生成一个"人性化"果蝇 S2细胞敏感的驱动蛋白-5的药理抑制

Summary

该方案描述了如何生成对驱动蛋白-5 的小分子抑制剂敏感的果蝇 S2 细胞系。还概述了这些细胞在基于细胞的误差校正测定中的使用。

Abstract

着丝粒是基于蛋白质的大结构，在细胞分裂过程中组装在着丝粒上，并将染色体连接到纺锤体微管。遗传物质的适当分布要求每条染色体上的姐妹着丝粒在进入后期之前通过从相对纺锤体极附着在微管上而变得双向。然而，错误的、非双向的附着状态很常见，并且存在细胞通路来检测和纠正细胞分裂过程中的这种附着。不正确的着丝粒-微管相互作用不稳定的过程称为纠错。为了研究活细胞中的纠错，通过驱动蛋白-5 电机的化学抑制故意产生不正确的附着，这导致单极纺锤体组装，并且在药物清除后观察到从定向不良到双向的转变。许多模型组织培养细胞类型中的大量染色体对观察单个纠错事件构成了挑战。果蝇 S2 细胞是此类研究的更好对象，因为它们拥有低至 4 对染色体。然而，小分子驱动蛋白-5 抑制剂对果蝇驱动蛋白-5 （Klp61F） 无效。在这里，我们描述了如何构建一种果蝇细胞系，该细胞系用人驱动蛋白-5 有效地替代 Klp61F，这使得细胞对运动的药理学抑制敏感，适合用于基于细胞的误差校正测定。

Introduction

在细胞分裂的基因组中的平等隔离需要复制的DNA和纺锤体微管之间的正确交互。与染色体通过蛋白质的合奏组装在当时被称为动粒¹丝点微管的物理交互。染色体正确分配要求姐姐动粒是双取向，其中每个姊妹与微管从相对纺锤体极始发相关联。动粒的微管（克拉-MT）附件的未在双取向构象被快速，有效地去稳定提供的机会，以建立biorientation在称为误差校正的处理。以前在哺乳动物细胞中建立了纠错法⁵要求使用可逆的小分子抑制剂对Eg5的（驱动蛋白5）装配单极纺锤体。药物治疗产生了许多错误syntelic附件，其中机器人^ h姐妹动粒附着于同一主轴极点。药物的后续冲洗允许误差校正处理的可视化。纠错测定可以做的小分子抑制剂或击倒的存在下，研究以校正错误克拉-MT附件候选蛋白的贡献。

可视化在活细胞中的纠错的能力是一个强大的工具，以进一步了解参与这一复杂过程的分子机制。然而，大量存在于大多数细胞系的染色体形成了挑战中观察个体克拉-MT附件。因为它们含有少至4个染色体^6，但小分子抑制剂的果蝇S2细胞将是理想的用于施加纠错测定驱动蛋白5如S-三苯甲基-L-半胱氨酸（STLC）和monastrol ^7-9不影响在果蝇细胞主轴组件或驱动蛋白5的运动功能。因此，我们属泰德下诱导型启动子也就是驱动蛋白5抑制剂敏感表达人驱动蛋白-5的果蝇S2细胞系。这个协议描述如何拦截内源性果蝇驱动蛋白5同系物，Klp61F，并使用该细胞系中的细胞系的纠错检测。

Protocol

1. 转染 S2 细胞

1. 从先前培养的 25 cm² 培养瓶中，加入表达 GFP α-微管蛋白的 S2 细胞¹⁰，最终体积为 2 ml，汇合度为 100%，并让它们半粘附在 35 mm 组织培养皿的底部约 1 小时。
2. 从培养皿中取出介质。按照制造商的方案，用 1 ml 补充有 10% FBS（以下简称 Schneider 培养基）和转染试剂的 Schneider 培养基转染 2 μg Eg5-mCherry 构建体¹¹。用封口膜密封培养皿，并在 25 °C 下孵育细胞 16-18 小时。
3. 加入 1 ml Schneider 培养基。将细胞放回 25 °C 培养箱中。
4. 转染后第 3 天，将 500 μl 转染的细胞转移到含有 1.5 ml Schneider 培养基的新 35 mm 组织培养皿中，用于测试诱导。通过添加 CuSO₄ 至终浓度为 500 μM 来诱导 Eg5-mCherry 的表达。将培养皿密封在封口膜中并在 25 °C O / N 下孵育。
5. 要制作伴刀豆球蛋白 A 涂层的盖玻片，移液取足量的伴刀豆球蛋白 A 溶液（0.5 mg/ml 溶于 H₂O）以涂覆酸洗的盖玻片，去除多余的部分，并让盖玻片风干。
6. 将 22 mm x 22 mm 伴刀豆球蛋白 A 包被的盖玻片放入干净的 35 mm 组织培养皿中，然后将 500 μl 诱导细胞 100% 汇合接种到盖玻片上，并让细胞在 RT 下粘附 1 小时。
7. 为了检查 Eg5-mCherry 的表达，将盖玻片组装到装有介质的玫瑰室（或适当的成像容器）中，以便在荧光显微镜上进行 RT 成像。使用适当的光源和滤镜集来可视化单元格。例如，本研究中使用的显微镜具有 LED 白光源以及 EGFP （FITC/Cy2） 和 DSRed （TRITC/Cy3） 滤光片立方体。Eg5-mCherry 定位于微管并在纺锤体极附近富集。
8. 在确保细胞同时表达 Eg5-mCherry 和 GFP-α-tubulin 后，将剩余的转染、未诱导的细胞转移到含有 4 ml Schneider 培养基的 25 cm² 组织培养瓶中。
9. 将终浓度为 25 μg/ml 的杀稻瘟菌素 S HCL 添加到转染细胞的培养瓶中，并在 25 μg/ml 杀稻稻瘟菌素 S HCl 存在下继续分裂，直到细胞死亡停止，确保定期检查 Eg5-mCherry 的表达。在 25 °C 培养箱中孵育细胞系
   注：表达 Eg5-mCherry 的细胞百分比随着时间的推移而增加。
10. 一旦细胞稳定转染，在没有药物的情况下继续分裂并冷冻¹² 个细胞以备将来使用。

2. RNA 干扰

1. PCR 使用添加的 T7 启动子序列（序列在材料列表中提供）的引物从 cDNA （LD15641） 中扩增 ~500 bp 的 Klp61F 区域，用作 dsRNA 合成的模板。
   1. 设置四个 PCR 反应，每个反应 50 μl，包含 100 ng 模板 DNA、每种引物 25 μM、适当的缓冲液和聚合酶。根据聚合酶制造商的方案在热循环仪上设置 PCR 方案。
   2. 根据制造商的方案，使用 PCR 纯化试剂盒合并并清洁四个 PCR 反应。将干净的模板储存在 -20 °C。
2. 按照制造商的说明，使用 T7 RNA 转录试剂盒从模板制备双链 RNA （dsRNA）。预计 dsRNA 浓度为 ~5-15 mg/ml。将 dsRNA 储存在 -20 °C。
3. 要使用 dsRNA 敲低 Klp61F，让表达 Eg5-mCherry 的 S2 细胞以 25% 汇合度半粘附在 35 mm 组织培养皿的底部 1 小时。
4. 从培养皿中取出培养基，加入 5 μg 针对 Klp61F（果蝇驱动蛋白-5）的 dsRNA，稀释到 1 ml 无血清 Schneider 培养基中。
5. 在 RT 中孵育 1 小时，然后加入 1 ml 含 10% FBS 的 Schneider 培养基。在 25 °C 下孵育细胞。
6. dsRNA 处理后 24 小时，通过添加 CuSO₄ 至终浓度为 500 μM 来诱导 Eg5-mCherry 的表达。将细胞在 25 °C 下再孵育 24 小时。

3. 活细胞成像

1. 将 22 mm x 22 mm 伴刀豆球蛋白 A 涂层盖玻片放入干净的 35 mm 组织培养皿中。
2. 将 500 μl 经 dsRNA 处理并诱导 O/N 的细胞接种到伴刀豆球蛋白 A 包被的盖玻片上，并让它们粘附约 1 小时。
3. 将盖玻片组装到玫瑰室（或适当的容器）中进行成像。
4. 查找同时表达 Eg5-mCherry 和 GFP-α-tubulin.
   的有丝分裂细胞 注：仅表达 GFP-α-微管蛋白的有丝分裂细胞应具有单极纺锤体，因为纺锤体双极所需的 Klp61F 被敲低^10,13。
5. 在表达 Eg5-mCherry 和 GFP-α-tubulin 的细胞中收集双极纺锤体（例如，每分钟 1 帧）的延时图像。
6. 成像时，从玫瑰室中取出培养基，并用含有 1 μM STLC 的 Schneider 培养基替换它，连续 3 次更换培养基（总共 ~5 ml）进入腔室，以观察纺锤体塌陷。
7. 为了洗掉药物并逆转纺锤体塌陷，小心地从玫瑰室中取出含有 STLC 的培养基，并在 Schneider 培养基中洗涤 4 次（总共 6-8 ml），然后最后一次用新鲜培养基重新填充玫瑰室。继续成像。

4. 误差校正分析

1. 将 22 mm x 22 mm 伴刀豆球蛋白 A 包被的盖玻片放入干净的 35 mm 组织培养皿中。
2. 将 500 μl 用 Klp61F dsRNA 处理的细胞接种到伴刀豆球蛋白 A 包被的盖玻片上，并让它们粘附。
3. 细胞粘附后，向每个培养皿中加入 1.5 ml Schneider 培养基，使最终体积达到 2 ml。
4. 为了在有丝分裂中阻止细胞，将 MG132 添加到每个培养皿中，最终浓度为 10 μM，并孵育 1 小时。
5. 加入 1 μM STLC 并孵育 1 小时，以形成单极子。
6. 每次用 2 ml 新鲜 Schneider 培养基冲洗盖玻片 3 次，洗掉 STLC。
除
7. 任何药物（例如，Aurora 激酶抑制剂）或 DMSO 外，还用 Schneider 培养基孵育盖玻片作为对照><。 注意：抑制剂浓度各不相同，适当的最终浓度必须由实验者确定。通常制备储备溶液，以便将抑制剂以 1：1,000 稀释到培养基中。在这种情况下，1：1,000 稀释的 DMSO（或适当的溶剂）用作载体对照。我们使用终浓度为 40 μM 的 Aurora B 抑制剂 Binnuleine 2。
8. 将细胞固定在不同的时间点，以观察双极纺锤体形成的进展并评估着丝粒附着状态。解决方法：
   1. 用 2 ml 1x BRB-80 快速冲洗盖玻片。
   2. 通过加入 2 ml 在 1x BRB-80 中稀释的 10% 多聚甲醛 10 分钟来固定细胞。在化学罩中小心吸取多聚甲醛。
   3. 用 2 ml 1x PBS + 1% Triton-X 透化细胞 8 分钟。
   4. 用 2 ml 1x PBS + 0.1% Triton-X 洗涤载玻片 3 次。
   5. 将盖玻片细胞面朝上转移到 150 mm 培养皿中的一张石蜡膜上（使用记号笔适当标记石蜡膜以跟踪载玻片）。
   6. 用 150 μl 煮驴血清 （BDS） 盖住盖玻片，并在 RT 下孵育 1 小时以阻断非特异性抗体结合><。 注意：在这里，可以停止固定方案以在以后继续。盖玻片可在 4 °C 的水分室中储存长达 24 小时。要制作水分室，请用湿实验室抹布在 150 毫米培养皿的边缘铺上衬里，并盖上培养皿盖。
   7. 取出模块，将盖玻片与 150 μl 一抗在 BDS 中适当稀释，在 RT 下孵育 1 小时，以对着丝粒和微管进行染色，最终浓度分别为 2 μg/ml（或根据制造商的建议）和 1 μg/ml><。 注意：在这里，可以停止固定方案以在以后继续。盖玻片可在 4 °C 的水分室中储存长达 24 小时。
   8. 用 500 μl 1x PBS + 0.1% Triton-X 洗涤盖玻片 3 次。
   9. 在 RT 下将盖玻片与在 BDS 中稀释的适当荧光团偶联的二抗一起孵育 30-60 分钟。
   10. 用 500 μl 1x PBS + 0.1% Triton-X 洗涤盖玻片 3 次。
   11. 将盖玻片与 150 μl 含有 1 μg/ml DAPI 终浓度的 BDS 一起孵育 5 分钟。
   12. 用 1x PBS + 0.1% Triton-X 洗涤盖玻片 2 次，并将盖玻片细胞面朝下安装在装有 8 μl 封固剂的 3x1" 载玻片上。用指甲油涂上边角，以将盖玻片固定在载玻片上。
9. 对具有表达 Eg5-mCherry 的双极纺锤体的细胞进行成像。使用 100 倍物镜，在所有通道中以 0.2 μm 的间隔拍摄一个由 30 个平面组成的 Z 系列。仔细分析着丝粒和微管以确定附着状态（双向或同向附着）。

Results

Klp61F 是形成双极纺锤体所必需的。人驱动蛋白 5 （Eg5） 可以挽救果蝇 S2 细胞中 Klp61F 的功能（图 1A 和 D）。添加驱动蛋白 5 抑制剂 （STLC） 后，马达的微管相关水平下降（图 1B 和 E），纺锤体崩溃，导致 RNAi 成功后缺乏内源性 Klp61F 的细胞出现单极子（图 1C 和 F）（补充电影 1）。值得注意的是，在人源化 S2 细胞中添加 STLC 后，双极纺锤体会塌陷，因为驱动蛋白 5 活性不需要维持人体细胞中的纺锤体双极。这种有趣的差异可能是两个模型系统中极间微管重叠和/或稳定性差异的结果¹⁴。驱动蛋白 5 抑制（图 2A 和 E）可以通过洗掉药物来逆转，并且可以随着时间的推移跟踪双极纺锤体的恢复。去除抑制剂后（图 2B 和 F），Eg5-mCherry 随着双极纺锤体组装而与微管重新结合（图 2C 和 G），细胞可以发展到双极后期（图 2D 和 H，补充电影 2）。

图 1.添加 1 μM STLC 会导致果蝇 S2 细胞中出现单极纺锤体。在添加 1 μM STLC 期间表达 Eg5-mCherry （A-C） 和 GFP-α-tubulin （DF） 的果蝇 S2 细胞的延时成像的代表性图像。在 3 分钟时加入 Eg5 抑制剂。比例尺 = 5 μm. 时间戳 = min：sec. 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2.双极纺锤体在移除 STLC 后重组。在 STLC 清除实验期间，表达 Eg5-mCherry （A-D） 和 GFP-α-tubulin （E-H） 的果蝇 2 细胞的延时成像的代表性图像。STLC 在 5 分钟时洗出。双极纺锤体在移除 STLC 后 1 小时内重组。比例尺 = 5 μm。时间戳：min：sec. 请单击此处查看此图的较大版本。

补充电影 1.（右键单击下载）。表达 Eg5-mCherry（左）和 GFP-α-微管蛋白（右）的果蝇 S2 细胞的代表性实例的宽场荧光成像。在 2 分钟时加入 1 μM STLC，加入抑制剂后 10 分钟内纺锤体形成单极子。每 1 分钟采集一次图像，并以每秒 10 帧的速率播放。比例尺 = 5 μm。

补充电影 2.（右键单击下载）。表达 Eg5-mCherry（左）和 GFP-α-微管蛋白（右）的果蝇 S2 细胞的代表性实例的宽场荧光成像。除去含有 1 μM STLC 的培养基，并在 5 分钟时冲洗。双极纺锤体在去除抑制剂后 1 小时内重组。每 1 分钟采集一次图像，并以每秒 10 帧的速率播放。比例尺 = 5 μm。

Discussion

可视化纠错是研究这一重要而复杂的细胞过程中涉及的步骤的宝贵技术。为此，使用可逆抑制剂产生错误的附着物，并在药物洗脱时观察到错误纠正。该测定最初是使用哺乳动物组织培养细胞⁵开发的。然而，许多模型哺乳动物细胞类型中存在大量着丝粒，这给观察个体纠错事件带来了挑战。 果蝇 S2细胞具有低至4对动粒，使其成为观察纠错的更优选细胞系。然而，一个主要缺点是许多抑制剂对 果蝇 S2 细胞无效。因此，生成表达人驱动蛋白-5的人源化 果蝇 S2细胞系的能力为研究纠错提供了宝贵的工具。

尽管 果蝇 S2 细胞可以成为研究纠错的更好细胞系，但获得细胞系和敲低必需基因所涉及的多个步骤给该技术带来了一些挑战。例如，转染效率可能非常低。如果表达 Eg5-mCherry 的细胞少于 20%，则应重复转染，因为选择过程将花费更长的时间。此外，表达两种荧光蛋白的细胞百分比可能会随着时间的推移而降低。这可以通过在杀稻瘟菌素 S HCl 和潮霉素 B 存在下分裂细胞来选择分别表达 Eg5-mCherry 和 GFP-α-微管蛋白的细胞来克服。同样重要的是要注意果 蝇 S2 细胞与许多人类蛋白质具有直系同源物，并且;因此，优化内源性蛋白质的敲低条件至关重要。最佳敲低条件可能因 dsRNA 的数量和治疗时间长短而异。考虑到CRISPR-Cas9技术的出现和快速改进^15-17，用人Eg5取代Klp61F基因的果 蝇 细胞系的生成提供了一种强大的替代方案，可以克服转染和敲低方法的局限性。我们的工作表明，在这种情况下，苍蝇基因替换应该是一个可行的选择，尽管目前正在开发在 果蝇 S2 细胞中这样做的必要试剂。

该过程不仅限于 Eg5，还可用于研究其他感兴趣蛋白质的功能。如果使用先前已确定对 果蝇 S2细胞无效的抑制剂，则可以修改该方案以研究抑制剂在活细胞中的直接作用，而不必担心脱靶效应。使用该协议生产的细胞系也可用于高通量筛选分析，以识别靶向参与纠错的蛋白质的潜在药物。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Effectine 转染试剂	Qiagen	301425
Klp61F cDNA 果	蝇基因组资源中心	13690	基因名称 LD15641
Schneider's Media	Invitrogen	21720-024
胎牛血清，经认证	Invitrogen	10082-147	热灭活，美国原
产地 硫酸铜 （II） （CuSO4）	Sigma	C8027-500G	500 mM 储备液
S-三苯甲基-L-半胱氨酸	Sigma	164739-5G	1 DMSO
杀稻瘟菌素盐酸盐	Invitrogen	R21001 5	mg/ml 1x PBS
潮霉素 B	Invitrogen	10687010
T7 大规模 RNA 生产系统	Promega	P1320	每个反应的 dsRNA 浓度约为 5-15 &微;g/&微;l
Klp61F RNAi F 引物	Invitrogen		TAATACGACTCACTATAGGGTA-TTTGCATTATTTTAAAA
Klp61F RNAi R 引物	Invitrogen		TAATACGACTCACTATAGGGAT-ATTGATCAATTGAAAC
PCR 清理试剂盒	Mo Bio Laboratories， Inc	1250
伴刀豆球蛋白 A	Sigma	C5275	0.5 通过溶解在 1x PBS 中制成的 mg/ml 溶液。
煮沸的驴血清	Jackson ImmunoResearch Labs	017-000-121	5% 储备溶液，溶于 1x PHEM 缓冲液中，使溶液煮沸。存放在 4 °C.
封固介质			20 mM Tris pH 值 8.0， 0.5% N-丙酯没食子酸酯，90% 甘油。存放在 4 °C.
1x BRB-80			80 mM 管道 pH 6.9;1 mM EGTA;1 mM MgCl2
白光源	Lumencor Inc
ET EGFP 滤光片立方体	Chroma	49002
DSRed 滤光片立方体	Chroma	49005
抗 NDC80 抗体			由 Maresca 实验室定制
DM1α（抗 α;-微管蛋白）	Sigma	T6199
抗 CID 抗体	AbCam	ab10887