本方案介绍了一种利用市售材料制备金纳米颗粒整合型光响应脂质体的简单方法。同时展示了如何测量合成脂质体在脉冲激光处理下微泡空化过程的方法。
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本文内容
摘要
摘要
光响应性纳米颗粒（NPs）因其在药物释放过程中实现空间、时间和剂量控制方面的潜力而受到广泛关注。然而，大多数相关技术仍处于研发阶段，尚未可供临床使用。本文介绍了一种简便的方法，利用市售的金纳米颗粒和热响应性脂质体来制备这类光响应性纳米颗粒。采用钙黄绿素作为模型药物，以评估其包封效率以及在热/光刺激下的释放动力学特征。最后，我们证明这种光触发释放是由于微泡空化引起的膜破裂所致，该过程可通过水听器进行检测。
引言
利用外部刺激触发药物释放的可能性，是一种极具吸引力的药物递送方式，可实现空间、时间和剂量控制下的高特异性递送，并将不良反应降至最低。在多种外源性刺激响应系统（如光、磁场、超声波、微波辐射）中，光触发平台因其无创性、操作简便以及在临床应用中的良好适应性而备受关注1。过去十年的广泛研究已开发出多种平台技术，例如由智能聚合物包覆的近红外光响应金（Au）纳米笼2、光不稳定且与药物偶联的聚合物纳米颗粒（NPs）3，以及自组装的卟啉体纳米囊泡4。然而，这些技术仍处于临床前研发阶段，尚需对启动和控制药物释放过程中涉及的各项参数进行深入理解与优化。
制备此类系统最简单且易于实现的方法之一是将金纳米颗粒（Au NPs）与热敏性脂质体相结合5,6，这两者在市场上均广泛可得，并已在临床前甚至临床试验中得到广泛研究。尽管金纳米颗粒在其等离子体共振波长下对深层组织的激活存在局限性，与近红外光激活的金纳米结构（例如，纳米笼）相比有所不足，但该系统在小型动物实验或用于人体局部给药时仍具有广阔的应用前景7。目前已有一些将金纳米颗粒与脂质体结合用于光触发释放的初步研究8-11。尽管这些研究大多聚焦于材料的新颖性，但仍需解决其可及性和可扩展性方面的问题。此外，关于利用这些纳米载体的释放机制的研究报道仍然有限。
本文描述了同时负载药物和亲水性金纳米颗粒（Au NPs）的光响应性脂质体的制备方法。采用钙黄绿素作为模型化合物，用于评估该系统的包封效率和释放特性。此外，在该系统中，金纳米颗粒吸收的光以热的形式耗散至周围微环境，导致局部温度升高。激光加热过程中产生空气微泡，并引起脂质体的机械性破裂（图1）。微泡空化机制通过水听器测量得以证实。
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方案
1. 准备
- 使用王水（1份浓硝酸（HNO3）和3份浓盐酸（HCl））清洗100 ml圆底烧瓶，并用去离子水冲洗烧瓶。将烧瓶进行高压灭菌，并在100 °C的热风烘箱中干燥15分钟。将无菌烧瓶包裹后保存，直至使用。
- 使用70%乙醇对手持式微型挤出器组件进行灭菌。
- 开启旋转蒸发仪，将热水浴和冷却塔的温度分别设置为37 °C和4 °C。
- 通过将374 mg的钙黄绿素溶解于10 ml的0.1 mM磷酸盐缓冲液（PBS）（pH 7.4）中，制备60 mM的钙黄绿素储备液。使用1 M氢氧化钠（NaOH）溶液将pH调节至7.4。
2. 脂质体的合成
- 从冷冻柜（-20 °C）中取出脂质（1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DPPC）、1-棕榈酰-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（MPPC）和1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[羧基（聚乙二醇）-2000]（铵盐）（DSPE-PEG2000）），将其解冻至室温。
- 称取15.9 mg DPPC、1.3 mg MPPC和2.8 mg DSPE-PEG2000，共同溶于2 ml氯仿中。
- 将氯仿溶液转移至无菌圆底烧瓶中，在减压条件下使用旋转蒸发仪蒸发溶剂，形成一层均匀干燥的脂质薄膜。
- 在45 °C下，用2 ml水溶液水合脂质膜30分钟，该水溶液包含步骤1.4中制备的1.95 ml 60 mM钙黄绿素和50 µl Au NPs（3.36 × 1016 个粒子/ml）。
- 将加热块预热至45 °C。将200 nm聚碳酸酯膜滤器置于滤器支撑之间，组装小型挤出器装置。使用去离子水检查是否存在泄漏。
- 用注射器吸取1 ml步骤2.4中的脂质体溶液，通过挤出装置将溶液推至另一端的注射器中完成挤出。重复此过程11次。
- 将合成的脂质体通过PD-10脱盐柱，以PBS为洗脱液，根据制造商说明书去除游离的Au NPs、脂质和钙黄绿素。
- 将样品储存于无菌管中，置于4 °C保存，并在2天内使用。
3. 通过加热诱导脂质体释放钙黄绿素
- 通过将步骤 2.2 中 DPPC、MPPC 和 DSPE-PEG2000 的摩尔浓度相加，计算脂质储备液的脂质总摩尔浓度。使用 0.1 mM PBS 缓冲液（pH 7.4）将脂质体储备液稀释至 5 mM 的脂质浓度。将样品转移至离心管（2 ml）中。
- 将离心管放入热水浴中，将温度从 25 °C 逐渐升至 70 °C。此处升温速率为 1 °C/min。
- 在不同温度点（27、32、37、39、41、43、45、52、57、62、67 和 70 °C）分别取等分试样（10 µl）。
- 向 2 ml 脂质体溶液等分试样中加入 10 µl 的 2% Triton X-100，在室温下孵育 10 分钟以消化脂质体，使钙黄绿素完全释放。
- 将 200 µl 脂质体溶液转移至 96 孔微孔板的每个孔中，使用荧光微孔板读数仪测定所收集样品的荧光强度。钙黄绿素的激发波长和发射波长分别为 480 nm 和 515 nm。
- 以经 Triton X-100 处理样品的荧光强度作为 100% 释放值，利用以下公式计算每个时间点钙黄绿素的释放百分比：
Ft 为在给定时间点溶液的荧光强度，Fi 和 Fx 分别为溶液归一化后的初始和最终荧光强度。
4. 使用脉冲激光诱导脂质体中钙黄绿素的释放
- 取100 µl脂质体溶液转移至石英比色皿中，并将其放入比色皿支架。使用脉冲Nd:YAG激光器作为光源，激光波长为532 nm，脉冲持续时间为6 nsec。激光参数设置如下：重复频率：1 Hz；激光能量密度：1 mJ/cm2；光束直径：0.5 mm。
- 引导准直激光束穿过比色皿，使光通过脂质体溶液，并在不同脉冲后收集等分试样。
- 向2 ml脂质体溶液等分试样中加入10 µl的2% Triton X-100，在室温下孵育10分钟以消化脂质体，实现钙黄绿素的完全释放。
- 考虑到钙黄绿素对光敏感，在激光实验过程中可能发生漂白，因此需预先测量脉冲激光对钙黄绿素溶液的漂白效应，以对脂质体释放数据进行归一化处理。
- 具体操作：将钙黄绿素溶液（60 mM）暴露于频率为1 Hz的脉冲激光下，脉冲次数分别为0、25、50和100。在激光照射前后，分别在激发波长480 nm和发射波长515 nm下测定钙黄绿素的荧光强度。
- 计算漂白程度（激光照射前钙黄绿素的荧光强度 / 特定脉冲次数后钙黄绿素的荧光强度）。将该因子用于归一化脂质体样品的测定值，即将脂质体的荧光强度乘以该因子。
- 使用荧光酶标仪测定所收集样品的荧光强度，激发波长和发射波长分别为480 nm和515 nm。
- 以经Triton X-100处理样品的荧光强度作为100%释放量，利用以下公式计算每个脉冲次数下释放的钙黄绿素百分比：
Ft为特定脉冲次数后经归一化处理的溶液荧光强度，Fi和Fx分别为溶液经归一化处理后的初始和最终荧光强度。
5. 压力脉冲的测量
- 取100 µl样品置于显微镜载玻片上，并将激光聚焦于样品处。
- 将一根针式水听器（直径1 mm，灵敏度450 nV/Pa）浸入溶液中。
注意：水听器不得受到激光照射，以避免损坏。 - 使用脉冲激光以不同的脉冲次数（0–100）和脉冲能量（20–160 µJ/脉冲）照射样品。
- 使用数字示波器记录压力信号。
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结果
采用传统的薄膜水化法制备脂质体，其中DPPC、MPPC和DSPE-PEG2000的摩尔比为86:10:4，或质量浓度为7.95:0.65:1.39 mg/ml。12 金纳米颗粒（Au NPs）的尺寸对于后续激光激发实验中光热转换效率的确定至关重要。Au NPs的尺寸越小，其转导效率越高。13 因此，选择供应商提供的最小尺寸样品——5 nm的Au NPs进行包封。在合成过程中，将含有Au NPs和钙黄绿素（calcein）的水化介质加入以形成多层囊泡，随后通过尺寸挤出和凝胶过滤色谱法去除游离的Au NPs和钙黄绿素。
钙黄绿素（calcein）是一种亲水性荧光染料，被包封在脂质体的水相核心中，浓度为 60 mM。在此高浓度下，钙黄绿素的荧光会发生自猝灭。然而，当钙黄绿素从脂质体中释放并被稀释时，荧光得以恢复，从而指示药物的触发释放。14 利用钙黄绿素的这一特性，将脂质体稀释至 5 mM，并...
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讨论
薄膜水化法是制备脂质体的传统方法。首先使用有机溶剂（本实验中为氯仿）溶解脂质，然后在37 °C下通过旋转蒸发仪去除溶剂，从而在烧瓶内壁形成脂质薄膜。随后，用含有60 mM 钙黄绿素和5 nm 金纳米颗粒（Au NPs）的水溶液对脂膜进行水化。在水化过程中，温度维持在约50 °C，并通过持续旋转烧瓶实现充分振荡。此步骤的关键在于分别选择合适的蒸发和水化温度。脂质体的主要成分DPPC的相变温度（Tm）为41 °C。在形成脂质薄膜阶段，温度应低于41 °C，以防止干燥脂质聚集成块；而在水化阶段，则需采用高于Tm的温度，以促使磷脂分子自组装成球形的多层囊泡结构。尽管薄膜水化法操作简便，但其对水溶液中钙黄绿素和金纳米颗粒的包封效率较低（<1%）。未来可通过冻融循环等方式提高包封效率。
随后使用手持式小型挤出器在加热块上进行尺寸减小的挤出操作。此装置最多可挤出1 ml溶液，适用于实验室小规模制备。该步骤的关键仍然是温度，必须高于脂质体的相变温度。在50 °C下进行挤出，经过10次通过孔径为200 nm的膜，脂质体的粒径即变得均一。由于挤出器内...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作部分得到了新加坡教育部基础研究基金（RG 64/12 至 CX）以及南洋理工大学-西北大学纳米医学研究所的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1,2-二棕榈酰-sn二棕榈酰基-甘油-3-磷酸胆碱（DPPC） | Avanti Polar Lipids（美国阿拉巴马州） | 850355P | 粉末，-20℃保存 °C |
| 1-棕榈酰-2-羟基-sn甘油-3-磷酸胆碱（MPPC） | Avanti Polar Lipids（美国阿拉巴马州） | 855675P | 粉末，-20℃保存 °C |
| 1,2-二硬脂酰基-sn甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]（铵盐）（DSPE-PEG2000） | Avanti Polar Lipids（美国阿拉巴马州） | 880120P | 粉末，-20℃保存 °C |
| 金纳米颗粒 | Sigma Aldrich | 752568-100mL | 5 纳米颗粒，稳定在0.1 mM PBS |
| 钙黄绿素 | Sigma Aldrich | C0875-10g | 60 mM，pH 7.4（用 NaOH 调节） |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Sigma Aldrich | P5493 | 0.1 mM，pH 7.4 |
| 双蒸水 | 默克密理博 Milli-DI 水纯化系统 | ||
| Triton X100 | 西格玛，生命科学 | X-100 | 为了破坏脂质体以计算总包封率 |
| 旋转蒸发仪 | 布奇（瑞士） | R 210 | 用于脂质体的制备 |
| 加热浴 | 布奇（瑞士） | B 491 | 用于脂质体的制备 |
| 真空控制器 | 布奇（瑞士） | V-850 | 用于脂质体的制备 |
| 真空泵 | 布奇（瑞士） | V-700 | 用于脂质体的制备 |
| 带温度控制器的循环水浴锅 | Polyscience | 用于脂质体的制备 | |
| 微型挤出机组件与加热块 | Avanti Polar Lipids（美国阿拉巴马州） | 610000 | 用于脂质体挤出 |
| 注射器，1,000 μl | Avanti Polar Lipids（美国阿拉巴马州） | 610017 | 用于脂质体的挤出 |
| 聚碳酸酯滤膜，200 纳米米 | Whatmann | 800281 | 用于脂质体挤出 |
| 滤器支撑 | Avanti Polar Lipids（美国阿拉巴马州） | 610014 | 用于脂质体的挤出 |
| PD-10 脱盐柱，Sephadex G-25 中等颗粒 | 通用电气医疗集团，生命科学 | 17-0851-01 | 用于纯化脂质体 |
| 离心 | Sigma 实验室离心机 | 3K30 | 用于浓缩脂质体溶液 |
| 转子 | Sigma | 19777-H | 用于浓缩脂质体溶液 |
| Zetasizer | Nano ZS 马尔文 | 用于测定脂质体粒径和ζ电位 | |
| 紫外-可见分光光度计 | 岛津 | UV-2450 | 用于测定样品的吸光度 |
| 荧光分光光度计 | Molecular Devices | SpectraMax M5 | 用于测量样品的荧光发射 |
| Nd:YAG 激光器 | NewWave Research | 532 nm；最大功率：17 毫焦；宽度：406 纳秒；用于样品辐照 | |
| HNR 水听器 | ONDA | HNR-1000 | 直径1 mm，灵敏度450 nV/Pa，正常工作频率范围：0.25–10 兆赫；校准：50 毫伏/巴（mV/Bar）；用于测量声学信号 |
| 数字示波器 | LECORY - Wave Runner 64Xi-A | 频率：600 MHz；最大采样率：10 Gs/秒（双通道）；用于记录测得的声学信号 |
参考文献
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