生物发光成像是一种用于定位肿瘤和转移灶的常用工具，但这些图像的定量分析通常需要复杂的计算和特定的仪器。我们介绍了易于使用的luminoscore方法，该方法基于精确的成像采集条件，无需任何计算，即可在小鼠模型中监测肿瘤负荷及治疗反应。
方法文章
基于生物发光的肿瘤定量方法用于监测小鼠淋巴瘤模型中的肿瘤进展及治疗效果
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
尽管生物发光成像（BLI）在监测癌症动物模型中肿瘤负荷方面展现出良好前景，但这些分析目前仍主要为定性性质。本文介绍一种生物发光成像方法，用于实现对肿瘤负荷及治疗反应的半定量分析。该方法基于“发光评分”（luminoscore）的计算，该数值可用于对同一或不同实验中的两个动物个体进行比较。现有的BLI仪器支持该发光评分的计算，其主要依赖于图像采集条件（前后位采集）以及感兴趣区域的划定（在小鼠周围手动标记）。利用两种已报道的基于细胞移植的小鼠淋巴瘤模型，我们证明该发光评分方法可作为一种无创手段，用于验证肿瘤细胞接种是否成功、监测肿瘤负荷以及评估治疗干预的效果。 原位 癌症治疗（CpG-DNA）。最后，我们证明该方法适用于不同的实验设计。我们建议在临床前小动物研究中采用该方法对治疗反应进行早期评估。
引言
早期肿瘤细胞的检测仍然是一个挑战，对于提高癌症治疗效果至关重要。In vivo 生物发光成像（BLI）是一种非常灵敏、无创的光学技术，广泛用于小动物体内肿瘤的监测。表达萤火虫荧光素酶的细胞常被用于此类实验1,2。该氧化酶利用分子氧氧化D-荧光素，但需要两种辅因子——Mg2+ 和三磷酸腺苷3。与海肾荧光素酶相比，萤火虫荧光素酶更适用于in vivo 成像4，因其量子产率更高。
氧化后的底物——氧荧光素——会自发发射一个光子，回到其基态，随后失去活性。所发射的光子最大波长约为530 nm。高灵敏度相机能够检测来自小动物体内的生物发光光子，并提供可用于定位肿瘤细胞的图像。
通过光子计数准确量化肿瘤负荷的能力，可作为一种强大且灵敏的工具，用于评估治疗效果。由于能够更早地检测到治疗效应，这种灵敏性可能有助于确定治疗起效的确切时刻。
对发射的光子总数进行绝对定量非常复杂。所收集到的光子数量取决于肿瘤的深度以及光子穿过的器官。虽然可以根据组织吸收系数计算校正系数5，但对肿瘤细胞数量的绝对定量仍需知晓每个肿瘤细胞所发射的光子数。此外，荧光素酶的表达水平与其他许多报告基因（例如，荧光蛋白）类似，在来源于单个克隆的细胞群体中也不均一6。细胞内荧光素酶蛋白的数量无法精确计算。因此，建立标准化的实验条件对于可靠的半定量分析显得至关重要。
我们将luminoscore方法应用于两种不同的小鼠淋巴瘤模型7,8,9在这些模型中，将同源肿瘤细胞分别注射到眼内或皮下，以建立原发性眼内淋巴瘤（PIOL）模型和皮下淋巴瘤（SCL）模型。在每种原位模型中，治疗均按相应方案给予。 原位 肿瘤接种后七天进行PIOL检测，SCL则在肿瘤最大直径达到0.5至0.7 cm时进行。
我们采用luminoscore方法来监测以下因素的影响 在 原位 CpG 治疗，先前已证明有效7,10,11CpG 是一种寡核苷酸序列，也是 TLR9 的配体，而 TLR9 是免疫系统多种细胞表达的一种细胞内受体，包括树突状细胞、B 淋巴细胞、单核细胞和自然杀伤细胞。CpG-DNA 是一种含有 CpG（CG）免疫刺激基序的 20 聚体 DNA 序列；对照序列（ODN-control）为相同的 20 聚体 DNA 序列，但其中免疫刺激性 CG 序列被颠倒为 GC。在我们研究的小鼠淋巴瘤中，TLR9 的激活可诱导细胞凋亡10，激活免疫系统12，从而显著减轻肿瘤负荷7,11.
本文介绍了一种通过生物发光成像来定量肿瘤负荷及治疗反应的标准化方法。该方法涵盖从图像采集到分析的各个成像步骤，旨在提高结果的可靠性、可重复性、非操作者依赖性以及统计学显著性。每只小鼠均被赋予一个生物发光定量指数，该数值被称为“发光评分”（luminoscore），不仅可用于个体间比较，也可用于不同实验间的比较。
在本研究中，我们重点关注生物发光成像步骤以及通过发光评分法进行图像定量分析。我们展示了该方法在验证注射效果、监测肿瘤负荷以及评估治疗 efficacy 的有效性 原位 癌症治疗。这些要点通过使用不同小鼠模型的实验代表性结果加以说明，以突出luminoscore方法的适应性。
方案
所有涉及小鼠的操作均符合欧盟实验动物使用指南、法国实验动物管理条例（农业部2001年5月第2001-464号法令）以及法国国家健康与医学研究院（INSERM）动物实验委员会的指导原则，并已获得相关地方伦理委员会批准（法国巴黎查尔斯·达尔文实验动物伦理委员会；许可编号：p3/2009/004）。
1. 细胞准备
- 在添加了10%胎牛血清、100 µg/ml 青霉素、100 µg/ml 链霉素、10 mM 丙酮酸钠、50 µM 2-巯基乙醇和0.50 mg/ml 潮霉素B的RPMI-1640 Glutamax培养基中培养小鼠B淋巴瘤细胞系A20.IIA-luc2。
- 在 37 °C、5% CO₂ 条件下培养细胞2 每隔两到三天更换一次培养基。换液后一天，用移液器收集5 ml细胞悬液。
- 300 × g 离心 10 分钟，将细胞重悬于 3 ml 无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中。重复此步骤两次以洗涤细胞。
- 将15 µl细胞悬液与30 µl台盼蓝染液混合后，加载至马氏计数板。按以下公式计算细胞浓度：细胞浓度（个/ml）= 计数网格中的细胞数 × 3 × 1000。
- 再次以 300 × g 离心 10 分钟。用移液器吸去上清液。设步骤 1.4 中计算的浓度为 C，则细胞数量为 N = C × 3。
- 计算获得浓度为 5 x 10⁶ 个细胞/mL 的细胞悬液 A 所需的无菌 PBS 1x 的体积7 细胞/ml，计算公式如下：PBS 体积（ml）= N / (5 × 107). 将细胞沉淀（来自步骤1.5）重悬于上一句中计算出体积的无菌1×PBS中。细胞悬液A用于SCL模型（体内 注入体积为 100 µl：5 x 106 细胞）
- 用移液器取10 µl细胞悬液A，加入含有90 µl无菌PBS的1.5 ml离心管中，得到100 µl浓度为5 × 10⁵个细胞/ml的细胞悬液B6 每毫升细胞数。细胞悬液B将用于PIOL模型（体内 进样体积为 2 µl：1 x 104 细胞）
2. 荧光素
- 在50 ml离心管中，将1 g D-荧光素钾盐粉末溶于30 ml无菌1×磷酸盐缓冲液（PBS）中，轻轻振荡数秒以溶解团块。
注意：由于荧光素对光敏感，需在避光的1.5 ml离心管中分装成500 µl每管。 - 将分装后的溶液于-20 °C保存。
注意：分装液可在-20 °C保存数月。
解冻后，溶液在+4 °C下存放不得超过1天。反复冻融优于在4 °C长期保存。 - 每次成像实验时，每只小鼠腹腔注射100 µl D-荧光素钾盐溶液。
注意：该剂量相当于每只小鼠3.3 mg，即150 mg/kg。
3. 麻醉剂混合物与麻醉
- 通过将每公斤体重120 mg的氯胺酮和每公斤体重6 mg的赛拉嗪溶于1×无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制麻醉溶液。
- 每次成像实验使用25 G针头，向腹腔注射60 µl麻醉混合液。对于手术（PIOL或SCL模型），注射80 µl混合液以获得更深的麻醉效果。注射后将小鼠放回笼中。
- 当小鼠表现为不动时，将其从笼中取出，并用手指轻轻挤压其腿部。若小鼠出现逃避反射，则等待数分钟。重复此操作，直至小鼠无反应，表明已达到满意的麻醉状态。
- 将小鼠置于加热板上或保温灯下。
- 为防止在成像实验或SCL手术期间因麻醉导致眼睛干涩，需涂抹眼膏。对于PIOL模型，则在手术后涂抹眼膏。
4. 手术与细胞接种
注意：所有手术操作均需在动物生物安全二级设施的Ⅰ级微生物安全柜内，于加热板或加热灯下进行。本部分使用的所有手术器械在使用前均已高压灭菌。
- 皮下淋巴瘤模型：
- 用1 ml注射器配25 G针头，吸取步骤1.6中获得的细胞悬液100 µl。用手指轻轻捏住小鼠侧腹部注射部位的皮肤形成皮褶，将针头准确插入皮褶内。为确保注射至皮下，切勿将针头插入组织深层。
- 将细胞注入皮褶内。观察皮下是否出现微小的液体隆起，以确认注射操作正确。
- 用1 ml注射器配25 G针头，吸取步骤1.6中获得的细胞悬液100 µl。用手指轻轻捏住小鼠侧腹部注射部位的皮肤形成皮褶，将针头准确插入皮褶内。为确保注射至皮下，切勿将针头插入组织深层。
- PIOL模型：
注意：本操作需要两名操作者，分别称为操作者1和操作者2。- 结膜切除：
- 让操作者1将小鼠置于解剖显微镜下，用手指轻轻按压眼球两侧以暴露眼球，并保持该位置。
- 让操作者2通过解剖显微镜观察，用一只手使用小型镊子夹住结膜，另一只手用小型手术剪在镊子下方剪断结膜。
- 让操作者1松开在步骤4.2.1.1中按压小鼠眼球的手。
- 细胞注射：
- 准备一支10 µl钝头精密注射器，通过推动无菌去离子水冲洗注射器，重复两到三次，确保注射器内无气泡。然后准备2 µl细胞悬液用于注射。
- 让操作者2用一只手的手指轻轻按压眼球两侧以暴露眼球，并保持该位置。
- 让操作者1用一只手使用小型镊子夹住眼球边缘，并轻轻向后牵拉以拉伸组织。
- 让操作者2通过解剖显微镜观察，用另一只手以32 G针头在小鼠眼球下部刺出一个小孔。
- 让操作者2放下针头，用同一只手拿起精密注射器，并将针头插入步骤4.2.2.4中所制的小孔内。
- 让操作者1用另一只手推动注射器活塞。
- 让操作者2通过解剖显微镜确认细胞悬液已正确注入眼球内部（液体流动清晰可见）。
- 让操作者2取出精密注射器。
- 让操作者1松开在步骤4.2.2.3中夹持的小鼠眼球边缘。
- 让操作者2松开在步骤4.2.2.2中按压的眼球两侧。
- 立即涂抹眼药膏。
注意：若所有步骤均正确执行，小鼠在该操作过程中应完全无出血。
- 结膜切除：
5. 生物发光成像——第0天
注意：所有注入小鼠体内的产品在注射前必须达到室温。在肿瘤细胞接种后，动物仍处于麻醉状态时，继续进行以下成像步骤。
- 打开成像仪并启动采集软件。通过点击初始化相机、载物台和镜头 "初始化" 按钮。初始化过程需要 10 到 15 分钟才能完成。
- 注射100 µl D-荧光素钾盐溶液 腹腔内 使用25 G针头。切勿静脉注射。若因任何原因需静脉给药，D-luciferin 钠盐 必须使用D-荧光素，而非D-luciferin 钾盐.
注意：在此浓度下，荧光素为过量反应物，因此生物发光信号在3至7分钟内达到平台期，并持续超过30分钟。 - 10 分钟 注射D-荧光素钠后13，将实验小鼠放入成像仪中，使其保持自然体位 返回 朝向摄像机，尽可能保持平直。该位置自然且易于重复。
- 勾选自动曝光功能，然后单击“采集”以获取图像 返回 （后视）动物图像，采用自动曝光功能。
注意：自动曝光功能通过计算1秒曝光图像来优化曝光时间。如果小鼠的生物发光信号为阴性或非常微弱，最佳曝光时间可能会被自动设置为超过20分钟。在此情况下，将曝光时间设为8至10分钟可能是一个合理的折中方案。曝光时间可以手动设置，但图像 不得包含饱和像素. - 将小鼠翻转以暴露 前部 将小鼠的身体调整至正对摄像头。尽量压平小鼠，并将其前肢展开，以免遮挡胸部。
- 获取一个 前部 动物图像。确认自动曝光复选框仍处于选中状态，然后再次点击 "获取" 按钮
注意：正面图像和背面图像的采集顺序可以互换，先采集正面或背面均可。由于小鼠两侧发光强度可能存在差异，正面与背面图像的曝光时间可以不同；若使用自动曝光功能，曝光时间将自动计算。定量分析仅使用光子通量（光子数） 每秒）且不依赖于曝光时间。 - 将小鼠置于加热板上或加热灯下，直至其从麻醉状态恢复，然后将其放回笼中。
6. 生物发光成像——第0天之后
- 打开成像仪，按照步骤 5.1）初始化相机、载物台和镜头。
- 通过腹腔注射 60 µl 的氯胺酮（120 mg/kg）/赛拉嗪（6 mg/kg）混合液对小鼠进行麻醉（参见步骤 3.1 至 3.5）。
注意：该麻醉方法允许每 5 天进行一次成像。若需每日成像，则需使用异氟烷作为麻醉剂，并配备适用于该麻醉剂的生物发光成像仪。 - 使用自动曝光功能，按照步骤 5.5）和 5.6）获取动物的前面和后面图像。操作小鼠的方式同步骤 5.7）。
7. 生物发光定量与图像分析
注意：发光评分法基于图像分析。一旦根据上述步骤获取图像后，即可随时（包括在图像采集后立即）进行定量分析，以在每个时间点为每只小鼠分配一个发光评分。
- 若尚未显示，单击 "View" 菜单，然后单击 "Tool Palette" 以显示 "Tool Palette"。单击工具面板中的 "ROI Tool" 选项卡，选择 "Contour" 按钮，然后选择 "Free draw"。
- 在前视图中，沿小鼠边缘手动标记感兴趣区域（ROI）。通过单击计算机鼠标的右键闭合轮廓。
- 单击 "View" 菜单，然后单击 "ROI Measurements"。确保在 "ROI Measurements" 窗口左下角的 "Measurement Types" 滚动菜单中已选择 "Radiance (Photons)"；若未选择，请选中该项。然后记录 "Total Flux [p/s]" 框中的数值，以测量光子通量（ph/s）。
注意：请勿使用与 ROI 表面积相关的 Radiance 或其他任何相对单位。 - 对背视图重复步骤 7.2）和 7.3）。
- 将前视图和背视图获得的两个光子通量值相加，结果即为luminoscore。
- 使用适当的统计学方法（例如非参数双尾 Mann-Whitney 检验）比较各组之间的数值14。
结果
发光评分法可用于验证肿瘤细胞注射
在涉及注射少量肿瘤细胞或注射部位无法通过视觉验证注射效果的模型中，确保注射质量可能非常困难。luminoscore 方法可作为一种快速且便捷的工具，用于验证操作质量，并能够轻松、即时地确认一切操作是否正确。在这两种模型中，注射后 10 分钟即可检测到肿瘤 (图 1A)。仅凭图像即可确认肿瘤细胞是否位于正确位置。然而，对图像进行定量分析可进一步评估注射的异质性。点状图 (图 1B) 清晰地显示了接受注射（黑点）与未接受注射（红线）动物之间的差异。值得注意的是，SCL 模型中的信号强度比 PIOL 模型高出 100 倍；这一结果与注射的细胞数量一致（分别为 5 × 106 和 1 × 104 个细胞）。
图1. 不同小鼠淋巴瘤模型注射效果的验证。 在不同淋巴瘤模型中，肿瘤细胞接种后10分钟测得的发光值。 (A) 两种模型的代表性图像。(B) 不同模型中每只动物的发光值。红线表示在肿瘤细胞接种前对10只动物测得的平均背景噪声水平；虚线表示均值±标准差。在每种模型中，所有动物的信号均可与背景噪声区分开。在PIOL模型中，将1 × 104个细胞接种至右眼玻璃体；在SCL模型中，将5 × 106个细胞接种至小鼠双侧胁腹部皮下。 请点击此处查看该图的放大版本。
监测肿瘤负荷与治疗反应
luminoscore 也是研究肿瘤生长和治疗效果的有力工具。 图2A 显示了对照组和CpG处理组原发性眼内淋巴瘤（PIOL）小鼠肿瘤生长监测的代表性图像。小鼠接种了1 x 104 肿瘤细胞各一组，并给予相应治疗 原位 第7天。图像显示，在足够时间（28天）后，对照组开始出现转移灶。尽管原发肿瘤对治疗未表现出敏感性，但在CpG处理组中观察到的转移灶较少。 （表1）各组肿瘤负荷的定量分析 （图2B） 结果显示，CpG延缓了肿瘤的发展，处理组与对照组在28天后表现出统计学上的显著差异（非参数双尾Mann-Whitney检验，p = 0.0079）。然而，接受处理的小鼠体内肿瘤仍继续生长，且无一存活（数据未显示）。该发现与既往报道一致：CpG对原发性眼内肿瘤无显著作用。10ODN组与CpG组之间显著差异源于对转移性肿瘤生长的抑制作用。
图2. 肿瘤负荷及治疗反应的监测。（A） 携带PIOL的小鼠两组（ODN对照组与CpG处理组）的代表性图像。（B） 通过发光值（luminoscore）监测肿瘤负荷。如点图所示，CpG在第28天对发光值的影响具有显著性。在上述两组中，该方法能够有效监测肿瘤负荷，并检测到CpG-DNA引起的轻微但显著的作用（p = 0.0079），而仅靠图像无法发现这一差异。请点击此处查看该图的放大版本。
| 组别 | 小鼠 | 转移灶存在情况 | 位置 | 光子通量 (ph/s) |
| CpG | 1 | 无 | X | X |
| 2 | 是 | 眼部引流淋巴结 | 9.32E+05 | |
| 3 | 无 | X | X | |
| 4 | 无 | X | X | |
| 5 | 是 | 眼部引流淋巴结 | 2.21E+07 | |
| ODN | 1 | 是 | 眼部引流淋巴结 | 1.06E+07 |
| 2 | 是 | 眼部引流淋巴结 | 7.25E+07 | |
| 3 | 是 | 眼部引流淋巴结 + 对侧 | 7.64E+08 | |
| 4 | 是 | 眼部引流淋巴结 + 对侧 | 1.74E+09 | |
| 5 | 是 | 眼部引流淋巴结 + 对侧 | 9.76E+07 |
表1. 发光评分法可适用于不同方法
luminoscore 方法不限于单一类型的小鼠模型。 图3 表明该方法可适用于不同的小鼠模型。在SCL模型中，于小鼠两侧各移植一个肿瘤，并给予治疗 原位 在第0天仅接种于单侧，对侧肿瘤作为其对照 （图3A）因此，每只小鼠绘制两个ROI：每侧各一个 （图 3C）处理侧与对照侧的发光评分比值用于描述每例肿瘤的相对病程。该比值在治疗给药当天（第0天）设定为1。我们在治疗给药后13天观察到该比值显著下降图3D；非参数双尾 Mann-Whitney 检验 p = 0.004）。这种减少表明经处理侧的肿瘤已被吸收，如代表性生物发光图像所示 （图3B）.
图3. Luminoscore方法在具有两个原发肿瘤位点模型中的应用。（A） SCL实验设计示意图。在每只小鼠的两侧 flank 部位分别接种两种原位肿瘤。其中一侧注射CpG-DNA或ODN对照，另一侧注射PBS，作为自身对照。 (B) CpG处理组与对照组小鼠在第0天和第13天的代表性图像。处理于第0天给予。小鼠接受CpG处理侧的肿瘤生长受到抑制。 （C） 每只动物两个主要肿瘤部位的手动标注感兴趣区域。 (D) CpG处理侧或ODN对照侧与PBS对照侧的发光评分比值，是反映同一动物体内各肿瘤相对生长情况的指标。该比值在第0天设定为1。至第13天，CpG处理组的比值显著下降（p = 0.004），表明肿瘤生长受到抑制 原位 CpG-DNA的给药 请点击此处以查看此图的放大版本。
讨论
器官和组织对光的吸收仍然是生物发光成像的一个局限性，尽管这种局限性是任何光学成像方式固有的。在本方法的背景下，只要研究在特定模型（位置和小鼠品系）中进行，解剖结构对发光信号值的影响预期具有较低的变异性，从而允许进行比较。生物发光不需要激发光，因此相较于荧光成像，更适用于活体全身in vivo成像。
空间分辨率也是生物发光成像的局限性之一，准确确定生物发光光子所来源的器官位置仍然较为困难。然而，对模型的充分了解有助于对肿瘤部位进行定性定位。该基于生物发光的方法唯一输出的指标是发光值（luminoscore）。由于手动标记的兴趣区域（Region of Interest, ROI）覆盖了整只小鼠，因此位置不会影响发光值。最后，萤火虫荧光素酶需要氧气，因此生物发光成像通常会低估坏死性肿瘤。同样，需要充分了解模型的这一特性。
本文并非旨在评估CpG作为抗肿瘤药物的疗效（该疗效此前已有证实）7,9,11但旨在描述一种可用于比较生物发光数据集的方法。 我们确实描述了一种用于量化肿瘤负荷的方法，旨在帮助标准化在不同时间、不同地点进行不同检测时的图像采集流程，且该方法无需计算机计算。为确保可重复性及光子通量的准确量化，自制成像设备必须使用光源参考进行校准，商用设备则应按照供应商推荐的方法进行校准。
本方案需重点关注以下几个关键点：（i）首先，小鼠麻醉质量对于获取清晰图像至关重要，尤其是在曝光时间较长的情况下；（ii）定量单位必须始终采用光子通量，因为辐亮度依赖于每只小鼠的表面积，在不同个体间比较时可能不具备可比性；（iii）生物发光图像中不得包含饱和像素，否则会偏移发光强度评分；（iv）必须进行背部和腹部成像，以采集肿瘤部位发射出的全部光子即， 前部采集不一定能检测到来自肿瘤后部的光子。在开发luminoscore方法过程中，测试了多种不同的感兴趣区域（ROI）绘制方式。只有手动标注产生了较为满意的结果，且更可能具有统计学意义（数据未显示）。
Inoue 等人建议使用 75 mg/kg 的荧光素酶底物剂量13。然而，通过改用 150 mg/kg 的剂量，可在荧光素酶底物给药后保持相同的成像时间，并确保信号平台期持续整个长时间曝光采集过程。在整个采集过程中，荧光素酶底物必须始终过量。根据实验模型的不同，可调整感兴趣区域（ROI）的设置，例如在 SCL 模型中，我们为每只动物绘制了两个 ROI。 在 SCL 模型中，当肿瘤最大直径达到 0.5 cm 时开始给药治疗，以限制移植变异性的干扰。不同小鼠之间的肿瘤生长情况可能有所差异。为了实现小鼠间的标准化和比较，我们决定采用治疗侧与非治疗侧之间的比值，以反映两侧肿瘤的相对生长情况。
如果在预期为阳性的注射小鼠中未观察到信号，则可能是因为：(i) 细胞数量极少，信号低于检测阈值；或 (ii) 小鼠缺氧，需要立即处理。
多位作者所描述的若干定量生物发光分析方法需要复杂的计算和仪器例如，三维生物发光断层成像）以实现发射的生物发光光子的绝对定量5,15目前尚无公认的使用二维生物发光成像仪对生物发光进行可重复定量的方法，尤其是在肿瘤模型中。我们的目标是标准化图像采集流程，以减少操作者依赖性。
在接种肿瘤后原位注射 CpG in situ 可减少两种模型中的肿瘤负荷。发光评分法可作为监测其他肿瘤免疫治疗模型中肿瘤负荷的工具。监测肿瘤负荷提供了一种非侵入性方法，可在不干扰肿瘤微环境的情况下增进我们对肿瘤生长和转移机制的理解。通过该方法识别对治疗有反应和无反应的动物，可在实验开始时通过验证肿瘤细胞成功注射得到进一步确认。
我们在此展示了luminoscore方法在使用A20.IIA-luc2细胞的SCL模型中的适用性。然而，该方法也可适用于使用其他细胞系的任何其他肿瘤模型，前提是这些细胞表达荧光素酶，或可用于T细胞研究（如肿瘤特异性细胞毒性T细胞、调节性T细胞）的情境中。 等等。）。对 体内 在罕见病基因治疗的背景下，基因转移也可以使用Luminoscore方法进行。
最后，数据表明，基于生物发光的发光评分方法能够实现不同实验之间的比较，具有针对特定实验需求的灵活性和适应性，是无创纵向临床前研究的有用工具。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢科迪耶研究中心动物实验中心（CEF，法国巴黎）、Genethon（法国埃夫里）的动物设施 和法国埃夫里的Genopole（CERFE）. 我们感谢 Jo Ann Cahn 对手稿的仔细审阅。本研究由法国国家健康与医学研究院、巴黎笛卡尔大学和 Pierre & 玛丽·居里大学、抗癌协会（Association pour la Recherche contre le Cancer）、突尼斯科学研究中心总署（Tunisian Direction Générale de la Recherche Scientifique）、法突CMCU项目以及Genopole主题激励行动基金（Actions Thématiques Incitatives de Genopole, ATIGE）。J.C. 受生命科学前沿博士学院和法国国家癌症研究所（INCA）奖学金资助。R.B.A. 获得DGRS-INSERM和CMCU项目的资助。S.D. 获得法国国家癌症研究所（Institut National du Cancer）的资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| CpG 1826 | Invivogen | 序列：5_-TCCATGACGTTCCTGACGTT 目录编号：tlrl-1826 | |
| ODN 1826 对照 | Invivogen | 序列：5_-TCCATGAGCTTCCTGAGCTT<虽然生物发光成像（BLI）在监测癌症动物模型中肿瘤负荷方面展现出潜力，但这些分析目前仍主要为定性性质。本文介绍一种用于生物发光成像的方法，以实现对肿瘤负荷和治疗反应的半定量分析。该方法基于发光评分（luminoscore）的计算，该数值可用于对同一或不同实验中的两个动物进行比较。目前的BLI仪器能够计算此发光评分，其主要依赖于采集条件（背部和腹侧采集）以及感兴趣区域的划定（在小鼠周围的手动标记）。利用两种已报道的小鼠淋巴瘤模型（基于细胞移植），我们证明发光评分法可作为一种无创手段，用于验证肿瘤细胞接种是否成功、监测肿瘤负荷，并评估原位癌症治疗（CpG-DNA）的效果。最后，我们展示该方法适用于多种实验设计。我们建议在临床前小动物研究中，将该方法用于治疗反应的早期评估。> 货号：tlrl-1826c | |
| D-荧光素钾盐 | Interchim | 目录编号：FP-M1224D | |
| 氯胺酮 | Virbac，法国 | ||
| 赛拉嗪 | 拜耳医疗 | Rompun 2% | |
| A20.IIA-luc2 细胞系 | 转染了pGL4.50[luc2/CMV/hygro]的A20.IIA细胞7 （Promega E1310） | ||
| 小鼠 | Balb/cByj | 来自查尔斯河的六周龄雌性小鼠 | |
| IVIS Lumina 生物发光成像仪 | Perkin Elmer | ||
| Living Image 软件 | Perkin Elmer | 用于测量图像上的光子通量并绘制感兴趣区域（ROI） | |
| R 软件（开源） | R-project | 用于统计检验 | |
| Hamilton Precision Syringe 10 µl | Hamilton | 产品编号 7642-01100 | |
| 眼膏 | 拉克瑞诺 | ||
| 解剖显微镜 | ZEISS | Stemi 305 |
参考文献
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