一种用于同时定量水中粪肠球菌属（Enterococcus spp.）和人源粪便相关标记物HF183的双重数字PCR检测方法

摘要

本论文描述了一种双重数字PCR检测方法，可用于同时定量Enterococcus spp.和HF183遗传标记，以指示娱乐用水中普遍性及与人类相关的粪便污染。

摘要

本文描述了一种用于同时定量Enterococcus spp.和人类粪便相关标志物HF183的双重数字PCR检测方法（EntHF183 dPCR）。该EntHF183双重dPCR检测（以下简称EntHF183 dPCR）所使用的引物和探针序列与其已发表的单重定量PCR（qPCR）方法相同。同样，在进行dPCR之前，也采用与qPCR前一致的水样过滤和DNA提取步骤。然而，该双重dPCR检测相较于qPCR检测具有多项优势。最重要的是，dPCR通过直接定量目标分子，无需构建标准曲线，从而消除了由此带来的系统偏差和变异性。此外，尽管在qPCR中进行双重检测（即同时定量）Enterococcus和HF183时常会导致样本中丰度较低的目标被严重低估，而dPCR则能够在单独或同一反应中同时定量时，对两个目标均实现一致且可靠的定量结果。dPCR检测还能耐受比qPCR高一到两个数量级的PCR抑制物浓度。这些优势使得EntHF183 dPCR检测尤为具有吸引力，因为它无需分别运行两个独立的qPCR检测，即可同时提供关于环境水体中总体及人类来源粪便污染的准确且可重复的信息。尽管dPCR相较于qPCR具有诸多优势，但在当前可用仪器条件下，其定量上限比qPCR低约四个数量级。因此，在检测目标生物浓度较高（例如污水泄漏后通常观察到的情况）时，需对样本进行稀释后再行测定。

引言

定量PCR（qPCR）方法因其相比传统培养法具有更快的速度、更高的灵活性和特异性，已被广泛应用于娱乐用水水质监测和微生物来源追踪。因此，在美国环保局（USEPA）修订的娱乐用水水质标准中，推荐使用qPCR对肠球菌属（Enterococcus spp.）等通用粪便指示菌实现快速水质监测结果¹。此外，已有多种qPCR检测方法被开发并验证，用于识别环境水体中粪便污染的来源²。其中，HF183标记物检测是用于识别与人类相关的粪便污染最常用的检测方法之一³。

然而，qPCR 结果常常存在偏差，因为其定量依赖于标准曲线。qPCR 通过将样本中目标物的定量循环数（Cq）与标准曲线进行插值来量化未知浓度，该标准曲线描述了 Cq 与一系列连续稀释标准品的对数数量之间的线性关系。因此，缺乏可靠且一致的标准参考物质会显著影响 qPCR 结果的准确性。研究显示，使用不同供应商提供的标准品时，qPCR 结果差异约为半个数量级⁴，而使用同一供应商不同批次的标准品时，结果差异可达 2 倍⁵。

数字PCR（dPCR）技术通过将一个常规qPCR反应分割成数千至数百万个均一的纳升或皮升级微小反应，生成大量微型PCR，再统计其中阳性反应出现的频率，从而对未知样本进行定量。⁶被称为液滴数字PCR（即

方案

1. 检测体系配制

1. 使用分子级水配制所有引物的100 µmol/L储存液，使用TE pH 8缓冲液配制探针的100 µmol/L储存液 [Entero F1A, Entero R1, GPL813TQ ¹²；HF183-1, BthetR1, BthetP1³]。
   注意：两种靶标的探针使用不同的荧光染料进行荧光标记⁷，具体见材料/设备清单。
2. 按每反应体系配制主混合液：12 µl数字PCR预混液（2×储存液，参见材料/设备清单）、正向和反向引物各0.216 µl、荧光探针各0.06 µl，以及5.016 µl无核酸酶水（终浓度：每种引物900 nM，每种探针250 nM）。轻轻吹打至少10次以充分混匀，注意避免在溶液中引入气泡。
3. 将18 µl主混合液（来自步骤1.2）移入普通PCR管或PCR板中，并加入6 µl DNA模板（按先前所述方法提取¹³），形成用于液滴生成的反应体系。若样品需设重复，每孔加入36 µl主混合液和12 µl DNA模板。在PCR板上相应位置保留对应的重复孔为空。应包括阳性对照（见材料/设备清单）和无模板对照（NTC）（即以分子级水作为模板）。
   注意：阳性对照用于确保实验正常运行，NTC用于确认板内无污染，并在后续数据分析中设定荧光基线。首次使用者建议同时使用未稀释和稀释的DNA样品....

结果

一次成功的EntHF183双重dPCR运行应获得相对较高数量的已接受液滴（约 10,000–17,000）以及相对较大的差异（约 阴性液滴与阳性液滴荧光值之间的差值（约5,000）⁷. 异常低的液滴数量可能表明液滴生成过程中存在问题，根据本文所用液滴dPCR系统的实证数据，建议以10,000个液滴作为阈值。较弱的分离（即 阳性与阴性液滴之间较小的荧光差异可能表明存在抑制或探针降解⁷.

总体而言，当对qPCR进行校正以消除标准品相关偏差且无抑制物存在时，EntHF183双重数字PCR（dPCR）检测结果与qPCR结果高度一致⁷。EntHF183双重dPCR检测与其相应的单重dPCR检测结果高度一致，两种检测格式之间的结果通常无法区分⁷（图1）。此外，dPCR检测所能耐受的抑制物浓度.......

讨论

本方案中有几个关键步骤。首先，由于该反应体系的预混液比常规qPCR预混液更黏稠，混合操作可能较为困难。仅通过简单的涡旋振荡可能导致混合不充分，进而造成DNA模板在反应体系中分布不均，最终影响液滴中的模板分布，导致定量结果不准确。因此，必须严格按照方案中描述的移液吹打混匀技术操作，以确保数字PCR（dPCR）定量的准确性。其次，必须确保生成的液滴具有均匀的形态和大小。需注意观察液滴生成仪完成单个芯片液滴生成所需时间是否短于正常情况，这可能提示液滴生成效果不佳。如有需要，可记录每个芯片的液滴生成时间，以便后续排查问题。第三，必须将生成的全部40 µl液滴从芯片完整转移至最终的PCR板中，转移过程中应避免液滴剪切破坏，并防止因液滴量不足而影响定量分析。可采用以下技术进行转移操作：1）将多通道移液器设定至40 µl，将吸头以45°角插入芯片右侧标有“Droplets”（液滴）的区域；2）缓慢吸取液滴，并确保所有液滴均被完全吸出（注意观察是否有残留液滴，必要时需进行第二轮吸液）；3）液滴完全吸出后，将移液器吸头轻触PCR板孔壁约一半深度处，缓慢排出液滴。

EntHF183 双重数字PCR（d.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
低吸附微量管	Costar	3207	用于试剂、样品的储存或主混合液的配制
无核酸酶水	FisherSci	BP2484-50
TE pH 8 缓冲液	FisherSci	BP2473-100
硬壳96孔板	BioRad	HSP-9601	用于初始主混合液配制及样品接种
铝密封膜	BioRad	359-0133	用于密封样品板
液滴生成仪	BioRad	186-3002
液滴生成油	BioRad	186-3005
微流控卡盒	BioRad	186-4008
DG8卡盒支架	BioRad	186-3051
密封垫圈	BioRad	186-3009
20 μl 移液器吸头	Rainin	GP-L10F	用于将样品/主混合液转移至卡盒
200 μl 移液器吸头	Rainin	GP-L200F	用于将液滴转移至最终的Twin.Tec板
Twin.Tec 96孔板	Eppendorf	951020320	用于最终液滴的热循环及检测
可穿刺热封膜	BioRad	181-4040	用于热循环前密封Twin.Tec板
PX1 PCR板封膜仪	BioRad	181-4000
CFX96热循环仪	BioRad	CFX96 and C1000	仅需热循环功能，无需光学检测模块
QX100液滴读取仪	BioRad	186-3001
液滴读取油	BioRad	186-3004
Droplet PCR Supermix	BioRad	186-3024	即文中所述的数字PCR混合液
QuantaSoft软件（v1.3.2）	Quantasoft	QX100	用于查看、分析和导出ddPCR数据
肠道菌正向引物（Ent F1A）	Operon	GAGAAATTCCAAACGAACTTG	可使用其他供应商
肠道菌反向引物（Ent R1）	Operon	CAGTGCTCTACCTCCATCATT	可使用其他供应商
肠道菌探针（GPL813TQ）	Operon	[6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA TAG CTT TAG GGC TA-[BHQ1]	可使用其他供应商，但荧光基团必须为FAM
HF183正向引物（HF183-1）	Operon	ATCATGAGTTCACATGTCCG	可使用其他供应商
HF183反向引物（BthetR1）	Operon	CGTAGGAGTTTGGACCGTGT	可使用其他供应商
HF183探针（BthetP1）	Operon	[6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC ACATTGGA-[BHQ1]	可使用其他供应商，但荧光基团必须为HEX（若使用VIC，则需选择适当的矩阵补偿）。
阳性对照			由E. faecalis基因组DNA与HF183标准质粒（从IDT订购）混合而成。有关E. faecalis的培养方法及所订购HF183质粒的序列信息，请参见Cao et al. 2015（doi:10.1016/j.watres.2014.12.008）。商业化的Enterococcus DNA标准品（ATCC 29212Q-FZ）也可用于阳性对照，替代实验室自备的E. faecalis基因组DNA。