斑马鱼作为评估亚硝酸盐致畸潜力的模型

摘要

接触致畸物可能导致出生缺陷。斑马鱼可用于评估化学物质的致畸潜力。我们通过将斑马鱼胚胎暴露于不同浓度的亚硝酸盐以及在不同暴露时间条件下，展示了斑马鱼在此研究中的应用价值。结果表明，亚硝酸盐具有毒性，并可导致严重的发育缺陷。

摘要

环境中过高的硝酸盐水平可能 导致人类先天性缺陷或流产。这可能是由于肠道和唾液中的细菌将硝酸盐转化为亚硝酸盐所致。然而，在其他哺乳动物研究中，尽管高浓度亚硝酸盐可导致不良生殖结局，但并未引起出生缺陷。因此，亚硝酸盐的致畸潜力尚不明确。若能拥有一个易于评估亚硝酸盐或其他任何感兴趣化学物质致畸效应的脊椎动物模型系统，将具有重要意义。本文中，我们展示了斑马鱼（zebrafish）Danio rerio) 筛选化合物的毒性和胚胎发育缺陷。斑马鱼胚胎体外受精且发育迅速，是致畸研究的良好模型。我们发现，延长亚硝酸盐暴露时间会对胚胎存活产生负面影响；提高亚硝酸盐浓度也会对存活率产生不利影响，而硝酸盐则无此效应。对于能够存活的亚硝酸盐暴露胚胎，可能出现多种缺陷，包括心包腔和卵黄囊异常 水肿、 swim bladder 不充气以及颅面畸形。我们的结果表明，斑马鱼是研究亚硝酸盐致畸潜力的便捷体系。该方法可轻松适用于检测其他化学物质对早期脊椎动物发育的影响。

引言

致畸作用是一种干扰胚胎或胎儿正常发育的过程，可导致永久性的结构和功能异常、生长迟缓，严重情况下甚至引发流产¹。该过程可由某些天然存在的致畸因子引起，这些因子会通过多种机制干扰胚胎发育²。在人类胎儿发育过程中，已有报道称常见的致畸因子（如辐射、感染性病原体、有毒金属和有机化学品）可通过形态发生错误，导致内眦赘皮（上眼睑的皮肤皱褶）和指（趾）屈曲畸形（手指或脚趾弯曲）等缺陷¹。

了解致畸作用的分子机制是开发治疗和预防方法的第一步。已使用多种脊椎动物模型，如非洲爪蟾（Xenopus laevis）和斑马鱼（Danio rerio），来确定致畸物所影响的分子通路。以往的研究已将斑马鱼用作流行病学、毒理学和致畸作用的模型^3-7。Scholz 等认为斑马鱼是环境毒性评估的"金标准"。这在一定程度上归因于斑马鱼胚胎的透明性，使研究人员能够直接观察发育缺陷的发生过程⁸。大约70%的人类基因在斑马鱼中具有直系同源基因，使得斑马鱼成为研究人类发育缺陷的理想脊椎动物模型⁹。

一些流行病学研究提示，常见于农场食品和水中的硝酸盐和亚硝酸盐可能与出生缺陷或自然流产相关^10,11，但其他研究并未支持这种关联¹²。硝酸盐（NO₃^-）和亚硝酸盐（NO₂^-）天然存在于土壤和水中，是植物的氮源之一，也是氮循环的一部分¹³。使用高硝酸盐肥料的农场生产的食品，如青豆、胡萝卜、南瓜、菠菜和甜菜，其硝酸盐和亚硝酸盐含量显著升高⁷。食用高硝酸盐饲料的奶牛所产的牛奶，以及生活在高硝酸盐水体（主要来自土壤径流³⁰）中的鱼类，均可导致人类摄入大量硝酸盐和亚硝酸盐¹⁴。此外，硝酸盐和亚硝酸盐也常用于食品防腐，这显著增加了人类的摄入量¹²。

适量的硝酸盐和亚硝酸盐在血管稳态与功能、神经传导以及免疫防御机制等生理过程中发挥着基础性作用^13-15。然而，暴露于高浓度的硝酸盐和亚硝酸盐可能产生不良影响，尤其是在婴儿和儿童中¹⁶。摄入的硝酸盐可在口腔中通过微生物群转化为亚硝酸盐，也可在胃肠道中由肠道微生物群进一步转化¹⁷。

硝酸盐通过将血红蛋白氧化为高铁血红蛋白，损害血红蛋白的携氧能力，使婴儿面临患蓝婴综合征的高风险¹⁸。在较严重的情况下，这会导致皮肤呈现蓝色，并蔓延至外周组织。组织缺氧会引发其他症状，最严重时可导致昏迷和死亡^19,20。在硝酸盐浓度较高时，婴儿和成人均可出现类似症状²¹。成人因亚硝酸盐中毒导致高铁血红蛋白水平升高，可引起发绀、头痛、呼吸障碍³¹，若未及时治疗，可能因重要组织缺氧相关并发症而死亡^32,33。

摄入较高水平的硝酸盐也可能导致多种健康问题。儿童糖尿病、反复腹泻以及儿童反复呼吸道感染均与高硝酸盐摄入有关^11,17,22。长期暴露于高水平硝酸盐与排尿异常和脾脏出血相关。急性高剂量接触硝酸盐可引发一系列医学病症，如腹痛、肌肉无力、粪便和尿液中带血、晕厥甚至死亡¹¹。孕期高水平接触硝酸盐与神经管缺陷和肌肉骨骼缺陷有关¹¹。

最近的一份报告表明，用亚硝酸盐处理斑马鱼胚胎会导致卵黄囊水肿、颅面及体轴畸形以及 swim bladder 无法充气⁵。在本研究中，我们展示了一种用硝酸盐和亚硝酸盐处理斑马鱼胚胎的方法，以评估其致畸潜力。胚胎被暴露于不同浓度的亚硝酸盐中，并在不同持续时间下进行处理。乙醇被用作阳性对照，因为它是一种已知的致畸物²³。我们的方法显示，高浓度和长时间暴露于亚硝酸盐均对胚胎存活有害，并导致多种表型，从轻微（水肿）到严重（明显的发育缺陷）不等。因此，斑马鱼是一种有价值的模型，可用于直接探究硝酸盐和亚硝酸盐对胚胎潜在致畸效应，从而补充流行病学研究。

方案

本方案中描述的操作程序已获得宾夕法尼亚印第安纳大学机构动物护理和使用委员会的批准。

1. 收集胚胎

1. 将斑马鱼饲养在28.5 °C、pH 7、电导率介于500–1,500 µS、光照/黑暗周期为14小时光照和10小时黑暗的条件下²⁴。使用野生型品系，如Tü、AB或Tü/AB杂交品系。不同品系对化学处理的反应可能不同²⁵。
2. 在收集卵子的前一晚，通过向交配罐中加入斑马鱼系统用水来准备交配。将一条雄鱼和一条雌鱼放入罐中，并用隔板将两者分开。每对鱼可产卵50–300枚。为确保获得足够数量的卵子，设置30对鱼进行交配。通常，在最佳交配年龄（6–9个月大）的鱼对中约有50%会产卵，每对最多可产约200枚卵，本实验最多可获得约3,000枚卵。
3. 次日早晨光照开启后，移除隔板以启动交配。每隔15分钟检查一次交配罐中是否有卵子。
4. 一旦鱼产卵，使用茶筛收集所有胚胎，并将其转移至一个盛有E3缓冲液（5 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.33 mM CaCl₂、0.33 mM MgSO₄）的大容器中。在1.5 hpf时，在体视显微镜下用塑料移液管移除并丢弃未受精的卵子。 未受精的卵呈不透明状，而受精的卵则呈透明状³⁴。
5. 将50个胚胎转移至一个含有50 ml E3缓冲液的100 × 15 mm玻璃培养皿中，用于每种处理条件。本实验共需33个培养皿，以满足11种处理条件、每个条件设3个重复的需求。

2. 胚胎处理

1. 在受精后2小时（hpf）进行处理³⁵。将胚胎/幼鱼在28.5 °C条件下孵育，并在120 hpf时观察幼鱼。每种处理条件至少进行三次重复，以用于统计分析。
2. 在2 hpf时，取3个培养皿（每个含50个胚胎），用移液管吸除E3缓冲液，加入50 ml用E3缓冲液稀释的300 mM乙醇。用Parafilm封住培养皿以减少乙醇挥发。
   1. 继续使胚胎暴露于乙醇中22小时。然后用移液管吸除乙醇，加入50 ml E3缓冲液并轻轻旋转培养皿数次以洗去乙醇。用移液管吸除该E3缓冲液，并重复洗涤步骤2次。
3. 在2 hpf时，取3个培养皿（每个含50个胚胎），用移液管吸除E3缓冲液，加入50 ml新鲜E3缓冲液。
4. 在2 hpf时，取9个培养皿（每个含50个胚胎），用移液管吸除E3缓冲液，加入50 ml溶解于E3缓冲液中的1,000 mg/L亚硝酸钠。使用重氮化法的改良版（USEPA方法354.1）分光光度法预先确认储备亚硝酸盐溶液的浓度²⁸。
   1. 继续将3个培养皿暴露46小时，3个培养皿暴露70小时，另3个培养皿暴露94小时。每天更换为新配制的亚硝酸盐溶液。
   2. 在每种暴露时间结束后，用移液管吸除亚硝酸盐溶液，加入50 ml E3缓冲液并轻轻旋转培养皿数次以洗去亚硝酸盐。用移液管吸除该E3缓冲液，并重复洗涤步骤2次。
5. 在2 hpf时，取3个培养皿（每个含50个胚胎），用移液管吸除E3缓冲液，加入50 ml 200 mg/L亚硝酸钠。同样方法依次使用400、600、800和1,000 mg/L的亚硝酸钠进行处理。
   1. 继续使胚胎暴露于亚硝酸盐中70小时。每天更换为新配制的亚硝酸盐溶液。
   2. 暴露结束后，用移液管吸除亚硝酸盐溶液，加入50 ml E3缓冲液并轻轻旋转培养皿数次以洗去亚硝酸盐。用移液管吸除该E3缓冲液，并重复洗涤步骤2次。
6. 在2 hpf时，取3个培养皿（每个含50个胚胎），用移液管吸除E3缓冲液，加入50 ml溶解于E3缓冲液中的1,000 mg/L硝酸钠。使用镉还原法的改良版（USEPA方法353.3）分光光度法预先确认储备硝酸盐溶液的浓度²⁸。
   1. 继续使胚胎暴露于硝酸盐中70小时。每天更换为新配制的硝酸盐溶液。
   2. 暴露结束后，用移液管吸除硝酸盐溶液，加入50 ml E3缓冲液并轻轻旋转培养皿数次以洗去硝酸盐。用移液管吸除该E3缓冲液，并重复洗涤步骤2次。
7. 在每次暴露期间的每一天，使用体视显微镜计数死亡胚胎/幼鱼的数量。死亡的迹象包括无心跳和血液循环，或在观察1分钟后无运动反应。用移液管移除死亡的胚胎/幼鱼，以减少E3缓冲液的污染。
8. 当实验在120 hpf结束时，对幼鱼实施安乐死。
   1. 用移液管吸除E3缓冲液，然后加入50 ml 0.2% MS-222（用缓冲液调节至pH 7），静置10分钟。
   2. 用移液管吸除MS-222，加入50 ml E3缓冲液并轻轻旋转以洗去MS-222。
   3. 用移液管吸除E3缓冲液，加入20 ml 4%多聚甲醛（PFA）以固定幼鱼。轻轻旋转培养皿数次。用移液管将幼鱼连同足量PFA转移至玻璃小瓶中，确保液体充满小瓶。将小瓶置于冰箱中过夜（O/N）保存。
9. 使用配备数字相机的体视显微镜拍摄固定后的幼鱼图像。放大倍数设为30X，ISO 200，曝光时间为200 msec 。调整幼鱼方向，使头部朝左，背侧朝上。

结果

暴露于300 mM乙醇22小时对存活率无影响（数据未显示），与先前报道一致^5,23,26。这是预期结果，因为乙醇是一种已知的致畸剂，被用作阳性对照。观察到的表型包括心包水肿、 swim bladder 未充气（图1）、颅面缺陷以及发育迟缓（数据未显示）。

亚硝酸盐处理对存活率的影响程度从轻度到重度不等，具体取决于暴露时间。例如，暴露于1,000 mg/L浓度下94小时对存活率的影响显著，相较于较短时间的暴露更为严重（图2）。

我们还评估了不同亚硝酸盐浓度对存活率的影响。胚胎暴露于 200、400、600、800 和 1,000 mg/L 的亚硝酸盐中持续 70 小时。在高浓度亚硝酸盐暴露下，存活率降低，而硝酸盐对存活率无影响（图...

讨论

本文所述方法展示了斑马鱼在评估亚硝酸盐和硝酸盐致畸潜力方面的应用价值。与其他脊椎动物相比，斑马鱼具有多项优势，包括繁殖力高、体外受精、胚胎透明以及发育迅速。目前已有的无色素突变体（如casper斑马鱼）³⁶还能增强内脏器官的可见度。此外，构建携带报告基因的转基因斑马鱼也较为简便，有助于对活体斑马鱼进行分析。³⁷由于斑马鱼基因组与人类基因组具有保守性，通过研究斑马鱼所获得的信息可转化为人类医学应用成果⁹该方法可应用于基因表达分析，例如 原位 杂交，以获取有关致畸剂引起的基因失调的额外信息。

乙醇暴露对存活率无显著影响，但确实导致了与既往报道相似的明显缺陷^5,23,26。这表明我们的方法在重复已发表结果方面具有可靠性。硝酸盐对存活率无影响，而亚硝酸盐则根据浓度和暴露时间表现出显著影响。较长的暴露时间和较高浓度的亚硝酸盐对存活率产生负面影响，与先前的研究结果一致⁵。最近有研究显示，过量的亚硝酸盐暴露会导致斑马鱼心脏瓣膜发育异常²⁷，验证了利...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DREL/2010 仪器	Hach	26700-03
乙醇	Sigma-Aldrich	E7023
KIMAX 玻璃培养皿	VWR	89001-244
MS-222	Sigma-Aldrich	E10521
NitraVer 5 硝酸盐试剂	Hach	14034-46
NitriVer 3 亚硝酸盐试剂	Hach	14065-99
Parafilm 封口膜	Fisher Scientific	3-374-10
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	158127
S6E 体视显微镜	Leica	10446294
硝酸钠	Fisher Scientific	S343
亚硝酸钠	Fisher Scientific	S347
移液管	Laboratory Products Sales	L320072
玻璃小瓶	Fisher Scientific	03-338B