生成一个 "人源化" 果蝇 对Kinesin-5药物抑制敏感的S2细胞系

摘要

本方案描述了如何生成一个 果蝇 对驱动蛋白-5小分子抑制剂敏感的S2细胞系。还概述了这些细胞在基于细胞的错误校正检测中的应用。

摘要

动粒是细胞分裂期间在着丝粒上组装的大型蛋白质结构，负责将染色体与纺锤体微管连接。要确保遗传物质正确分配，每条染色体上的姐妹动粒必须在进入后期之前，通过与来自相反纺锤极的微管相连而实现双定向。然而，错误的、非双定向的连接状态十分常见，细胞中存在相应的通路来检测并纠正细胞分裂过程中的此类连接。这一破坏不正确的动粒-微管相互作用的过程被称为错误纠正。为了在活细胞中研究错误纠正过程，可通过化学抑制驱动蛋白-5（kinesin-5）马达蛋白人为诱导产生错误连接，从而形成单极纺锤体，随后通过洗脱药物观察从错误定向向双定向的转变过程。许多常用的模式组织培养细胞含有大量染色体，这为观察单个错误纠正事件带来了挑战。Drosophila S2 细胞是此类研究更理想的对象，因其仅有4对染色体。然而，小分子驱动蛋白-5抑制剂对Drosophila的驱动蛋白-5（Klp61F）无效。本文介绍如何构建一种Drosophila细胞系，该细胞系可有效用人源驱动蛋白-5替代Klp61F，从而使细胞对药物抑制该马达蛋白产生敏感性，并适用于基于细胞的错误纠正检测实验。

引言

细胞分裂过程中基因组的均等分离依赖于复制后的DNA与纺锤体微管之间的正确相互作用。微管通过一组在着丝粒上组装的蛋白质复合物——即动粒¹——与染色体发生物理相互作用。染色体的正确分配要求姐妹动粒实现双极取向，即每条姐妹染色单体分别与来自相反纺锤极的微管相连。非双极取向的动粒微管（kt-MT）连接会迅速而高效地被破坏，从而为建立正确的双极取向提供机会，这一过程称为错误校正。先前在哺乳动物细胞中建立的一种错误校正检测方法⁵，需要利用可逆的小分子抑制剂作用于Eg5（驱动蛋白-5）以诱导单极纺锤体的形成。药物处理可产生大量错误的同极连接，即两个姐妹动粒均连接到同一纺锤极。随后洗脱药物可实现对错误校正过程的可视化观察。该错误校正检测可在小分子抑制剂存在或基因敲降条件下进行，以研究候选蛋白在纠正错误kt-MT连接中的作用。

在活细胞中可视化观察错误校正过程，是进一步理解该复杂过程所涉分子机制的有力工具。然而，大多数细胞系含有大量染色体，这为观察单个动粒-微管（kt-MT）连接带来了挑战。Drosophila S2 细胞是应用错误校正检测的理想材料，因其染色体数目可少至4条⁶，但诸如S-三苯甲基-L-半胱氨酸（STLC）和莫那司他（monastrol）^7-9等驱动蛋白-5小分子抑制剂在Drosophila细胞中并不影响纺锤体组装或驱动蛋白-5的马达功能。因此，我们构建了一种表达人源驱动蛋白-5的Drosophila S2细胞系，该表达受可诱导启动子调控，并对驱动蛋白-5抑制剂敏感。本实验方案描述了如何敲低内源性的Drosophila驱动蛋白-5同源蛋白Klp61F，并利用该细胞系进行基于细胞的错误校正检测。

方案

1. 转染S2细胞

1. 从先前培养的 25 cm² 培养瓶中，将表达 GFP-α-微管蛋白的 S2 细胞¹⁰加入至终体积为 2 ml 并达到 100% 汇合度，使其在 35 mm 组织培养皿底部半贴壁约 1 小时。
2. 移除培养皿中的培养基。将 2 µg Eg5-mCherry 质粒¹¹与 1 ml 含 10% 胎牛血清的 Schneider 培养基（以下简称 Schneider 培养基）及转染试剂混合，按照制造商说明书进行转染。用封口膜密封培养皿，并在 25 °C 下孵育 16–18 小时。
3. 加入 1 ml Schneider 培养基。将细胞放回 25 °C 培养箱中继续培养。
4. 转染后第 3 天，将 500 µl 转染细胞转移至一个新的含有 1.5 ml Schneider 培养基的 35 mm 组织培养皿中进行诱导测试。通过加入 CuSO₄ 至终浓度 500 µM 以诱导 Eg5-mCherry 的表达。用封口膜密封培养皿，并在 25 °C 过夜孵育。
5. 制备刀豆球蛋白 A 包被的盖玻片时，用移液器吸取足量刀豆球蛋白 A 溶液（0.5 mg/ml 溶于 H₂O）覆盖经酸洗处理的盖玻片，去除多余液体，让盖玻片自然风干。
6. 将一块 22 mm × 22 mm 的刀豆球蛋白 A 包被盖玻片放入洁净的 35 mm 组织培养皿中，然后将 500 µl 处于 100% 汇合度的诱导后细胞接种到盖玻片上，在室温下孵育 1 小时使细胞贴附。
7. 为检测 Eg5-mCherry 的表达情况，将盖玻片装配成玫瑰腔室（或合适的成像容器），加入成像培养基，在荧光显微镜下室温观察。使用适当的光源和滤光片组观察细胞。例如，本研究所用显微镜配备 LED 白光光源以及 EGFP（FITC/Cy2）和 DSRed（TRITC/Cy3）滤光立方体。Eg5-mCherry 定位于微管，并在纺锤体极区富集。
8. 确认细胞同时表达 Eg5-mCherry 和 GFP-α-微管蛋白后，将剩余的未诱导转染细胞转移至含有 4 ml Schneider 培养基的 25 cm² 组织培养瓶中。
9. 向转染细胞培养瓶中加入杀稻瘟菌素 S HCl，使其终浓度为 25 μg/ml，并在持续添加 25 μg/ml 杀稻瘟菌素 S HCl 的条件下传代培养，直至细胞死亡停止，期间需定期检测 Eg5-mCherry 的表达情况。将细胞系置于 25 °C 培养箱中孵育。
   注意：表达 Eg5-mCherry 的细胞比例随时间逐渐增加。
10. 待细胞稳定转染后，继续在无药物条件下传代培养，并将细胞冻存¹²以备将来使用。

2. RNA干扰

1. 使用带有T7启动子序列的引物（引物序列见材料列表）对来自cDNA（LD15641）的Klp61F基因约500 bp区域进行PCR扩增，所得产物将作为dsRNA合成的模板。
   1. 设置四个PCR反应，每个反应体积为50 µl，包含100 ng模板DNA、每种引物25 µM、适当的缓冲液和聚合酶。根据聚合酶生产商提供的说明，在热循环仪上设定PCR程序。
   2. 使用PCR纯化试剂盒按照生产商说明书合并并纯化四个PCR反应产物。将纯化后的模板储存于-20 °C。
2. 使用T7 RNA转录试剂盒，按照生产商说明书从模板制备双链RNA（dsRNA）。预期dsRNA浓度约为5–15 mg/ml。将dsRNA储存于-20 °C。
3. 为利用dsRNA敲低Klp61F，将表达Eg5-mCherry的S2细胞以25%汇合度接种于35 mm组织培养皿中，使其在室温下静置1小时，部分贴壁。
4. 移除培养皿中的培养基，并加入5 µg针对Klp61F（果蝇kinesin-5）的dsRNA，用1 ml无血清Schneider's培养基稀释后加入。
5. 室温孵育1小时，然后加入1 ml含10% FBS的Schneider's培养基。将细胞在25 °C下继续培养。
6. dsRNA处理24小时后，通过加入CuSO₄至终浓度500 µM诱导Eg5-mCherry表达。继续在25 °C下孵育细胞24小时。 

3. 活细胞成像

1. 将一块22 mm × 22 mm的刀豆球蛋白A包被盖玻片放入洁净的35 mm组织培养皿中。
2. 将经dsRNA处理并诱导过夜的细胞接种500 µl至刀豆蛋白A包被的盖玻片上，孵育约1小时以使细胞贴壁。
3. 将盖玻片组装到玫瑰腔室（或合适的容器）中用于成像。
4. 寻找同时表达 Eg5-mCherry 和 GFP-α-tubulin 的有丝分裂细胞。
   注意：由于Klp61F（维持纺锤体双极性所必需的蛋白）被敲低，仅表达GFP-α-微管蛋白的有丝分裂细胞应呈现单极纺锤体^10,13.
5. 收集双极纺锤体的时间序列图像（例如， 每分钟1帧，在共表达Eg5-mCherry和GFP-α-tubulin的细胞中。
6. 成像过程中，从玫瑰腔室中移除培养基，并通过连续三次更换培养基（总计约5 ml），向腔室内加入含1 µM STLC的Schneider培养基，以观察纺锤体解聚现象。
7. 为洗去药物并逆转纺锤体塌陷，小心地从玫瑰池中移除含STLC的培养基，用Schneider培养基清洗4次（共6–8 ml），然后最后一次用新鲜培养基重新填充玫瑰池。继续成像。

4. 错误校正实验

1. 将一块22 mm × 22 mm的刀豆蛋白A（concanavalin A）包被盖玻片放入洁净的35 mm组织培养皿中。
2. 将500 µl经Klp61F dsRNA处理的细胞接种到刀豆蛋白A包被的盖玻片上，使其贴壁。
3. 待细胞贴壁后，向每孔中加入1.5 ml Schneider's培养基，使最终体积达到2 ml。
4. 为将细胞阻滞在有丝分裂期，向每个培养皿中加入MG132，使其终浓度为10 µM，并孵育1小时。
5. 加入1 µM STLC，孵育1小时，以诱导单极纺锤体形成。
6. 每次用2 ml新鲜Schneider's培养基冲洗盖玻片3次，以洗去STLC。
7. 将盖玻片继续在Schneider's培养基中孵育，并加入药理学药物（例如，Aurora激酶抑制剂）或DMSO作为对照。
   注意：抑制剂的浓度因实验而异，最终浓度需由实验者确定。通常将抑制剂配制成母液，使其在培养基中的稀释倍数为1:1,000。在此情况下，1:1,000稀释的DMSO（或相应溶剂）作为溶剂对照。我们使用Aurora B抑制剂Binucleine 2，终浓度为40 µM。
8. 在不同时间点固定细胞，以观察双极纺锤体形成的进程并评估动粒连接状态。固定步骤如下：
   1. 用2 ml 1× BRB-80快速冲洗盖玻片。
   2. 加入2 ml用1× BRB-80稀释的10%多聚甲醛，固定10分钟。在通风橱中小心移取多聚甲醛。
   3. 用2 ml 1× PBS + 1% Triton-X处理8分钟，以通透细胞。
   4. 用2 ml 1× PBS + 0.1% Triton-X洗涤3次。
   5. 将盖玻片细胞面向上转移至150 mm培养皿中的Parafilm膜上（可用记号笔在Parafilm膜上做适当标记以区分不同样本）。
   6. 每张盖玻片上覆盖150 µl煮沸的驴血清（BDS），室温孵育1小时，以阻断非特异性抗体结合。
      注意：此处可暂停固定流程，待后续继续进行。盖玻片可在4 °C湿润盒中保存最多24小时。制备湿润盒时，用湿的实验室擦拭纸沿150 mm培养皿边缘铺一圈，然后盖上培养皿盖。
   7. 去除阻断液，加入150 µl用BDS适当稀释的一抗溶液，室温孵育1小时，用于标记动粒和微管，其终浓度分别为2 µg/ml（或按厂家推荐浓度）和1 µg/ml。
      注意：此处也可暂停固定流程，待后续继续进行。盖玻片可在4 °C湿润盒中保存最多24小时。
   8. 用500 µl 1× PBS + 0.1% Triton-X洗涤盖玻片3次。
   9. 加入用BDS稀释的适当荧光标记二抗，室温孵育30–60分钟。
   10. 用500 µl 1× PBS + 0.1% Triton-X洗涤盖玻片3次。
   11. 加入含DAPI（终浓度1 µg/ml）的150 µl BDS，孵育5分钟。
   12. 用1× PBS + 0.1% Triton-X洗涤2次，然后将盖玻片细胞面向下封片于3×1"载玻片上，滴加8 µl封片剂。用指甲油涂抹盖玻片四角，以固定其位置。
9. 对表达Eg5-mCherry且具有双极纺锤体的细胞进行成像。使用100X物镜，在所有通道中采集Z轴序列图像，共30层，层间间隔0.2 µm。仔细分析动粒与微管，以确定其连接状态（双定向或同向连接）。

结果

Klp61F 对于形成双极纺锤体是必需的。人类驱动蛋白-5（Eg5）可以在 Drosophila S2 细胞中挽救 Klp61F 的功能（图 1A 和 D）。当加入驱动蛋白-5 抑制剂（STLC）后，在成功进行 RNAi 并缺失内源性 Klp61F 的细胞中，马达蛋白在微管上的结合水平下降（图 1B 和 E），纺锤体发生塌陷，形成单极结构（图 1C 和 F）（补充视频 1）。值得注意的是，在人源化 S2 细胞中加入 STLC 后双极纺锤体会发生塌陷，而驱动蛋白-5 的活性在人类细胞中并非维持纺锤体双极性所必需。这一有趣的差异可能是由于两种模型系统中间极微管重叠程度和/或稳定性的不同所致¹⁴。驱动蛋白-5 的抑制作用（图 2A 和 E）可通过洗脱药物来逆转，并可随时间观察双极纺锤体的恢复过程。当去除抑制剂后（图 2B 和 F），随着双极纺锤体的重新组装，Eg5-mCherry 重新与微管结合（图 2C 和 G），细胞可进入双极后期（图 2D 和 H，补充视频 2）。

图1. 添加1 µM STLC会导致单极纺锤体的形成 黑腹果蝇 S2细胞 时间延时成像的代表性图像 果蝇 表达 Eg5-mCherry 的 S2 细胞（A-C）和GFP-α-微管蛋白（D-F) 加入1 µM STLC期间。Eg5抑制剂在3分钟时添加。比例尺 = 5 µm。时间戳 = 分:秒。 请点击此处以查看此图的放大版本。

图 2. 去除STLC后双极纺锤体重新形成。 在STLC洗脱实验过程中，表达Eg5-mCherry（A-D）和GFP-α-微管蛋白（E-H）的Drosophila 2细胞的延时成像代表性图像。STLC在5分钟时被洗脱。去除STLC后1小时内双极纺锤体重新形成。比例尺 = 5 µm。时间戳：分:秒。请点击此处查看此图的放大版本。

补充视频 1。（右键单击以下载） 宽视野荧光成像的代表性示例 黑腹果蝇 表达Eg5-mCherry（左）和GFP-α-tubulin（右）的S2细胞。在2分钟时加入1 µM STLC，抑制剂加入后10分钟内纺锤体形成单极结构。图像每1分钟采集一次，以每秒10帧的速度播放。比例尺 = 5 µm。

补充视频 2。（右键单击可下载）。 表达 Eg5-mCherry（左）和 GFP-α-tubulin（右）的代表性 Drosophila S2 细胞的宽场荧光成像。在 5 分钟时移除含有 1 µM STLC 的培养基并进行冲洗。在去除抑制剂后 1 小时内，双极纺锤体重新形成。图像每 1 分钟采集一次，以每秒 10 帧的速度播放。比例尺 = 5 µm。

讨论

可视化错误校正是一种研究这一重要而复杂的细胞过程所涉及步骤的有价值技术。为此，可使用可逆性抑制剂诱导产生错误的连接，随后通过洗脱药物来观察错误校正过程。该检测方法最初是利用哺乳动物组织培养细胞开发的⁵。然而，许多常用的哺乳动物细胞模型含有大量的动粒，这为观察单个错误校正事件带来了挑战。Drosophila S2 细胞仅含有 4 对动粒，因此是观察错误校正更为理想的细胞系。但其主要缺点在于许多抑制剂在 Drosophila S2 细胞中无效。因此，构建一种表达人源驱动蛋白-5（kinesin-5）的类人化 Drosophila S2 细胞系，为研究错误校正提供了一种有价值的工具。

尽管 果蝇 S2 细胞可能是研究错误校正机制更合适的细胞系，但获得该细胞系并敲低必需基因所涉及的多个步骤为此技术带来一定挑战。例如，转染效率可能相当低。如果表达 Eg5-mCherry 的细胞少于 20%，则应重复转染，否则筛选过程将耗时更长。此外，同时表达两种荧光蛋白的细胞比例可能随时间推移而下降。这一问题可通过在 Blasticidin S HCl 和 Hygromycin B 存在下传代培养细胞来克服，以分别筛选表达 Eg5-mCherry 和 GFP-α-tubulin 的细胞。还需注意的是 黑腹果蝇 S2 细胞具有许多人类蛋白质的同源物；因此，优化内源性蛋白质的基因敲低条件至关重要。最佳敲低条件可能因双链 RNA 的用量和处理时间的长短而异。考虑到 CRISPR-Cas9 技术的出现及其快速发展^15-17，生成一个 果蝇 Klp61F 基因被人类 Eg5 基因取代的细胞系为克服转染与基因敲低方法的局限性提供了一种强有力的替代方案。我们的研究表明，在此情况下，果蝇到人类的基因替换应是一种可行的选择，尽管实现该方法所需的必要试剂在 黑腹果蝇 S2 细胞目前正在开发中。

该实验方法不仅限于Eg5，也可用于研究其他目标蛋白的功能。如果使用已知在黑腹果蝇（Drosophila）S2细胞中无效的抑制剂，本方案可进行修改，以研究这些抑制剂在活细胞中的直接作用，而无需担心脱靶效应。利用本方案构建的细胞系还可用于高通量筛选分析，以鉴定可能靶向参与错误校正过程蛋白的候选药物。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Effectine 转染试剂	Qiagen	301425
Klp61F cDNA	果蝇基因组资源中心	13690	基因名称 LD15641
Schneider’s 培养基	Invitrogen	21720-024
胎牛血清，经认证	Invitrogen	10082-147	热灭活，来源美国
硫酸铜(II) (CuSO4)	Sigma	C8027-500G	500 mM 储存液
S-三苯甲基-L-半胱氨酸	Sigma	164739-5G	1 mM DMSO 储存液
杀稻瘟菌素 HCl	Invitrogen	R21001	5 mg/ml 储存液（溶于 1× PBS）
潮霉素 B	Invitrogen	10687010
T7 大规模 RNA 合成系统	Promega	P1320	每反应生成的双链 RNA 浓度约为 5–15 µg/µl
Klp61F RNAi 正向引物	Invitrogen		TAATACGACTCACTATAGGGTA-TTTGCGCATTATTTTAAAA
Klp61F RNAi 反向引物	Invitrogen		TAATACGACTCACTATAGGGAT-ATTGATCAATTGAAAC
PCR 纯化试剂盒	Mo Bio Laboratories, Inc	1250
刀豆蛋白 A	Sigma	C5275	0.5 mg/ml 溶液，溶于 1× PBS 配制
煮沸驴血清	Jackson ImmunoResearch Labs	017-000-121	5% 储存液（溶于 1× PHEM 缓冲液），加热至沸腾。储存于 4 °C。
封片剂			20 mM Tris（pH 8.0）， 0.5% N-丙基没食子酸酯，90% 甘油。储存于 4 °C。
1× BRB-80			80 mM PIPES（pH 6.9）；1 mM EGTA；1 mM MgCl2
白光光源	Lumencor Inc
ET EGFP 滤光立方体	Chroma	49002
DSRed 滤光立方体	Chroma	49005
抗 NDC80 抗体			由 Maresca 实验室定制制备
DM1α（抗α-微管蛋白）	Sigma	T6199
抗 CID 抗体	AbCam	ab10887