本文介绍了一种基于核仁组织对小鼠窦状卵泡卵母细胞进行表征的实验方案。
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摘要
摘要
本方案描述了一种简单快速的方法，用于分离和鉴定小鼠窦状卵泡中的GV（生发泡）卵母细胞，并根据其在受精后能否发育至囊胚阶段，将其分为具有发育能力（SN，核仁被染色质包围）和无发育能力（NSN，核仁未被染色质包围）两类。 体外 成熟（IVM）和 体外 受精（IVF）。该方法利用Hoeschst33342（或其他任何可插入DNA的染料），该染料能够结合核仁异染色质，在SN型卵母细胞中呈现环状结构，而在NSN型卵母细胞中则无此现象。这是对窦状卵泡卵母细胞进行分选的最简便且快速的方法，分选出的卵母细胞可进一步用于体外成熟（IVM）或体外受精（IVF）操作。
简而言之，该实验方案包括以下步骤：注射激素以促进卵泡生长；使用无菌针头穿刺卵巢，从窦状腔室中分离处于生发泡期（GV期）的卵母细胞；制备细玻璃毛细管用于口吸法操作卵母细胞；利用活体染色浓度的Hoechst33342对卵母细胞进行分选；随后进行体外成熟（IVM）、体外受精（IVF）或其他分子/细胞水平的分析。
遗憾的是，目前仍缺乏使用侵入性较小的技术来区分SN型与NSN型卵母细胞的充分证据。如果未来能够实现对这两种卵母细胞的识别，则有望将其应用于人类辅助生殖技术中，尽管仍需对多个方面进行改进。迄今为止，该技术在濒危物种以及具有经济价值的物种中，对显著提高体外成熟（IVM）和体外受精（IVF）的成功率具有潜在的重要意义。
引言
从卵巢的窦状腔室中分离出的窦状腔完全成熟卵母细胞（GV，生发泡期）通常被用于多种目的，例如研究体外成熟至第二次减数分裂中期（Metaphase II）阶段背后的分子与细胞机制。
尽管大多数窦状卵母细胞外观美丽，但并非全部都能完成减数分裂并发育至囊胚阶段；事实上，在包括人类在内的许多哺乳动物物种中1,2，若发生受精，约有30%的卵母细胞会在2细胞阶段停止发育3-5。迄今为止，可用于区分能够支持胚胎发育与无法支持胚胎发育的卵母细胞的参数仍然很少。
例如，甲苯胺蓝染色法（BCB）是一种基于葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性对卵母细胞进行筛选的有效方法，但该方法在不同实验室中对BCB阳性（BCB+）或BCB阴性（BCB-）染色结果的应用效果仍存在差异6-8。
另一种成熟的方法基于它们的染色质组织结构：若使用任何DNA嵌入染料（如Hoechst33342）染色，70%的窦状卵泡卵母细胞在核仁周围显示出染料阳性的环状结构，被称为“核仁周围型”（Surrounded Nucleolus, SN）；其余30%则显示出更分散的斑点状阳性信号，被称为“非核仁周围型”（Not Surrounded Nucleolus, NSN）3-5。最近我们发现，细胞质晶格结构（cytoplasmic lattices, CPLs）的缺失9（CPLs是哺乳动物卵母细胞和胚胎中母源mRNA和核糖体的重要储存位点）10、MATER基因的下调（对CPLs的形成至关重要11），以及细胞质中脂滴的存在9,12，可能是导致NSN型卵母细胞无法发育至2细胞阶段之后的其他原因。
遗憾的是，目前可用于分离窦状卵泡中的SN型和NSN型卵母细胞的技术很少，因此，开发一种侵入性更小的方法（无需核染色、固定步骤或口吸管操作）对于提高人类和动物胚胎的发育率可能具有重要意义。
本文详细介绍了从雌性小鼠中分离有窦卵泡的SN和NSN型卵母细胞的简单快速的实验方案，适用于所有对雌性配子发生、卵母细胞成熟及胚胎发育研究感兴趣的科研人员。
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方案
本方案遵循欧洲（EU 63/2010）和意大利（26/2014）有关保护用于科学研究动物的指导原则。卵巢分离采用颈椎脱位法实施安乐死，该操作由本研究获批方案中列明的、经验丰富的专业人员执行。
1. 动物
- 将3至6周龄的成年雌性小鼠饲养于温度和湿度受控的环境中（12小时光照：12小时黑暗循环），并提供饲料 随意摄取).
- 腹腔注射2.5 IU孕马血清促性腺激素（PMSG）以模拟卵泡刺激素（FSH）的作用，促进小鼠卵泡发育。48小时后取出卵巢，收集窦状卵泡中的卵母细胞。根据所在机构的指导原则，处死此前已注射PMSG的雌性小鼠。
- 迅速将卵巢从体腔中取出，并置于含有M2培养基的培养皿中，用于后续卵母细胞的分离（见第3节）。
- 用无菌解剖剪在覆盖腹壁的皮肤上做一切口，随后切开腹膜。打开切口以暴露腹腔，用无菌镊子将肠管移至一侧，找到呈V形走向、自膀胱起始的子宫输卵管。
- 观察位于肾脏下方的卵巢。用无菌镊子夹住每根输卵管，并在卵巢底部做一小切口以释放卵巢。将两侧卵巢转移至含有预平衡培养基的培养皿底部。
2. 激素制备
- 用无菌等渗生理盐水稀释PMSG（可提供不同储存浓度），配制工作浓度为每0.1 ml含2.5 I.U.激素，以适应适当的注射体积。
注意：激素溶液必须分装至0.5 ml离心管中，于-20 °C保存至使用当日。稀释后的分装液在-20 °C下保存不得超过三个月。一旦解冻，若需进行连续注射，应将激素溶液分装液置于+4 °C保存，并在4天内使用完毕。
3. 窦卵泡卵母细胞的分离
为正确分离卵母细胞：
- 在开始卵母细胞分离操作前，将M2培养基13（M2）置于5% CO2、37 °C条件下平衡至少1小时。准备两个培养皿（35 mm × 10 mm），其中一个加入1 ml M2用于穿刺卵巢，另一个则加入少量M2液滴（每滴20 µl），并用矿物油（约1.5 ml）覆盖，用于从卵巢中分离后的卵母细胞转移（见步骤3.4–3.6）。将两个培养皿均置于5% CO2、37 °C的培养箱中，待用。
- 卵母细胞分离过程中使用体视显微镜。
- 通过将玻璃巴斯德吸管水平持握（双手各持吸管一端），并在本生灯垂直火焰上拉伸，制备细口玻璃吸管，用于收集卵母细胞（图1）。
- 当玻璃开始熔化时，迅速将吸管移离火焰，并快速拉伸以获得所需吸管。用指甲紧靠吸管狭窄处切断多余玻璃部分，以调节吸管长度和毛细管内径。确保细长毛细管的内径约为100 µm，略大于卵母细胞直径（约80 µm）。
- 进行口吸操作时，使用合适的接头将抽吸管一端连接至拉制好的吸管，另一端放入口中，并用牙齿固定。
- 使用无菌镊子取出卵巢，并将其置于细胞培养用培养皿（35 mm × 10 mm）底部。加入1 ml预先在37 °C、5% CO2条件下平衡的M2培养基覆盖（图2）。
- 用无菌胰岛素注射针头轻轻穿刺卵巢中的窦状卵泡，使窦状卵母细胞释放至M2培养基中（图3）。
- 用细口巴斯德吸管轻柔地口吸卵母细胞，以去除卵丘细胞及其他可能的组织碎片（图4A），随后将其转移至预先准备的、覆盖有适用于胚胎培养的矿物油的小滴M2（每滴20 µl）底部（图4B）。
注意：需通过在多个不同的M2液滴中反复吹打，彻底去除附着于卵母细胞透明带上的所有卵丘细胞。此步骤应尽快完成，以避免培养基pH值发生改变。
4. 使用 Hoechst33342 对窦状卵泡卵母细胞进行染色
注意：经Hoechst33342（或其他特异性标记A-T碱基的染料）活体染色后，可根据染色质的组织形态将窦卵泡期卵母细胞区分为SN（核仁周围致密染色质型）、NSN（核仁周围非致密染色质型）或任何其他中间形态14。事实上，SN型卵母细胞在核仁周围呈现Hoechst染色阳性的环状结构，而NSN型则无此特征，其名称亦由此而来。
为正确进行卵母细胞染色：
- 使用口吸管将卵母细胞转移至含有Hoechst33342（20 µl，用M2培养基稀释至终浓度50 ng/µl）的液滴中，染色10分钟 在暗处
- 孵育Hoechst33342后，用口吸管将每个卵母细胞转移至覆盖矿物油的小液滴（5 µl）底部的M2液滴中，根据染色质结构（SN或NSN）进行分选。使用配备Hoechst33342滤光片（发射波长486 nm）的荧光显微镜观察卵母细胞的染色质构型。
注意：根据所使用的荧光显微镜类型，图像采集可能必须使用玻璃底培养皿。配备35 mm培养皿样品架的共聚焦显微镜Olympus Fluoview Fv10i在进行图像采集时，仅可使用底部为玻璃的培养皿，玻璃厚度标准为0.17 mm，可接受范围为0.13至0.21 mm。 - 刺激卵母细胞的时间不超过5-10秒，通常足以观察核仁周围是否存在环状结构。图5).
- 分选后，将窦腔期SN和NSN卵母细胞在M2培养基中于5% CO₂条件下培养2 并置于37 °C以诱导 体外 成熟，或将其保存在适当的缓冲液中以进行分子或细胞分析。
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结果
以下图片展示了从小鼠卵巢中分离窦状卵母细胞的方法，从移液管的制备到利用Hoechst33342对卵母细胞进行分选。该方法非常简便，任何配备有CO2培养箱、体视显微镜以及带有Hoechst33342观察所需滤光片的荧光显微镜的实验室均可开展。图1展示了移液管制备的初始步骤：当玻璃开始熔化并变软时，必须将移液管两端拉开，同时将其从火焰中取出。或者，毛细玻璃管也可采用相同方式拉制，或使用经过适当校准的微移液管拉制仪进行拉制。这一步骤至关重要，因为获得具有合适毛细管直径的移液管极为重要：若管径过细，卵母细胞可能在细小的毛细管内发生破碎，并在数分钟内死亡；若管径过粗，在转移卵母细胞（例如从一滴培养液转移到另一滴）时，可能无法有效吸取含有卵母细胞的培养液。图2和图3展示了使用无菌胰岛素针头通过机械方法从窦状卵泡中分离窦状卵母细胞的过程。这些卵泡较易识别，其特征是具有一个含有液体的腔隙（即窦腔），该液体即为卵母细胞和颗粒细胞所处的微环境，也是各种分子与外界环境进行...
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讨论
本方案描述了分离和分类小鼠窦状卵泡GV期卵母细胞的方法。除少数例外情况外，该过程没有特别需要强调的关键步骤。首先：操作应尽快完成，以实现以下两个目的：a）维持卵母细胞的活力；b）避免所用培养基的pH值发生变化。其次：卵母细胞暴露于Hoechst33342染料的时间应短暂（5–10秒），以避免染色质损伤以及卵母细胞后续死亡，尤其是在后续步骤为体外成熟（IVM）和体外受精（IVF）的情况下。迄今为止，这是分选SN型和NSN型小鼠窦状卵泡卵母细胞的最快方法。
Hochest33342 已被证明是鉴定雌性小鼠（及其他哺乳类实验动物模型）SN 和 NSN 卵母细胞的有效方法，但遗憾的是，它不能用于人类窦状卵泡卵母细胞的分选以实现生育目的。
然而，由于 体外 卵母细胞的成熟在人类中也常规使用，因此找到一种非侵入性方法来区分未成熟卵母细胞将极为重要 "良好" 卵母细胞（即，SN）从 "差" （此处为不完整输入，无完整语义，无法翻译）即，NSN）以提高成功率...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露
致谢
M.M. 和 C.A.R. 感谢意大利帕维亚圣马泰奥医院基金会（I）2009 年度卫生部定向研究/青年研究人员项目提供的经费支持。M.M. 和 C.A.R. 感谢 Marianna Longo 在图像准备过程中提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| PMSG | Sigma | G4527 | |
| EmbrioMax M2 | Millipore | MR-015-PD | |
| Hoechst33342 | Thermo Scientific | 62249 | |
| 矿物油 | Sigma | M8410 | |
| 细胞培养皿 35mm×10mm | Corning | 430165 | |
| µ-皿 35mm，高玻璃底 | Ibidi | 81158 | |
| 巴斯德吸管 硼硅酸盐 | Corning | 7095D-9 | |
| 用于校准毛细移液管的抽吸管组件 | Sigma | A5177 |
参考文献
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重印与许可
