细胞，然后离心。将细胞重悬于 MACS 缓冲液中，浓度为 107 个细胞/100 µl，直接向细胞中加入链霉亲和素偶联的磁珠，稀释比例为 1:10。冰上孵育 20 分钟。
    18. 参照步骤 1.1.17 的方法洗涤细胞，然后将细胞重悬于 MACS 缓冲液中，浓度为 2×108 个细胞/ml，体积至少为 500 µl。
    19. 将磁性分离柱插入磁力架中，加入 3 ml MACS 缓冲液流经柱体进行洗涤。用移液器将细胞加至柱上。
    20. 为去除未被磁柱结合的细胞，用移液器将 3 ml MACS 缓冲液加入柱中，使其流过柱体，重复 3 次。弃去穿流液。
    21. 将柱子从磁力架上取下，置于新的 50 ml 离心管上方。向柱中加入 5 ml MACS 缓冲液，并使用随柱附带的推杆将缓冲液推过柱体，洗脱结合在柱上的细胞，收集穿流液，其中含有富集的初始型 CD4 T 细胞。
    22. 离心细胞，然后将其重悬于 10 ml RPMI 培养基中，该培养基补充有 10% 胎牛血清（FCS）、100 I.U./ml 青霉素、100 µg/ml 链霉素、2 mM L-谷氨酰胺和 50 µM 2-巯基乙醇（RPMI-10）。参照步骤 1.1.10 的方法进行细胞计数。
    23. 将初始型 CD4 T 细胞的终浓度调整为 6×105/ml，溶于 RPMI-10 培养基中。
  2. 纯化去 T 细胞的脾源性抗原呈递细胞（APC）
    1. 参照步骤 1.1.1 的方法，对一只 6-8 周龄的雌性野生型 BALB/c 小鼠实施安乐死。
    2. 用 70% 乙醇溶液喷洒小鼠，并在其腹部左侧做一条长约 3 cm 的切口，暴露脾脏。切开腹膜层，用镊子轻轻夹住脾脏，同时用手术剪剪断其下方的连接组织，摘除脾脏。
    3. 将脾脏放入 8 ml HBSS + 2% NCS 溶液中。
    4. 通过研磨脾脏制备单细胞悬液，并进行洗涤和细胞计数，操作方法同前，参照步骤 1.1.7–1.1.10。
    5. 通过以 600 × g 离心 5 分钟 使细胞沉淀，去除 T 细胞。用移液器轻轻吹打，将细胞重悬于含约 1 µg/ml 抗 Thy1.2 抗体（J1J 克隆）的溶液中，细胞浓度为 2×107 个细胞/ml。冰上孵育 30 分钟。
      注：该抗体由实验室内部杂交瘤细胞系制备，浓度为估算值。适用于补体裂解的该抗体最佳浓度和体积系通过经验确定，不同实验室之间可能存在差异。如有需要，可采用其他方法从脾细胞中纯化 APC。从步骤 1.3 开始，应将初始型 T 细胞和 APC 置于培养体系中。
    6. 加入豚鼠补体，孵育，并参照步骤 1.1.13–1.1.14 的方法，在密度梯度离心介质中分离细胞。
    7. 将细胞重悬于 10 ml RPMI-10 培养基中，将离心管放入 γ 射线照射仪中进行照射，使细胞接受 25 Gy 辐射剂量。照射时间取决于照射仪型号，每次照射时均需重新计算。
    8. 参照步骤 1.1.10 的方法，使用血细胞计数板进行细胞计数，并将 APC 的终浓度调整为 2.4×106 个细胞/ml，溶于 RPMI-10 培养基中。
  3. 在 5 天培养中刺激细胞，并将 CD4 T 细胞分化为 Th1 表型。
    注：尽管本方案展示的是由初始型 CD4 T 细胞制备和成像 Th1 效应细胞的方法，但该方案可调整用于将初始型细胞分化为其他表型，或用于其他细胞类型（如 CD8 T 细胞）。引物刺激和分化的具体条件需通过实验经验确定。
    1. 在 24 孔培养板的每孔中加入 500 µl 初始型 CD4 T 细胞和 500 µl 经照射的 APC，使每孔终体积为 1 ml，含 3×105 个 T 细胞和 1.2×106 个 APC。
    2. 在 RPMI-10 培养基中配制溶液，含 2 µM 同源 OVA 肽、20 U/ml 重组 IL-2、80 µg/ml 抗 IL-4 抗体（克隆 11B11）和 40 ng/ml 重组 IL-12，使用 0.2 µm 注射器滤器过滤。向每孔细胞中加入 1 ml 该溶液，使每孔终体积为 2 ml。
    3. 将细胞置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中孵育 3 天。
    4. 第 3 天，轻轻吹打混匀细胞，将每孔中的 1 ml 培养液转移至新的培养孔中。每孔补充 1 ml RPMI-10 + 20 U/ml 重组 IL-2，使每孔终体积为 2 ml。
    5. 将培养板放回培养箱，继续培养至第 5 天。

2. 细胞转移与炎症诱导

注意：为了获得成像的最佳细胞数量，应将 5×106 个荧光标记的 Th1 细胞以 200 µl PBS 总体积转移至每只小鼠。此处细胞使用绿色染料 CFSE 或近红外染料 CMTMR 标记，但也可使用其他细胞示踪染料。CFSE 和 CMTMR 标记的细胞可共同转移，以实现对两个不同效应 CD4 细胞群的追踪。

  1. 用CFSE标记效应T细胞
    1. 通过在每个孔中剧烈吹打将细胞从培养皿中收集，并用移液器转移至无菌的50 ml离心管中。按照步骤1.1.10的方法计数细胞，然后离心并以107个细胞/ml的浓度重悬于PBS + 5% NCS中。
    2. 将5 mM的CFSE储备液用PBS按1:100稀释。每1 ml细胞悬液加入110 µl CFSE稀释液，将CFSE液滴加至管壁一侧，然后迅速来回轻摇离心管以充分混匀。
    3. 室温孵育5分钟 ，随后直接向细胞管中加入5 ml胎牛血清（FCS）以淬灭CFSE反应。再用PBS + 5% NCS补总体积至50 ml。
    4. 离心细胞，将沉淀以20 ml PBS + 5% NCS重悬。重复此洗涤步骤两次，共洗涤三次。如前（步骤1.1.10）使用血细胞计数板计数细胞，并将细胞重悬于无菌PBS中，浓度为2.5 × 107个细胞/ml，用于过继转移至小鼠体内。
  2. 用CMTMR标记效应T细胞
    1. 按步骤2.1.1所述方法收获细胞，计数后离心，并以107个细胞/ml的浓度重悬于RPMI-10培养基中。
    2. 将10 mM的CMTMR储备液直接加入细胞悬液中，终浓度为10 µM。迅速吹打混匀，确保染料充分分散并防止沉淀。
    3. 在37 °C水浴中孵育30分钟 。随后如步骤2.1.3–2.1.4所述，用PBS + 5% NCS洗涤细胞三次。计数后将细胞重悬于无菌PBS中，浓度为2.5 × 107个细胞/ml，用于过继转移至小鼠。
  3. 将效应T细胞转移至6–8周龄雌性BALB/c naïve小鼠
    1. 将细胞悬液（步骤2.1.4或2.2.3）吸入注射器中，必要时将针头朝上，轻弹注射器管壁并上下移动活塞，以彻底排除气泡。
    2. 将小鼠放入洁净笼中，在加热灯下轻微加热直至尾静脉扩张。将小鼠固定于束缚装置中，用酒精棉片擦拭尾部，缓慢向侧尾静脉注射200 µl细胞悬液。注射时应无明显阻力，且皮下无可见气泡形成。
  4. 通过完全弗氏佐剂（CFA）免疫诱导皮肤炎症
    注意：本方案中，通过皮内注射与特异性或非特异性抗原乳化的CFA诱导炎症反应。也可采用其他炎症模型替代，但过继转移的细胞数量及成像时间需根据经验进行调整。
    1. 在微量离心管中，用无菌PBS配制200 µM的OVA肽溶液。在肽溶液上方加入等体积的CFA。
    2. 用28 G1/2胰岛素注射器吸取混合液，再推回微量离心管中，重复此操作约20次以乳化。充分乳化后，CFA与肽溶液将形成浓稠且不透明的乳剂。
      注意：必须使用固定针头的胰岛素注射器进行乳化，因为非固定针头注射器的死腔会导致乳剂损失。
    3. 将少量乳剂滴入培养皿中的水面上进行测试，乳剂应保持完整而不扩散至水中。
    4. 将乳剂吸入300 µl容量的28 G1/2胰岛素注射器中，用力下压活塞以排除大气泡。
    5. 在荧光标记的效应T细胞过继转移后立即通过腹腔（i.p.）注射2,2,2-三溴乙醇（240 mg/kg）麻醉小鼠。通过轻捏脚趾评估麻醉深度，必要时以每次1 mg的增量追加麻醉剂。
      注意：可使用其他经批准的麻醉剂替代2,2,2-三溴乙醇。
    6. 将顶针戴在左手食指上，用左手拇指和食指轻轻夹住小鼠耳朵，使耳腹面朝上。注意避免对耳朵施加过大压力，以防造成皮肤机械性损伤。
    7. 将装有CFA乳剂的针头斜面朝上刺入耳皮下组织，缓慢注入10 µl乳剂。注射部位应位于耳廓外侧1/3区域，略微偏离中心，以便于后续成像。
    8. 持续监测小鼠直至麻醉作用消退，小鼠能够自主翻身并恢复活动能力。免疫后第3天进行成像，以确保炎症充分发展且过继转移的T细胞已迁移至耳部真皮层。
      注意：小鼠在麻醉期间不得无人看护。

3. 准备用于成像的小鼠

  1. 准备导管
    1. 使用镊子小心地从30 G1/2结核菌素（TB）注射器针头上取下金属针，并在解剖显微镜下观察，用以清除任何多余的胶水，确保胶水完全去除。
    2. 剪去另一根30 G1/2 TB注射器针头的尖端，通过目视检查确保剩余针头仍通畅。将一段18 cm长的PE-10医用导管套在修剪后的针头上，再小心地将裸露的金属针插入导管另一端约5 mm，制成导管。
  2. 用无菌PBS填充1 ml TB注射器，并排除所有气泡，然后冲洗导管。轻柔地将导管套在注射器尖端，缓慢推动PBS通过导管，以去除导管内的任何气泡。
    注意：推动液体通过导管时，必须用手握住导管与注射器连接处，防止液体压力将导管从注射器上冲脱。
  3. 将小鼠放入清洁的笼子中，在加热灯下轻微加热，直至尾静脉呈现血管扩张状态。通过已连接异氟烷蒸发器的鼻罩装置，以室温空气与异氟烷混合气体（5%诱导浓度，1–2%维持浓度，流速2 L/min）对小鼠进行麻醉。通过轻捏脚趾确认小鼠是否已进入麻醉状态。若观察到动物活动，可逐步增加0.1%异氟烷流量。在小鼠麻醉期间，使用眼用软膏覆盖眼睛，以防角膜干燥和损伤。
    注意：小鼠在麻醉过程中绝不能无人看管。应通过轻捏脚趾频繁监测麻醉深度。
  4. 用镊子固定尾巴根部，然后用酒精棉片擦拭尾部。小心地将导管插入侧尾静脉，并通过轻推注射器活塞检查导管通畅性。若位置正确，推动时应无阻力，且皮下无PBS气泡出现。在注射部位滴加1–2滴氰基丙烯酸酯组织粘合剂，将导管固定于尾部，静置约30秒使其干燥。
  5. 使用剪刀小心修剪小鼠耳部背面和侧面的毛发，注意避免损伤皮肤。同时修剪胡须。用棉签蘸取PBS湿润耳部内表面。
  6. 将小鼠和耳朵翻转放置于一块24 × 50 mm、No. 1.5规格的玻璃盖玻片上。使用镊子轻轻将耳朵展平贴附于盖玻片表面，必要时移动小鼠以确保耳朵完全与玻璃齐平。用纸巾轻轻吸除耳朵上多余的PBS。
    注意：切勿对耳朵施加过大压力，因皮肤较薄，过度按压易造成损伤。
  7. 使用两对弯头镊子，分别夹住一段约20 mm长的织物胶带顶部两角，沿长度方向拉直。将胶带底边贴在盖玻片上小鼠耳朵的上方，然后将胶带滚动覆盖整个耳朵，必要时用镊子将多余毛发拨开，以确保耳朵牢固贴附于盖玻片。用干燥棉签轻轻按压胶带边缘，确保密封紧密，注意避免直接按压耳朵本身。
  8. 用胶带将成像平台固定在37 °C加热块上。在成像平台耳部区域两侧涂抹真空润滑脂。将小鼠旋转至盖玻片贴合于成像平台，注意使耳朵居中对准毛毡区域。
    注意：避免将真空润滑脂沾到胶带上，否则会导致胶带从玻璃盖玻片上脱落。
  9. 将异氟烷鼻罩卡入成像平台上的固定架中，确保鼻罩稳固并完全覆盖小鼠鼻部。用干净干燥的棉签用力但小心地按压盖玻片，使真空润滑脂在下方均匀铺展。
  10. 用两段20 mm长的胶带以及两段较长的胶带缠绕平台上方，将盖玻片固定于平台。若耳朵与盖玻片之间存在气泡，可用折叠的纸片从下方轻柔按压予以排除。
    注意：切勿使用过厚的纸张或用力按压，以免引起组织苍白或损伤，干扰实验结果。
  11. 将小鼠移至显微镜载物台上，用胶带固定平台。在盖玻片周围耳朵外围挤上双层真空润滑脂，作为水浸物镜的液体储液槽。
  12. 通过成像平台将充满温水的加热毯包裹于小鼠身体周围。向储液槽中加入37 °C蒸馏水。确保所有部件均用胶带固定于载物台，且导管连接的注射器易于操作。

4. 在体实验 延时成像与静脉注射抗体给药

注意：本实验方案需要使用配备钛-蓝宝石激光系统的多光子显微镜。所用物镜为25倍放大、数值孔径1.05的镜头，并安装物镜加热器并设定为40 °C。该加热器的最佳温度经经验确定为可使耳部真皮组织维持在37 °C的适宜温度，但在其他成像系统中可能需要调整。所使用的采集软件可能因仪器而异，因此在不同配置的系统上操作时，可能需要对本方案进行相应调整。请确保图像能够以与所需分析软件兼容的格式保存。

  1. 通过目镜定位真皮层：将物镜置于耳片中心上方，缓慢降低物镜直至其接触储水槽中水面。使用外部光源，通过目镜观察，并继续缓慢降低物镜，直至耳片表面清晰对焦。放下显微镜载物台周围的内层和外层遮光帘。
  2. 确定显微镜设置并选择成像区域
    1. 成像前，通过在多光子激光控制器窗口中将激光波长调整为900 nm，在采集设置：激光窗口中调节激光功率，以及在图像采集控制窗口中调节光电倍增管（PMT）电压，以优化目标荧光染料的激发和检测效果。
      注意：本实验采用900 nm的激发波长，并使用滤光片检测二次谐波（420–460 nm）、CFSE（495–540 nm）和CMTMR（575–630 nm）。可根据需要采用其他配置以检测不同的荧光染料。
    2. 将显微镜在“采集设置：尺寸和模式”窗口中设定为 512 × 512 像素分辨率，像素驻留时间为 2 µsec/像素。激活实时成像模式，通过点击对组织进行扫描，以选择成像区域 "XY 重复序列"理想情况下，该区域应相对均匀，无气泡，并避开毛囊密集的区域。
      注意：CFA乳剂在绿色和近红色通道中具有强烈的自发荧光，应予以避免。通常可在乳剂边缘约3 mm处找到理想的观察区域。单幅图像中可追踪约10至100个细胞。若细胞密度过高，追踪软件在分离邻近细胞时通常会出现错误，导致细胞轨迹变短和/或不准确。
    3. 找到合适的成像视野后，通过定位细胞来确定将要成像的Z轴范围 "最高" 在真皮层中，通过单击将Z轴位置设置为0 "设为0" 按钮，并在Z方向上滚动以测量细胞深度。成像深度通常为35–75 µm。在“采集设置：显微镜”窗口中设定起始和终止位置。调整仪器的PMT电压和激光功率 "明亮的 Z" 通过调节窗口以优化在整个成像深度范围内对细胞的可视化观察。
      注意：避免将样品处的激光功率提高至25 mW以上，因为高功率可能导致真皮层产生热损伤和无菌性损伤。每台显微镜的合适最大功率水平各不相同，需进行实际测量。需要注意的是，在图像采集后的分析中，通过增加激光功率或光电倍增管（PMT）电压来补偿组织深度的影响，将无法实现不同深度图像亮度的定量比较。
    4. 检查 "深度" 和 "时间" 按钮下方的 "扫描" 在图像采集控制窗口中点击按钮。在图像采集控制：滤镜模式窗口中设置卡尔曼滤波器，使每行扫描图像3次，并在图像采集：显微镜窗口中调整Z轴切片深度，使完整图像堆栈的采集时间约为1分钟，具体时间可参考TimeView窗口中的显示。
      注意：各层图像之间的时间间隔不应超过约1分钟，因为更长的间隔会妨碍对快速迁移细胞的追踪。根据所成像细胞的类型，可能需要调整该时间间隔，以确保分析软件能够有效进行细胞追踪。Z轴切片厚度不应超过5 µm。通常情况下，对于1个样本，采用15至18层、每层厚度在2至5 µm之间的Z轴切片是合适的。 分钟 成像间隔
  3. 拍摄抗体处理前的时间序列图像
    1. 捕获 5 分钟 通过设置重复次数来获取该区域的时间序列图像，以评估组织的稳定性 "5" 在采集设置：TimeScan 窗口中单击 "扫描" 按钮。
      注意：组织 "漂移" 可能是由于未给予足够时间使耳朵达到热平衡、耳部准备不当，或由于耳部某一区域的局部漂移所致。如果5 分钟 图像不稳定时，应重新在真皮层选择新区域进行成像。若新区域的第二次成像仍不稳定，建议使用新的盖玻片，从步骤3.6开始仔细重复耳部制备和成像过程。
    2. 如果组织在 5 分钟 图像采集，在“采集设置：时间扫描”窗口中将重复次数设置为30至45次，以获取30-45分钟的时间序列图像，同时监测图像采集过程中是否存在轻微的组织漂移。将文件保存为与后续分析软件兼容的格式。
      注意：在此步骤中，可重复步骤 4.2.2 - 4.3.2 以对同一只耳朵的多个位置进行成像。单只小鼠的麻醉时间不应超过 4 小时，否则死亡风险增加。
  4. 注射阻断抗体并采集抗体处理后的图像。
    1. 将抗体混合物吸入1 ml TB注射器中，并取下针头，确保去除所有气泡。推动活塞，使抗体溶液形成液滴 "液滴" 在注射器末端。
    2. 抬起手术区域周围的帘布，找到导管。将导管上原有的含PBS的注射器取下。在不放下导管的情况下，小心地将装有抗体的新注射器连接至导管。握住导管末端并将其固定在注射器上，缓慢将抗体混合液注入导管中。确保注射过程中无阻力。
    3. 放下导管，降下显微镜载物台周围的遮光帘。记录注射时间，并立即使用与注射前图像相同的仪器设置，在同一位置开始采集一段新的20–40分钟成像序列。将文件保存为适用于后续分析软件的格式。
      注意：在拍摄延时图像的间隔期间，需观察小鼠的麻醉深度和呼吸情况。在给予抗体后，不建议对多个视野进行成像，因为抗体的清除速率可能存在差异。
  5. 注射荧光标记的葡聚糖以定位血管、评估导管通畅性并测量血管通透性
    1. 配制2 mg/ml的荧光标记葡聚糖（70,000 MW）溶液：将试剂溶于100 µl无菌PBS中，吸入注射器，排除所有气泡。
    2. 采用与步骤4.4.1-4.4.2相同的技术，将注射器连接至导管，静脉内注射葡聚糖溶液。
    3. 在采集设置：模式窗口中，将分辨率更改为1024 × 1024像素，使用与延时图像相同的PMT和激光设置，采集单幅图像栈。为采集图像，取消勾选 "时间" 按钮位于下方 "扫描" 按钮，然后单击 "扫描" 按钮。该3D图像可用于排除位于血管内的T细胞，并证实导管通畅且正确插入。荧光葡聚糖从血管中扩散的现象也可用于评估局部血管通透性。
      注意：此高分辨率（1024 × 1024）静态图像用于展示目的，也可用于与延时成像相同区域的组织结构分析。或者，可采集512 × 512图像，并使用图像分析软件将其与延时图像合并。根据各实验室的研究需求，也可对葡聚糖给药过程进行延时成像。在此情况下，图像采集设置应按照步骤4.2.3–4.3.2进行。
  6. 成像完成后，小心地将小鼠从物镜下取出，并解开保温水毯。通过剪断胶带并轻轻抬起盖玻片直至其脱离，将其从成像平台移除。在小鼠仍处于麻醉状态下，将耳朵从盖玻片上分离。若为终点实验，采用颈椎脱臼法处死小鼠。若需保留小鼠用于重复成像，则将其放回一个独立于其他小鼠的清洁笼具中，并持续观察直至小鼠能够自主翻身并正常行走。待小鼠完全从麻醉中恢复后，可将其放回与其他动物共处的笼具中。
  7. 将成像文件导入图像分析软件，并进行所需的任何校正。建议避免使用非线性增强以及自动平滑或降噪程序和算法。通常情况下，分析前仅需通过手动提高图像黑场点对背景进行轻微校正。使用自动细胞追踪程序结合人工校正分析成像数据，方法如 Overstreet, Gaylo 所述 等30.  
    注意：有许多可用于量化本实验方案所获得的多光子图像中细胞动态的图像分析软件套件，包括专有软件和开源软件。具体的图像分析方法及最佳软件选择将取决于各实验室的具体研究需求。

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结果

研究免疫反应的能力 原位 在不改变免疫环境的情况下，研究效应T细胞与炎症组织的实时相互作用至关重要。通过本方案对完整耳部真皮进行成像，其步骤概述如下： 图1A 和 B，可实现对迁移至真皮间质的荧光标记T效应细胞的可视化观察。这使得高分辨率（图1C）以及延时（图1D, 视频 1炎症真皮中效应T细胞动态的图像。

使用CFSE标记和二次谐波成像T细胞的过程；包括Th1细胞培养示意图。
图1. 在完整真皮间质中对T效应细胞进行高分辨率及4D成像

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讨论

意义

在此，我们提供了一套完整的方案，用于在完整小鼠耳部真皮中对转移的抗原特异性效应性Th1细胞进行4D可视化成像。该方法相较于当前一些成像技术具有多项优势。通过成像耳部腹侧真皮，可避免在对其他皮肤部位进行成像时通常所需的脱毛步骤。尽管脱毛剂通常较为温和，但已有研究表明其可能破坏皮肤屏障功能。 42，这一过程可刺激免疫反应 43,44通过避免采用侵入性外科手术暴露真皮或皮下组织，该方案可防止损伤诱导的炎症反应及中性粒细胞的快速募集。37 以及其它免疫细胞进入真皮。该系统采用静脉导管递送针对关键分子的阻断抗体，可实时探究CD4 T细胞的动态行为。该成像方案的应用揭示了CD4 T细胞在间质中运动所必需的关键条件。30 未在其中检测到的 体外 系统8.

实验步骤中的关键环节

任何成像方案中的一个关键步骤是确保组织样本...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。 

致谢

作者感谢罗切斯特大学多光子显微镜核心设施在活体成像方面提供的帮助。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号分别为 AI072690 和 AI02851（授予 DJF）；AI114036（授予 AG）以及 AI089079（授予 MGO）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
BALB/c小鼠杰克逊实验室000651实验所用小鼠为本单位自行繁育
DO11.10 小鼠杰克逊实验室003303实验所用小鼠为本实验室自行繁育
HBSSFisher10-013-CV多个等效
新生牛血清（NCS）赛默飞/海克隆SH30118.0356℃热灭活 °30 分钟，37°C
豚鼠补体CedarlaneCL-5000
抗CD8抗体ATCC3.155 (ATCC TIB-211)源自的抗体  该杂交瘤
抗MHC II类抗体ATCCM5/114.15.2 (ATCC TIB-120)源自的抗体  该杂交瘤
抗CD24抗体ATCCJ11d.2 (ATCC TIB-183)源自的抗体  该杂交瘤
抗Thy1.2抗体ATCCJ1j.10 (ATCC TIB-184)源自的抗体  该杂交瘤
Ficoll（Fico/Lite-LM）Atlanta BiologicalsI40650
PBSFisher21-040-CV多个等效项
EDTAFisher15323591
生物素标记的抗CD62L抗体（克隆MEL-14）BD553149
链霉亲和素磁性分离珠Miltenyi130-048-101
MACS LS 分离柱Miltenyi130-042-401
重组人IL-2Peprotech200-02
重组小鼠IL-4Peprotech214-14
重组小鼠IL-12Peprotech210-12
抗IFNγ抗体（克隆XMG 1.2）eBioscience16-7311-85
抗IL-4抗体（克隆11b11）eBioscience16-7041-85
RPMIVWR45000-412
青霉素/链霉素Fisher15303641
L-谷氨酰胺Fisher15323671
2-巯基乙醇伯乐（Bio-Rad）161-0710
卵清蛋白肽生物活性肽ISQAVHAAHAEINEAGR-OH 肽
胎牛血清（FCS）Thermo/HyCloneSV30014.0356℃热灭活 °30 分钟，37°C
24孔培养板LPS3526多个等效
CFSELife TechnologiesC34554
CMTMRLife TechnologiesC2927
28 支 G1/2 规格胰岛素注射器，1 mlBD329420
28 G1/2 胰岛素注射器，300 支μlBD309301
27 支 G1/2 TB 注射器，1 mlBD309623
30 G1/2 针头BD305106
PE-10 医用导管BD427400
氰基丙烯酸酯兽用粘合剂（Vetbond）3M1469SB
加热板WPI61830
加热板控制器WPIATC-2000
水毯控制器盖玛尔TP500已停产，有更新的等效产品可供选择
水毯Kent ScientificTP3E
异氟烷蒸发器LEI 医疗Isotec 4已停止生产，有更新的等效产品可供选择
异氟烷Henry Schein通过兽医人员订购
微量离心管VWR20170-038多个等效项
医用胶带3M1538-0
异氟烷鼻罩自行构建，见图2
成像平台自行构建，见图2
弯头镊子WPI15915-G多个等效项
剪刀RobozRS-6802多个等效项
玻璃盖玻片VWR多个等效项
高真空润滑脂Fisher146355D
棉签多个等效
精细操作擦拭Fisher34155多个等效项
奥林巴斯Fluoview 1000 AOM-MPM直立显微镜，配备Spectra-Physics MaiTai HP DeepSee Ti:Sa激光器奥林巴斯询价
带振动控制的光学平台纽波特索取报价
25倍 NA 1.05 水浸物镜，用于多光子成像奥林巴斯XLPLN25XWMP2
目标加热器BioptechsPN 150815
检测滤光片组OlympusFV10-MRVGR/XR专用滤光立方体，可通过单个滤光片/二向色镜组合近似实现
抗整合素 β1 抗体（克隆 hMb1-1）eBioscience16-0291-85无叠氮化物，低内毒素
抗整合素 β3 抗体（克隆 2C9.G3）eBioscience16-0611-82无叠氮化物，低内毒素
Texas Red 葡聚糖（70,000 MW）Life TechnologiesD-1830

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