使用 Tomoauto：高通量自动化冷冻电子断层成像实验方案

摘要

我们介绍了一种利用高通量冷冻电子断层扫描技术测定高分辨率结构的实验方案 原位 分子机器的结构。该方案支持大量数据的处理，避免了常见瓶颈，减少了资源停机时间，使用户能够专注于重要的生物学问题。

摘要

冷冻电子断层扫描（Cryo-ET）是一种强大的三维（3-D）成像技术，可在分子水平上以天然状态可视化大分子复合物。该技术首先通过将样品快速冷冻在玻璃态冰中以保持其天然状态，随后在高倍率下从不同角度采集一系列显微图像，最后通过计算重建出三维密度图。由于冷冻水合样品对电子束极为敏感，因此需在极低电子剂量下采集显微图像，以减少辐射损伤。因此，原始的冷冻电子断层图信噪比极低，图像本身具有固有的噪声特征。为了更清晰地观察目标结构，通常采用传统的图像分析方法及子断层平均技术（sub-tomogram averaging），即从初始断层图中提取目标结构的子断层图，进行对齐并平均，以提高对比度和分辨率。大量倾斜系列数据集对于理解并解析不同状态、条件或突变下的复合物结构至关重要，同时也是获得足够数量子断层图用于平均和分类的基础。然而，这些数据的采集与处理可能成为进一步分析的主要障碍。本文介绍了一种高通量冷冻电子断层扫描实验方案，该方案基于计算机控制的300 kV冷冻透射电子显微镜、直接电子探测器（DDD）相机，以及本实验室开发的高效半自动化图像处理流程软件封装库 tomoauto。该方案已成功应用于可视化志贺氏痢疾杆菌（Shigella flexneri）微型细胞中完整的III型分泌系统（T3SS），并可推广至任何适用于冷冻电子断层扫描的研究项目。

引言

III型分泌系统（T3SS）是多种革兰氏阴性病原菌的关键毒力决定因子。注射器装置，亦称作针状复合物，是T3SS的核心机器，负责将效应蛋白直接从细菌转运至真核宿主细胞内。^{1, 2}注射装置包括一个胞外针状结构、一个基底体以及一个胞质复合物，后者也称为分选复合物。³先前的研究已阐明了从纯化的注射装置中获得的三维结构 沙门氏菌 和 志贺氏菌，以及主要基体蛋白的原子结构^{4, 5}近期 原位 来自注射装置的结构 沙门氏菌, 志贺氏菌，以及 耶尔森菌 通过冷冻电子断层扫描技术揭示^{6, 7}然而，那些结构中尚未观察到对效应蛋白筛选和针状结构组装至关重要的胞质复合物。

冷冻电子断层扫描技术（Cryo-ET）是在天然细胞环境中以纳米级分辨率对分子机器进行成像的最合适技术原位）。然而，冷冻电子断层扫描技术（cryo-ET）的可达到分辨率受限于样品厚度。为克服这一局限，我们对一种具有毒力的完整注射装置（injectisome）进行了成像 福氏志贺菌 一种经过基因改造以产生足够薄的微细胞用于冷冻电子断层扫描的菌株。冷冻电子断层扫描的另一局限性在于样品对电子束所诱导辐射的高度敏感性，这种辐射会迅速破坏样品中的高分辨率信息。因此，单个倾斜图像需使用极低剂量，以便将合适的总剂量分配至....

方案

1. 微细胞制备

1. 为了制备 S. flexneri 微细胞，转化1 µl质粒pBS58，该质粒组成型表达 大肠杆菌 细胞分裂基因 ftsQ，ftsA 和 ftsZ 通过电穿孔法将低拷贝的链霉素抗性质粒转入5 µl电感受态的链霉素抗性5a血清型（M90T-Sm）细胞中，使用1 mm比色皿，2.5 kV电压，持续5毫秒。
2. 将微细胞样品加入15%甘油，于1.5 ml 冻存管中，-80 °C保存。使用时，用移液器吸头从未经解冻的冻存管中刮取约5 μl细胞，悬浮于4 ml含100 μg/ml链霉素的胰蛋白胨大豆肉汤中。37 °C过夜培养。
3. 将1.2中的2 ml培养物移入含100 μg/ml链霉素的200 ml胰蛋白胨大豆肉汤中，37 °C培养至对数生长后期。
4. 为富集微细胞，将1.3步骤中200 ml培养液在1,000 × g离心5分钟。小心将上清液倒入新的离心管中，在20,000 × g离心10分钟。小心倾去并弃除上清液，用移液器吸头轻轻混匀沉淀物与残留液体，转移约100 μl沉淀混合物至1.5 ml微量离心管中。

2. 电镜载网制备

1. 将R2/2型有孔碳膜200目铜网碳膜面朝上置于玻璃载片上。
   注意：选择 R2/2 200 目网格以最大化可在单个网格方格内设置采集的倾转系列数量，同....

结果

微细胞样品 S. flexneri 按照示意图所示进行收集和处理 图1 使用 tomoauto，按照详细说明的流程进行 图2. 使用 SerialEM 采集倾转系列图像¹⁰，可在用户于低倍率拼接图上指定的位置实现高通量倾转系列的采集（图3）。采用直接检测装置相机以剂量分段模式采集显微照片，以减少电子束诱导的运动²² (图4）。Tomoauto 协调运动校正，对一系列剂量分馏的显微图像进行处理，并使用 MOTIONCORR 对每幅图像进行校正²² 并将结果组装成一个倾斜系列以进行后续处理（视频 1).

tomoauto 最普遍的应用是自动对齐初始倾转系列图像。tomoau.......

讨论

此处描述的高通量方法使我们能够处理 1,917 套冷冻倾斜系列数据，并生成超过 4,500 个完整结构的子断层图 S. flexneri 注射装置¹⁹. 所收集的数据实现了对 原位 注射装置，包括细胞质分选复合物。该方法还被用于观察若干特定蛋白组分缺失的突变细胞，有助于阐明注射装置分选平台的组成。我们的方法为研究注射装置的结构与功能关系提供了新的途径。由此，为深入解析III型分泌系统介导的分泌机制及致病机理奠定了新的基础。

本文所述方案介绍了对完整的S. flexneri进行高通量冷冻电子断层扫描（cryo-ET）的方法，但该方法同样适用于任何适合开展cryo-ET研究的项目。该方法已被用于Borrelia burgdorferi鞭毛马达的结构表征²⁷、噬菌体T7感染E. coli微型细胞²⁸，以及E. coli中趋化受体阵列的研究²⁹。通过促进大规模数据集的获取，研究人.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
甘油	Sigma-Aldrich	G9012
胰蛋白胨大豆肉汤	Sigma-Aldrich	22092
壮观霉素	Sigma-Aldrich	S0692
电穿孔仪	Bio-rad	165-2100
1 mm 电穿孔杯	BTX	45-0124
1.5 ml 冻存管	Thermoscientific	5000-1020
1.5 ml 微量离心管	Sigma-Aldrich	Z336769
带孔碳支持膜载网	Quantifoil (Electron Microscopy Sciences)	Q2100CR2	R2/2 200 Cu
辉光放电装置	自制		有商用替代品
真空干燥器	Sigma-Aldrich	Z119016	用于自制辉光放电装置
高频发生器	Electro-Technic Products	BD-10A	用于自制辉光放电装置。  警告：该设备产生高电压。
离心机
镊子	Dumont (Electron Microscopy Sciences)	72705-D	5号型抗磁镊
胶体金	Aurion		BSA 10nm
滤纸	Whatman		#2
乙烷	Matheson Tri-Gas	UN1035
氮气	Matheson Tri-Gas	UN1977
冷冻固定压片装置	自制		有商用替代品
冷冻载网储存盒	Electron Microscopy Sciences	71166-30
透射电子显微镜	FEI		Tecnai Polara F30 (300 KeV)
直接电子探测器相机	Gatan		K2 Summit
断层图像采集软件	SerialEM		http://bio3d.colorado.eud/SerialEM 替代方案：UCSF Tomography, Leginon, FEI Batch Tomography
电子束诱导运动校正软件	MOTIONCORR		http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html 需配备 >2GB Nvidia GPU
倾斜系列图像对齐软件	IMOD		http://bio3d.colorado.edu/IMOD 替代方案：XMIPP, Protomo
自动标记物建模软件	IMOD		替代方案：RAPTOR (包含于 IMOD0 (可在 tomoauto 中使用)
CTF 测定软件	IMOD		替代方案：CTFFIND http://grigoriefflab.janelia.org/ctf (可在 tomoauto 中使用)
倾斜系列图像重构软件	tomo3d		https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d 替代方案：IMOD, XMIPP http://xmipp.cnb.csic.es , Protomo
倾斜系列图像自动化处理软件	tomoauto		https://github.com/DustinMorado/tomoauto
颗粒挑选软件	i3		http://www.electrontomography.org 替代方案：IMOD
子断层平均软件	i3		替代方案：PEET http://bio3d.colorado.edu/PEET, Dynamo https://dynamo.bioz.unibas.ch , PyTom http://pytom.org