使用Tomoauto:一个协议，用于高通量自动化低温电子断层扫描

Summary

我们提出如何利用高通量低温电子断层扫描，以确定高分辨率的分子机器的结构原位的协议。该协议允许大量数据要处理，避免了常见的瓶颈，并减少停机时间资源，从而允许用户集中在重要的生物的问题。

Abstract

冷冻电子断层扫描 （Cryo-ET） 是一种强大的三维 （3-D） 成像技术，用于在分子水平上可视化大分子复合物在其天然环境中。该技术最初通过将样品快速冷冻在玻璃体冰中来保持样品的天然状态，然后以高放大倍率从不同角度收集一系列显微照片，最后计算重建 3-D 密度图。冷冻水合标本对电子束极其敏感，因此以非常低的电子剂量收集显微照片，以限制辐射损伤。因此，原始冷冻断层扫描具有非常低的信噪比，其特征是图像本身具有噪点。为了更好地可视化感兴趣的主题，传统的成像分析和亚断层图平均，其中对象的子断层图从初始断层图中提取并对齐和平均，以提高对比度和分辨率。大型倾斜序列数据集对于理解和解析不同状态、条件或突变下的复合物以及获得足够大的子断层图集合以进行平均和分类至关重要。收集和处理这些数据可能是阻碍进一步分析的主要障碍。在这里，我们描述了一种基于计算机控制的 300kV 冷冻电子显微镜、直接检测装置 （DDD） 相机和内部开发的高效半自动图像处理管道软件包装库 tomoauto 的高通量冷冻电子断层扫描方案。该方案已被有效地用于可视化福氏志贺氏菌微型细胞中的完整 III 型分泌系统 （T3SS）。它可以适用于任何适合冷冻电子断层扫描的项目。

Introduction

III型分泌系统（T3SS）是必不可少的毒力决定于许多革兰氏阴性病原体。的injectisome，也被称为针复杂，是所需的效应蛋白直接易位从细菌到真核宿主细胞^1,2中央T3SS机。所述injectisome包括细胞外针，一个基体，和胞质复杂也是已知作为拣杂^3。先前的研究已阐明了从沙门氏菌和 志贺氏菌纯化的injectisomes的3-D结构，随着主要基体蛋白^4,5的原子结构。最近在从沙门氏菌， 志贺氏菌和耶尔森氏菌 injectisomes 原位结构进行了揭示的低温的ET ^{6 7，}然而，胞质复杂，效应子选择和针组件必需的，还没有被可视化这些结构。

低温-ET是MOSŤ合适技术其天然细胞环境（原位）内成像分子机器在纳米级分辨率。尽管如此，通过Cryo-ET可达到的分辨率由样品厚度的限制。为了克服缺点，我们在毒痢疾杆菌菌株进行基因改造，以产生小细胞的冷冻ET足够薄成像完好injectisomes。冷冻的ET的另一个限制是样品诱导的电子束，它非常快速地破坏在样品中的高分辨率信息的辐射的敏感性。其结果是，非常低剂量用于个体倾斜图像，使合适的剂量可以分布在全倾斜系列。这大大降低了在最终的重建的信噪比（SNR），这使得难以区分的大量的断层图....

Protocol

1.小细准备

1. 为了使S.菌微细胞，变换1微升质粒pBS58，其组成型表达的大肠杆菌细胞分裂的基因ftsQ，ftsA，和ftsZ超从低拷贝壮观霉素抗性质粒入5微升电感受链霉素抗性5a血清型（M90T钐）细胞通过电穿孔的在2.5千伏为5毫秒，以1毫米试管。
2. 商店微细胞的样品在-80℃下在15％甘油在1.5ml微管中的低温。当准备使用时，刮大约5微升用枪头从unthawed微管细胞和悬浮细胞在4毫升的胰蛋白酶大豆肉汤与壮观霉素加入到100微克/毫升的浓度。成长O / N在37℃。
3. 吸管2毫升培养从1.2入200ml胰蛋白酶大豆肉汤与壮观霉素再次加入到100微克/毫升的浓度。在37℃下生长至晚对数期。
4. 为了丰富小细胞，离心200毫升从1.3的培养物在1000×g离心5分钟。小心倾上清液部分到一个新的离心管中并离心以20,000×g离心10分钟。仔细倒出并丢弃上清液部分，并轻轻混合颗粒使用一个枪头剩余的液体和到1.5ml微量离心管中传输大约100微升沉淀混合物。

2. EM网格准备

1. 放置一个R 2/2多孔碳膜200目铜网上碳朝上载玻片上。
   注:R 2/2 200目网格被选择以最大化的倾斜系列可被设置以获得在一个单一的网格，同时仍然支持试样和放置碳膜的边缘，在摄像机的视场的数目在所需的倍率。精细的网格....

Results

小细胞S.样品菌 ，收集并处理的结果显示在原理图1采用tomoauto在图2中详述的管道下面。 使用SerialEM ^10，其允许高通量倾斜系列采集在上低倍率蒙太奇地图由用户指定的点（ 图3）倾斜系列收集。使用剂量分馏模式直接检测器件照相机上，以减少束诱发运动^22（图4），收集显微镜照片。 Tomoauto坐标运动校正拍摄的剂量分次显微照片与MOTIONCORR ²²处理每一集合并组装的结果成倾斜系列，以进行进一步的处理（ 电影1）。

tomoauto的最普遍的应用是部门自动化最初倾斜系列了C对齐。 Tomoauto构成顺序执行在IMOD

Discussion

此处所描述的高通量方法，使我们能够处理1917低温倾斜系列和产生超过4500分断层图像的完好S的菌 injectisome ^19。所收集的数据导致原位 injectisome的详细的表征，包括胞质排序复杂。该方法也被用来可视化几个突变的细胞与特异性缺失推定的蛋白质组分，这有助于阐明injectisome的排序平台的组成。我们的方法提供了新的途径，调查injectisome的结构与功能的关系。其结果是，新的阶段设定为底层T3SS介导的分泌和发病机制的进一步清扫。

这里介绍的协议描述完整S的高通量冷冻ET 菌 ，但也适用于适于冷冻的ET任何项目。这种方法已经在structu被用于莱姆病螺旋体 ²⁷的鞭毛马达的拉尔表征，大肠杆菌感染大肠杆菌的小细胞通过噬菌体T7 ^28，和化学感受器阵 ​​列在大肠杆菌大肠杆菌 ^29。通过促 .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
甘油	Sigma-Aldrich	G9012
Tyrptic 大豆肉汤	Sigma-Aldrich	22092
壮观霉素	Sigma-Aldrich	S0692
电穿孔仪	Bio-rad	165-2100
1 mm 比色皿	BTX	45-0124
1.5 ml 低温管	热科学	5000-1020
1.5 ml 微量离心管	Sigma-Aldrich	Z336769
Holey 碳网格	Quantifoil （Electron Microscopy Sciences）	Q2100CR2	R2/2 200 Cu
辉光放电装置	内部		商业替代品 可用的
真空干燥器	Sigma-Aldrich	Z119016	用于内部辉光放电装置
高频发生器	Electro-Technic 产品	BD-10A	用于内部辉光放电装置。注意： 此设备会产生高电压。
离心
镊	Dumont （Electron Microscopy Sciences）	72705-D	Style 5 防磁
胶体金	Aurion		BSA 10nm
滤纸	Whatman		#2
乙烷	Matheson Tri-Gas	UN1035
氮气	Matheson Tri-Gas	UN1977
柱塞装置	内部		商业替代品 可用的
低温网格存储箱	电子显微镜科学	71166-30
透射电子显微镜	FEI		Tecnai Polara F30 （300 KeV）
直接检测设备 相机	Gatan		K2 Summit
断层扫描采集软件	SerialEM		http://bio3d.colorado.eud/SerialEM 替代方案： UCSF 断层扫描、Leginon、FEI 批量断层扫描
束诱导运动校正软件	MOTIONCORR		http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html 需要 >2GB Nvidia GPU
倾斜系列对齐软件	IMOD		http://bio3d.colorado.edu/IMOD 替代品： XMIPP， Protomo
自动基准标记建模软件	IMOD		替代品： RAPTOR（包含在 IMOD0 中（可在 tomoauto 中使用）
CTF 测定软件	IMOD		替代品： CTFFIND http://grigoriefflab.janelia.org/ctf （可在 tomoauto 中使用）
Tilt-Series 重建软件	tomo3d		https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d 替代品： IMOD， XMIPP http://xmipp.cnb.csic.es ， Protomo
Tilt-Series 自动处理软件	tomoauto		https://github.com/DustinMorado/tomoauto
颗粒拾取软件	i3		http://www.electrontomography.org 替代品： IMOD
子卷平均软件	i3		替代方案：PEET http://bio3d.colorado.edu/PEET、Dynamo https://dynamo.bioz.unibas.ch、PyTom http://pytom.org