斑马鱼作为评估亚硝酸盐致畸潜力的模型

摘要

接触致畸物可能导致出生缺陷。斑马鱼可用于评估化学物质的致畸潜力。我们通过将斑马鱼胚胎暴露于不同浓度的亚硝酸盐以及在不同暴露时间条件下，展示了斑马鱼在此研究中的应用价值。结果表明，亚硝酸盐具有毒性，并可导致严重的发育缺陷。

摘要

环境中过高的硝酸盐水平可能 导致人类先天性缺陷或流产。这可能是由于肠道和唾液中的细菌将硝酸盐转化为亚硝酸盐所致。然而，在其他哺乳动物研究中，尽管高浓度亚硝酸盐可导致不良生殖结局，但并未引起出生缺陷。因此，亚硝酸盐的致畸潜力尚不明确。若能拥有一个易于评估亚硝酸盐或其他任何感兴趣化学物质致畸效应的脊椎动物模型系统，将具有重要意义。本文中，我们展示了斑马鱼（zebrafish）Danio rerio) 筛选化合物的毒性和胚胎发育缺陷。斑马鱼胚胎体外受精且发育迅速，是致畸研究的良好模型。我们发现，延长亚硝酸盐暴露时间会对胚胎存活产生负面影响；提高亚硝酸盐浓度也会对存活率产生不利影响，而硝酸盐则无此效应。对于能够存活的亚硝酸盐暴露胚胎，可能出现多种缺陷，包括心包腔和卵黄囊异常 水肿、 swim bladder 不充气以及颅面畸形。我们的结果表明，斑马鱼是研究亚硝酸盐致畸潜力的便捷体系。该方法可轻松适用于检测其他化学物质对早期脊椎动物发育的影响。

引言

致畸作用是一种干扰胚胎或胎儿正常发育的过程，可导致永久性的结构和功能异常、生长迟缓，严重情况下甚至引发流产¹。该过程可由某些天然存在的致畸因子引起，这些因子会通过多种机制干扰胚胎发育²。在人类胎儿发育过程中，已有报道称常见的致畸因子（如辐射、感染性病原体、有毒金属和有机化学品）可通过形态发生错误，导致内眦赘皮（上眼睑的皮肤皱褶）和指（趾）屈曲畸形（手指或脚趾弯曲）等缺陷¹。

了解致畸作用的分子机制是开发治疗和预防方法的第一步。已使用多种脊椎动物模型，如非洲爪蟾（Xenopus laevis）和斑马鱼（Danio rerio），来确定致畸物所影响的分子通路。以往的研究已将斑马鱼用作流行病学、毒理学和致畸作用的模型^3-7。Scholz 等认为斑马鱼是环境毒性评估的"金标准"。这在一定程度上归因于斑马鱼胚胎的透明性，使研究人员能够直接观察发育缺陷的发生过程⁸。大约70%的人类基因在斑马鱼中具有直系同源基因，使得斑马鱼成为研究人类发育缺陷的理想脊椎动物模型⁹。

一些流行病学研究提示，常见于农场食品和水中的硝酸盐和亚硝酸盐可能与出生缺陷或自然流产相关^10,11，但其他研究并未支持这种关联¹²

方案

本方案中描述的操作程序已获得宾夕法尼亚印第安纳大学机构动物护理和使用委员会的批准。

1. 收集胚胎

1. 将斑马鱼饲养在28.5 °C、pH 7、电导率介于500–1,500 µS、光照/黑暗周期为14小时光照和10小时黑暗的条件下²⁴。使用野生型品系，如Tü、AB或Tü/AB杂交品系。不同品系对化学处理的反应可能不同²⁵。
2. 在收集卵子的前一晚，通过向交配罐中加入斑马鱼系统用水来准备交配。将一条雄鱼和一条雌鱼放入罐中，并用隔板将两者分开。每对鱼可产卵50–300枚。为确保获得足够数量的卵子，设置30对鱼进行交配。通常，在最佳交配年龄（6–9个月大）的鱼对中约有50%会产卵，每对最多可产约200枚卵，本实验最多可获得约3,000枚卵。
3. 次日早晨光照开启后，移除隔板以启动交配。每隔15分钟检查一次交配罐中是否有卵子。
4. 一旦鱼产卵，使用茶筛收集所有胚胎，并将其转移至一个盛有E3缓冲液（5 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.33 mM CaCl₂、0.33 mM MgSO₄）的大容器中。在1.5 hpf时，在体视显微镜下用塑料移液管移除并丢弃未受精的卵子。 未受精的卵呈不透明状，而受精的卵则呈透明状³⁴。
5. 将50个胚胎转移至一个含有50 ml E3缓冲液的10....

结果

暴露于300 mM乙醇22小时对存活率无影响（数据未显示），与先前报道一致^5,23,26。这是预期结果，因为乙醇是一种已知的致畸剂，被用作阳性对照。观察到的表型包括心包水肿、 swim bladder 未充气（图1）、颅面缺陷以及发育迟缓（数据未显示）。

亚硝酸盐处理对存活率的影响程度从轻度到重度不等，具体取决于暴露时间。例如，暴露于1,000 mg/L浓度下94小时对存活率的影响显著，相较于较短时间的暴露更为严重（图2）。

我们还评估了不同亚硝酸盐浓度对存活率的影响。胚胎暴露于 200、400、600、800 和 1,000 mg/L 的亚硝酸盐中持续 70 小时。在高浓度亚硝酸盐暴露下，存活率降低，而硝酸盐对存活率无影响（图.......

讨论

本文所述方法展示了斑马鱼在评估亚硝酸盐和硝酸盐致畸潜力方面的应用价值。与其他脊椎动物相比，斑马鱼具有多项优势，包括繁殖力高、体外受精、胚胎透明以及发育迅速。目前已有的无色素突变体（如casper斑马鱼）³⁶还能增强内脏器官的可见度。此外，构建携带报告基因的转基因斑马鱼也较为简便，有助于对活体斑马鱼进行分析。³⁷由于斑马鱼基因组与人类基因组具有保守性，通过研究斑马鱼所获得的信息可转化为人类医学应用成果⁹该方法可应用于基因表达分析，例如 原位 杂交，以获取有关致畸剂引起的基因失调的额外信息。

乙醇暴露对存活率无显著影响，但确实导致了与既往报道相似的明显缺陷^5,23,26。这表明我们的方法在重复已发表结果方面具有可靠性。硝酸盐对存活率无影响，而亚硝酸盐则根据浓度和暴露时间表现出显著影响。较长的暴露时间和较高浓度的亚硝酸盐对存活率产生负面影响，与先前的研究结果一致⁵。最近有研究显示，过量的亚硝酸盐暴露会导致斑马鱼心脏瓣膜发育异常²⁷，验证了利.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DREL/2010 仪器	Hach	26700-03
乙醇	Sigma-Aldrich	E7023
KIMAX 玻璃培养皿	VWR	89001-244
MS-222	Sigma-Aldrich	E10521
NitraVer 5 硝酸盐试剂	Hach	14034-46
NitriVer 3 亚硝酸盐试剂	Hach	14065-99
Parafilm 封口膜	Fisher Scientific	3-374-10
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	158127
S6E 体视显微镜	Leica	10446294
硝酸钠	Fisher Scientific	S343
亚硝酸钠	Fisher Scientific	S347
移液管	Laboratory Products Sales	L320072
玻璃小瓶	Fisher Scientific	03-338B