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方法文章

一种用于同时定量水中粪肠球菌属（Enterococcus spp.）和人源粪便相关标记物HF183的双重数字PCR检测方法

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DOI：

10.3791/53611

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2016年3月9日

 ,  , 
1Department of Microbiology, Southern California Costal Water Research Project Authority

本文内容

摘要

本论文描述了一种双重数字PCR检测方法，可用于同时定量Enterococcus spp.和HF183遗传标记，以指示娱乐用水中普遍性及与人类相关的粪便污染。

摘要

本文描述了一种用于同时定量Enterococcus spp.和人类粪便相关标志物HF183的双重数字PCR检测方法（EntHF183 dPCR）。该EntHF183双重dPCR检测（以下简称EntHF183 dPCR）所使用的引物和探针序列与其已发表的单重定量PCR（qPCR）方法相同。同样，在进行dPCR之前，也采用与qPCR前一致的水样过滤和DNA提取步骤。然而，该双重dPCR检测相较于qPCR检测具有多项优势。最重要的是，dPCR通过直接定量目标分子，无需构建标准曲线，从而消除了由此带来的系统偏差和变异性。此外，尽管在qPCR中进行双重检测（即同时定量）Enterococcus和HF183时常会导致样本中丰度较低的目标被严重低估，而dPCR则能够在单独或同一反应中同时定量时，对两个目标均实现一致且可靠的定量结果。dPCR检测还能耐受比qPCR高一到两个数量级的PCR抑制物浓度。这些优势使得EntHF183 dPCR检测尤为具有吸引力，因为它无需分别运行两个独立的qPCR检测，即可同时提供关于环境水体中总体及人类来源粪便污染的准确且可重复的信息。尽管dPCR相较于qPCR具有诸多优势，但在当前可用仪器条件下，其定量上限比qPCR低约四个数量级。因此，在检测目标生物浓度较高（例如污水泄漏后通常观察到的情况）时，需对样本进行稀释后再行测定。

引言

定量PCR（qPCR）方法因其相比传统培养法具有更快的速度、更高的灵活性和特异性，已被广泛应用于娱乐用水水质监测和微生物来源追踪。因此，在美国环保局（USEPA）修订的娱乐用水水质标准中，推荐使用qPCR对肠球菌属（Enterococcus spp.）等通用粪便指示菌实现快速水质监测结果1。此外，已有多种qPCR检测方法被开发并验证，用于识别环境水体中粪便污染的来源2。其中，HF183标记物检测是用于识别与人类相关的粪便污染最常用的检测方法之一3。

然而，qPCR 结果常常存在偏差，因为其定量依赖于标准曲线。qPCR 通过将样本中目标物的定量循环数（Cq）与标准曲线进行插值来量化未知浓度，该标准曲线描述了 Cq 与一系列连续稀释标准品的对数数量之间的线性关系。因此，缺乏可靠且一致的标准参考物质会显著影响 qPCR 结果的准确性。研究显示，使用不同供应商提供的标准品时，qPCR 结果差异约为半个数量级4，而使用同一供应商不同批次的标准品时，结果差异可达 2 倍5。

数字PCR（dPCR）技术通过将一个常规qPCR反应分割成数千至数百万个均一的纳升或皮升级微小反应，生成大量微型PCR，再统计其中阳性反应出现的频率，从而对未知样本进行定量。6被称为液滴数字PCR（即，本文）或芯片式数字PCR，前提是分区为油包水液滴即，本文）或芯片上的微小腔室。样本浓度越高，目标DNA（从而产生阳性PCR结果）出现在更多比例的分区中，这一关系可用泊松分布近似描述。因此，记录二元结果（阳性或阴性PCR），并通过泊松近似利用阳性液滴的频率直接计算未知样本浓度，无需像qPCR那样依赖标准曲线。

数字PCR定量的这种二元特性相较于qPCR具有额外优势7。由于延迟扩增仍可产生阳性PCR结果，因此数字PCR定量对降低扩增效率的抑制作用具有更强的耐受性。类似地，与qPCR不同，数字PCR定量不受Cq值变异的影响，因而相比qPCR具有更高的精密度8-10。

此外，分液过程可确保每个液滴中含有极少量的目标 DNA，从而有效减少底物竞争（即不同 DNA 目标物在扩增过程中相互竞争），这是实现 qPCR 双重检测（即 一个检测同时测量两个 DNA 目标物）的常见障碍。因此，无论以双重还是单重（即 一个检测仅测量一个目标物）模式运行，dPCR 对两个目标物的定量结果几乎无法区分7,11。

本文所述数字PCR检测方法（EntHF183 dPCR）的目标是同时直接定量通用粪便指示菌Enterococcus spp.以及与人粪便相关的HF183标记物，相较于qPCR方法，其具有更高的精确度、重复性以及更强的抗抑制能力。该检测方法已成功用于环境淡水、海水及多种粪便样品中粪便污染的定量分析7，也可应用于其他各类水体和废水样品。由于该方法对抑制物具有高度耐受性，在沉积物或土壤分析中具有广阔应用前景，但因这类样品中抑制物成分复杂，尚需进一步测试验证。

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方案

1. 检测体系配制

  1. 使用分子级水配制所有引物的100 µmol/L储存液，使用TE pH 8缓冲液配制探针的100 µmol/L储存液 [Entero F1A, Entero R1, GPL813TQ 12；HF183-1, BthetR1, BthetP13]。
    注意：两种靶标的探针使用不同的荧光染料进行荧光标记7，具体见材料/设备清单。
  2. 按每反应体系配制主混合液：12 µl数字PCR预混液（2×储存液，参见材料/设备清单）、正向和反向引物各0.216 µl、荧光探针各0.06 µl，以及5.016 µl无核酸酶水（终浓度：每种引物900 nM，每种探针250 nM）。轻轻吹打至少10次以充分混匀，注意避免在溶液中引入气泡。
  3. 将18 µl主混合液（来自步骤1.2）移入普通PCR管或PCR板中，并加入6 µl DNA模板（按先前所述方法提取13），形成用于液滴生成的反应体系。若样品需设重复，每孔加入36 µl主混合液和12 µl DNA模板。在PCR板上相应位置保留对应的重复孔为空。应包括阳性对照（见材料/设备清单）和无模板对照（NTC）（即以分子级水作为模板）。
    注意：阳性对照用于确保实验正常运行，NTC用于确认板内无污染，并在后续数据分析中设定荧光基线。首次使用者建议同时使用未稀释和稀释的DNA样品。

2. 微滴生成与PCR板设置

  1. 使用多通道移液器将反应混合物上下吹打约15次以充分混匀。确保移液器吸头始终浸没在液体中，避免在混合物中产生过多气泡。
  2. 将1号芯片（含8个孔）插入白色芯片架中，并扣紧芯片架。此时1号芯片已牢固固定，无法在生成液滴过程中从架中脱落。使用多通道移液器，轻柔地将20 µl反应混合物转移至芯片上标记为“Sample”的中间位置，避免引入气泡。
  3. 将70 µl液滴生成油通过移液器加入芯片左侧标记为“Oil”的区域。
  4. 将垫圈盖在芯片上，确保垫圈平整，并被芯片边缘的4个卡扣均匀固定。按下液滴生成仪上的绿色指示灯按钮以打开仪器，放入芯片，然后再次按下绿色指示灯按钮关闭仪器。
    注意：门关闭后，按钮指示灯变暗，此时门无法重新打开，液滴生成立即开始，持续约1分钟。
  5. 若需进行超过8个反应，可在液滴生成过程中，将2号芯片放入第二个白色芯片架中，并以与1号芯片相同的方式进行准备，以节省总设置时间。
  6. 当指示灯由暗变绿，表示液滴生成完成，此时打开液滴生成仪门。取出含有1号芯片的白色芯片架，暂放一旁，并将2号芯片放置到液滴生成仪中。
  7. 取下1号芯片上的垫圈并丢弃。轻柔地将芯片第三列（标记为“Droplets”）中生成的全部液滴（约40 µl）转移至最终的PCR板（保持室温）中，用于后续热循环。
    注意：请勿松开白色芯片架的卡扣，以免破坏新生成的液滴；仅在液滴完全转移至最终PCR板后，方可打开芯片架。
  8. 对其他样品重复步骤2.1–2.7。
  9. 当所有液滴均转移至最终PCR板后，在板上覆盖可穿刺的铝箔膜，并将板放入板封仪。将封膜仪温度设为180 °C，按下“Play”键，封膜10秒。

3. 热循环与液滴读取

  1. 将密封的PCR板放置于热循环仪上，所用热循环仪需兼容步骤2.7中最终使用的PCR板，并具备2.0 °C/sec的温度升降温速率。
  2. 运行以下热循环程序：95 °C下10分钟，随后进行40个循环（每个循环包括94 °C下30秒和60 °C下60秒），最后在98 °C下保持10分钟（可选：最终在4或15 °C下保持）。
  3. 循环程序完成后，将PCR板转移至液滴读取仪，以自动检测每个孔中每个液滴的荧光信号。或者，在读取液滴前可将PCR板在4 °C下保存最多3天。开始读取前，确保液滴已恢复至室温。
    1. 打开配套软件以设置液滴读取。在默认的“设置”菜单中，其包含一个空的96孔板示意图，双击A1孔以打开包含三个部分的菜单：“样本”（Sample）、“检测1”（Assay 1）和“检测2”（Assay 2）。
    2. 在“样本”部分，将样本编号输入标有“名称”（Name）的输入框中，然后按回车键或勾选右侧标有“应用”（Apply）的复选框。接着，点击标有“实验”（Experiment）的下拉菜单，选择“RED”（稀有事件检测），然后点击回车键。
    3. 进入标为“检测1”（Assay 1）的部分。在“名称”（Name）栏中填写检测名称（例如 Enterococcus），然后点击回车键。在下方标有“类型”（Type）的输入框中，点击下拉菜单并选择“通道1未知”（Channel 1 Unknown），然后点击回车键。
    4. 进入标为“检测2”（Assay 2）的部分。在“名称”（Name）栏中填写检测名称（例如 HF183），然后点击回车键。在下方标有“类型”（Type）的输入框中，点击下拉菜单并选择“通道2未知”（Channel 2 Unknown），然后点击回车键。此时，步骤3.3.2至3.3.4中的所有信息均已填入A1孔。
    5. 为所有后续含有液滴的孔命名。为节省总设置时间，可按住“Shift”或“Ctrl”键，以同时选择多个孔。
    6. 当软件中显示的板图与实际PCR板一致时，点击菜单右下角的“确定”（OK）。在新出现的位于板图上方的菜单中，在“模板”（Template）部分选择“另存为”（Save As），为该板命名并保存。
    7. 在屏幕左侧点击“运行”（Run），并在弹出的“运行选项”（Run Options）窗口中选择合适的染料组（Dye Set）。数据采集将随即启动，并在软件中实时显示。

4. 数据分析与报告

  1. 当读取仪完成读取并弹出显示“运行完成”的对话框时，点击“确定”。
    注意：软件在软件界面的“分析”部分显示最终数据文件。在此视图中，软件默认选中了板上的所有孔，并以“二维振幅”数据图作为默认显示。
  2. 检查阳性与阴性液滴之间的分离情况。确保阴性对照孔中所有液滴的荧光信号接近基线水平。
  3. 单击标有“Events”的按钮。在右侧显示的直方图下方，勾选名为“Total”和名为“single”的复选框，以显示每孔中被接受的液滴总数。排除任何含有 <10,000 个液滴7 通过按住 Ctrl 键并点击需要排除的孔。
  4. 单击标记为“1D Amplitude”的按钮，为两个目标在NTC孔中阴性液滴之上约一个标准差（500–700荧光单位）处设定荧光阈值。在屏幕左侧“Auto Analyze”下方显示的两个阈值按钮中，选择右侧带有实心粉红色水平线穿过的图标。
  5. 单击每个振幅图下方“设置阈值”左侧的框，并输入适当的荧光阈值。目标浓度单位为拷贝数每 µ反应的浓度将被自动计算。
    注：不同目标物的阈值无需完全相同。
  6. 在1D振幅界面左上角点击“导出”按钮，将结果导出为.csv文件。在.csv文件中，将导出的目标浓度乘以4，以将其从目标拷贝数（Enterococcus属23S基因的拷贝数）转换为每微升数字PCR反应体系中的目标拷贝数。 肠球菌属 或每份HF183标记 µ每微升反应体系中目标拷贝数 µl DNA模板。

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结果

一次成功的EntHF183双重dPCR运行应获得相对较高数量的已接受液滴（约 10,000–17,000）以及相对较大的差异（约 阴性液滴与阳性液滴荧光值之间的差值（约5,000）7. 异常低的液滴数量可能表明液滴生成过程中存在问题，根据本文所用液滴dPCR系统的实证数据，建议以10,000个液滴作为阈值。较弱的分离（即 阳性与阴性液滴之间较小的荧光差异可能表明存在抑制或探针降解7.

总体而言，当对qPCR进行校正以消除标准品相关偏差且无抑制物存在时，EntHF183双重数字PCR（dPCR）检测结果与qPCR结果高度一致7。EntHF183双重dPCR检测与其相应的单重dPCR检测结果高度一致，两种检测格式之间的结果通常无法区分7（图1）。此外，dPCR检测所能耐受的抑制物浓度...

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讨论

本方案中有几个关键步骤。首先，由于该反应体系的预混液比常规qPCR预混液更黏稠，混合操作可能较为困难。仅通过简单的涡旋振荡可能导致混合不充分，进而造成DNA模板在反应体系中分布不均，最终影响液滴中的模板分布，导致定量结果不准确。因此，必须严格按照方案中描述的移液吹打混匀技术操作，以确保数字PCR（dPCR）定量的准确性。其次，必须确保生成的液滴具有均匀的形态和大小。需注意观察液滴生成仪完成单个芯片液滴生成所需时间是否短于正常情况，这可能提示液滴生成效果不佳。如有需要，可记录每个芯片的液滴生成时间，以便后续排查问题。第三，必须将生成的全部40 µl液滴从芯片完整转移至最终的PCR板中，转移过程中应避免液滴剪切破坏，并防止因液滴量不足而影响定量分析。可采用以下技术进行转移操作：1）将多通道移液器设定至40 µl，将吸头以45°角插入芯片右侧标有“Droplets”（液滴）的区域；2）缓慢吸取液滴，并确保所有液滴均被完全吸出（注意观察是否有残留液滴，必要时需进行第二轮吸液）；3）液滴完全吸出后，将移液器吸头轻触PCR板孔壁约一半深度处，缓慢排出液滴。

EntHF183 双重数字PCR（d...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
低吸附微量管Costar3207用于试剂、样品的储存或主混合液的配制
无核酸酶水FisherSciBP2484-50
TE pH 8 缓冲液FisherSciBP2473-100
硬壳96孔板BioRadHSP-9601用于初始主混合液配制及样品接种
铝密封膜BioRad359-0133用于密封样品板
液滴生成仪BioRad186-3002
液滴生成油BioRad186-3005
微流控卡盒BioRad186-4008
DG8卡盒支架BioRad186-3051
密封垫圈BioRad186-3009
20 μl 移液器吸头RaininGP-L10F用于将样品/主混合液转移至卡盒
200 μl 移液器吸头RaininGP-L200F用于将液滴转移至最终的Twin.Tec板
Twin.Tec 96孔板Eppendorf951020320用于最终液滴的热循环及检测
可穿刺热封膜BioRad181-4040用于热循环前密封Twin.Tec板
PX1 PCR板封膜仪BioRad181-4000
CFX96热循环仪BioRadCFX96 and C1000仅需热循环功能，无需光学检测模块
QX100液滴读取仪BioRad186-3001
液滴读取油BioRad186-3004
Droplet PCR Supermix BioRad186-3024即文中所述的数字PCR混合液
QuantaSoft软件（v1.3.2）Quantasoft QX100 用于查看、分析和导出ddPCR数据
肠道菌正向引物（Ent F1A）OperonGAGAAATTCCAAACGAACTTG可使用其他供应商
肠道菌反向引物（Ent R1）OperonCAGTGCTCTACCTCCATCATT可使用其他供应商
肠道菌探针（GPL813TQ）Operon[6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA TAG CTT TAG GGC TA-[BHQ1]可使用其他供应商，但荧光基团必须为FAM
HF183正向引物（HF183-1）OperonATCATGAGTTCACATGTCCG可使用其他供应商
HF183反向引物（BthetR1）OperonCGTAGGAGTTTGGACCGTGT可使用其他供应商
HF183探针（BthetP1）Operon[6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC
ACATTGGA-[BHQ1]		可使用其他供应商，但荧光基团必须为HEX（若使用VIC，则需选择适当的矩阵补偿）。 
阳性对照由E. faecalis基因组DNA与HF183标准质粒（从IDT订购）混合而成。有关E. faecalis的培养方法及所订购HF183质粒的序列信息，请参见Cao et al. 2015（doi:10.1016/j.watres.2014.12.008）。商业化的Enterococcus DNA标准品（ATCC 29212Q-FZ）也可用于阳性对照，替代实验室自备的E. faecalis基因组DNA。

参考文献

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  2. Boehm, A. B., et al. Performance of forty-one microbial source tracking methods: A twenty-seven lab evaluation study. Water Res. 47 (18), 6812-6828 (2013).
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  12. Method 1611: Enterococci in Water by TaqMan® Quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR) Assay. EPA. , Office of Water. Washington, DC. EPA-821-R-12-008. Available from: http://water.epa.gov/scitech/methods/cwa/bioindicators/upload/Method-1611-Entercocci-in-Water-by-TaqMan-Quantitative-Polymerase-Chain-Reaction-qPCR-Assay.pdf (2012).
  13. Cao, Y., et al. Evaluation of molecular community analysis methods for discerning fecal sources and human waste. Water Res. 47 (18), 6862-6872 (2013).

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