方法文章

DamID-seq：通过高通量测序腺嘌呤甲基化DNA片段实现全基因组蛋白质-DNA相互作用作图

DOI：

10.3791/53620

⸱

2016年1月27日

 ,  , 
1Department of Cell Biology, Yale University School of Medicine

本文内容

摘要

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本文介绍了一种将DNA腺嘌呤甲基转移酶鉴定技术（DamID）与高通量测序相结合的检测方法（DamID-seq）。该改进方法具有更高的分辨率和更宽的动态范围，可实现DamID-seq数据与其他高通量测序数据（如ChIP-seq、RNA-seq）的联合分析。 等等。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA腺嘌呤甲基转移酶鉴定（DamID）检测是一种强大的方法，可用于在局部及全基因组范围内检测蛋白质-DNA相互作用，是染色质免疫沉淀（ChIP）的一种替代方案。通过表达一种融合蛋白，该蛋白由目标蛋白与大肠杆菌（E. coli）DNA腺嘌呤甲基转移酶组成，可在蛋白质-DNA相互作用位点附近的GATC序列中对腺嘌呤碱基进行甲基化。随后可特异性扩增并检测腺嘌呤甲基化的DNA片段。传统的DamID检测通过将甲基化DNA片段与DNA微阵列杂交来确定其在基因组中的位置，但该方法受限于微阵列的可获得性以及预设探针的密度。本文中，我们报道了将高通量DNA测序技术整合到DamID中的详细实验方案（DamID-seq）。DamID-seq产生的大量短读长序列，使得全基因组范围内蛋白质-DNA相互作用的检测与定位具有高精度和高灵敏度。我们已应用DamID-seq检测哺乳动物细胞中基因组与核纤层（NL）之间的相互作用，并发现DamID-seq在检测基因组-NL相互作用时具有高分辨率和宽动态范围。DamID-seq方法能够探测基因结构内的NL关联，并支持将基因组-NL相互作用图谱与其他功能基因组数据（如ChIP-seq和RNA-seq）进行比较分析。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA腺嘌呤甲基转移酶鉴定（DamID） 1,2 是一种用于检测蛋白质-DNA相互作用的方法 体内 是染色质免疫沉淀（ChIP）的一种替代方法 3使用相对较少的细胞量，且无需对蛋白质与DNA进行化学交联，也不需要高度特异性的抗体。当目标蛋白质与DNA松散或间接结合时，这一特性尤为重要。DamID已成功用于绘制多种蛋白质的结合位点，包括核膜蛋白 4-10染色质相关蛋白 11-13，染色质修饰酶 14转录因子和共调节因子15-18 和RNAi机制 19该方法适用于多种生物体，包括 S. cerevisiae 13, S. pombe 7, 秀丽隐杆线虫 9,17, D. melanogaster 5,11,18,20, A. thaliana 21,22 以及小鼠和人类细胞系 6,8,10,23,24.

DamID 检测技术的开发基于对缺乏内源性腺嘌呤甲基化的真核细胞中腺嘌呤甲基化DNA片段的特异性检测2。一种表达的融合蛋白，由目标DNA结合蛋白与大肠杆菌（E. coli）DNA腺嘌呤甲基转移酶（Dam）组成，可在基因组中蛋白结合位点附近的空间区域（最显著在1 kb以内，最多约5 kb范围内）对GATC序列中的腺嘌呤碱基进行甲基化2。这些被修饰的DNA片段可被特异性扩增，并杂交至微阵列，以检测目标蛋白的基因组结合位点1,25,26。原始的DamID方法受限于微阵列的可获得性以及预设探针的密度。因此，我们将高通量测序技术整合到DamID中10，并将该方法命名为DamID-seq。DamID-seq产生的大量短读长序列可实现全基因组范围内蛋白-DNA相互作用的精确定位。我们发现，在研究基因组与核纤层（NL）关联时，DamID-seq相较于微阵列DamID具有更高的分辨率和更宽的动态范围10。这一改进方法使得能够在基因结构内部探测NL关联10，并便于与其他高通量测序数据（如ChIP-seq和RNA-seq）进行比较。

本文所述的 DamID-seq 方案最初是为绘制基因组与核纤层（NL）关联图谱而开发的10。我们通过将小鼠或人源 Lamin B1 与大肠杆菌（E. coli）DNA 腺嘌呤甲基转移酶融合，构建了融合蛋白，并在 3T3 小鼠胚胎成纤维细胞、C2C12 小鼠成肌细胞10以及 IMR90 人胎儿肺成纤维细胞中测试了该方案（数据未发表）。本方案首先构建载体，然后通过慢病毒感染在哺乳动物细胞中表达与 Dam 融合的靶向蛋白24。随后，我们详细描述了扩增腺嘌呤甲基化 DNA 片段及构建测序文库的实验步骤，这些方法应可适用于其他生物体。

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方案

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1. 融合蛋白与游离 Dam 蛋白的生成与表达

  1. 将目的蛋白克隆至 DamID 载体中。
    1. 根据生产商说明书，使用高保真 DNA 聚合酶和相应引物扩增目的蛋白（POI）的 cDNA。通过实验确定最佳扩增条件，以确保插入片段正确扩增。
    2. 进行琼脂糖凝胶电泳，并根据生产商说明书使用凝胶回收试剂盒纯化扩增后的 POI cDNA。
    3. 根据生产商说明书，使用 BP Clonase II 将 POI 的 cDNA 克隆至 pDONR201 载体中。
    4. 根据生产商说明书，使用 LR Clonase II 将 POI 的 cDNA 从供体质粒克隆至 pLGW-RFC1-V5-EcoDam 载体或 pLGW-EcoDam-V5-RFC1 载体27，具体选择取决于将 POI 与大肠杆菌（E. coli）DNA 腺嘌呤甲基转移酶（EcoDam）N 端或 C 端融合的需要27。
    5. 通过测序验证克隆的 cDNA 序列正确，并与 EcoDam 形成正确的阅读框融合。
  2. 制备慢病毒原液。
    1. 使用慢病毒表达系统制备表达 Dam-V5-POI 和 V5-Dam（来自 pLGW-V5-EcoDam 载体27）的慢病毒原液。根据生产商说明书采用正向转染法。
      1. 根据转染说明书，使用 293T 细胞和脂质体转染法制备慢病毒原液。
      2. 包含使用 0.45 µm PVDF 滤膜的过滤步骤。
  3. 用慢病毒感染细胞。
    1. 感染前一天（第 0 天），将使用适当生长培养基培养的贴壁细胞以不含抗生素的相同培养基接种至 6 孔组织培养板中，使感染当天细胞汇合度达到约 50%。将细胞置于 37 °C 培养箱中培养。
    2. 感染当天（第 1 天），从 -80 °C 冰箱中取出两支 Dam-V5-POI 和两支 V5-Dam 慢病毒上清的冻存管，置于 37 °C 水浴中解冻。
      1. 吸除细胞培养基，更换为 0.5 ml 不含抗生素的新鲜培养基。
      2. 向每孔中加入 1 ml 解冻后的慢病毒（2 孔加入 V5-Dam，2 孔加入 Dam-V5-POI）。向剩余 2 孔中加入 1 ml 不含抗生素的培养基作为阴性对照。轻轻摇动 6 孔板混匀后，放回 37 °C 培养箱过夜（O/N）。
    3. 感染后第二天（第 2 天），吸除病毒悬液，更换为 2 ml 不含抗生素的培养基。将细胞放回 37 °C 培养箱继续培养 48 小时。
  4. 分离基因组 DNA（gDNA）。
    1. 吸除每孔中的培养基，加入 250 µl 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 使细胞脱落。37 °C 孵育 2 分钟。
    2. 用 1 ml 培养基冲洗细胞并吹打收集至 1.5 ml 微量离心管中。在室温下以 200 × g 离心 5 分钟收集细胞。
    3. 用 500 µl PBS 洗涤细胞沉淀，在室温下以 200 × g 离心 2 分钟。
    4. 将细胞沉淀重悬于 200 µl PBS 中。
    5. 根据生产商说明书使用血液与组织试剂盒提取 gDNA。用 200 µl 缓冲液 AE 洗脱 gDNA，并使用分光光度计测定 OD260 以确定浓度。
      注：可从未感染或模拟感染的细胞中提取 gDNA 作为阴性对照。为长期保存，可将 gDNA 沉淀至更高浓度。
      1. 加入 3 倍体积的 100% 乙醇和 0.1 倍体积的 3 M 醋酸钠（pH 5.5），上下颠倒离心管 4–6 次混匀。
      2. 在 -20 °C 过夜（O/N）放置。
      3. 在 4 °C 下以 16,000 × g 离心 15 分钟。
      4. 小心吸除上清。用 70%（体积/体积）乙醇洗涤沉淀，在 4 °C 下以 16,000 × g 离心 5 分钟。
      5. 小心吸除乙醇，室温下空气干燥沉淀 3 分钟。
      6. 将 gDNA 溶解于 T10E0.1 （pH 7.5）中，浓度约为 1 µg/µl。合并各实验样本或阴性对照的 gDNA 并测定浓度。储存于 -20 °C。

2. 扩增腺嘌呤甲基化的DNA片段

  1. 使用仅切割腺嘌呤甲基化 GATC 位点的 DpnI 酶消化基因组 DNA（gDNA）。
    1. 在冰上设置反应体系：加入 2.5 µg gDNA、1 µl 10x 缓冲液、0.5 µl DpnI（20 U/µl），用 H2O 补足至总体积 10 µl。每个 gDNA 样本准备三组反应——一组不加 DpnI（“无 DpnI”，用 0.5 µl H2O 替代 DpnI），两组加入 DpnI（“含 DpnI”）。
    2. 在 37 °C 过夜消化，随后在 80 °C 灭活 DpnI 酶 20 分钟。
  2. 连接 DamID 接头。
    1. 制备 DamID 接头。
      1. 将两种 DamID 接头寡核苷酸24分别用 H2O 溶解，终浓度为 100 µM。
      2. 取等体积的两种 DamID 接头寡核苷酸混合，置于密闭管中。用 Parafilm 封口后放入装有 90 °C 水的烧杯中（水位应低于管盖但高于寡核苷酸混合液面，以防进水）。
      3. 让水自然冷却至室温，使接头缓慢退火。
      4. 将退火后的接头分装为 50 µM 工作液，于 -20 °C 保存。
    2. 在冰上设置连接反应。向 2.1.2 中的每支试管加入 6.2 µl H2O、2 µl 10x 连接缓冲液、0.8 µl 50 µM DamID 接头（需在冰上解冻）和 1 µl T4 DNA 连接酶（5 U/µl），总体积为 20 µl。在两支“含 DpnI”试管中的一支，用 1 µl H2O 替代连接酶（“无连接酶”）。注意：每个 gDNA 样本包含两个阴性对照——“无 DpnI”和“无连接酶”。
    3. 在 16 °C 过夜连接，随后在 65 °C 灭活连接酶 10 分钟。
  3. 使用 DpnII 酶消化 DNA，以降解含有未甲基化 GATC 的片段。
    1. 在冰上设置反应体系。向 2.2.3 中的每支试管加入 24 µl H2O、5 µl 10x DpnII 缓冲液和 1 µl DpnII（10 U/µl），总体积为 50 µl。
    2. 在 37 °C 消化 2–3 小时，随后在 65 °C 灭活 DpnII 酶 20 分钟。
  4. 扩增腺嘌呤甲基化的 DNA 片段。
    1. 在冰上设置反应体系：取 2.3.2 中的 5 µl DpnII 消化产物，加入 5 µl 10x PCR 缓冲液、12.5 µl 5 µM DamID PCR 引物24、4 µl 10 mM dNTP 混合物、1 µl 50x 聚合酶混合物和 22.5 µl H2O，总体积为 50 µl。
    2. 运行 PCR 程序如下：68 °C 预热 10 分钟；94 °C 变性 1 分钟，65 °C 退火 5 分钟，68 °C 延伸 15 分钟；进行 4 个循环（94 °C 1 分钟，65 °C 1 分钟，68 °C 10 分钟）；再进行 17 个循环（94 °C 1 分钟，65 °C 1 分钟，68 °C 2 分钟）。
    3. 取每组反应的 5 µl PCR 产物在 1% 琼脂糖凝胶上电泳分析。PCR 产物应呈现 0.2 至 2 kb 范围内的弥散条带（图 2）。“无 DpnI”和“无连接酶”对照组应无扩增或扩增信号明显减弱。
    4. 若 2.4.3 步骤结果满意，则对实验样本重复 2.4.1–2.4.3 步骤，进行两到三个反应；每个阴性对照各进行一个反应。
    5. 使用 PCR 纯化试剂盒或固相可逆固定化（SPRI）磁珠，将同一实验样本的 PCR 产物合并并纯化（按制造商说明书操作）。“无 DpnI”和“无连接酶”对照组无需纯化。用缓冲液 EB 洗脱 DNA。
    6. 使用分光光度计测定纯化后 DNA 的 OD260 值以确定浓度，应达到约 0.1 µg/µl 或更高。每个样本至少收集 10 µg DNA。若使用 PCR 纯化试剂盒，每 50 µl PCR 产物使用一个纯化柱，洗脱体积为 30 µl 缓冲液 EB，随后合并洗脱液。
  5. 使用 DpnII 酶消化 DNA，防止 DamID PCR 引物被测序。
    1. 在冰上设置反应体系：取 2.4.6 中纯化的 5 µg DNA，加入 5 µl 10x DpnII 缓冲液、1 µl DpnII（10 U/µl），用 H2O 补足至总体积 50 µl。每个样本准备两到三个反应。
    2. 在 37 °C 消化 2–3 小时，随后在 65 °C 灭活 DpnII 酶 20 分钟。
    3. 将同一样本的消化产物合并，并使用 PCR 纯化试剂盒或 SPRI 磁珠按制造商说明书进行纯化。用缓冲液 EB 洗脱 DNA。
    4. 测定纯化后 DNA 的浓度，应达到约 0.06 µg/µl 或更高。每个样本至少收集 6 µg DNA。若使用 PCR 纯化试剂盒，每 50 µl 消化产物使用一个纯化柱，洗脱体积为 30 µl 缓冲液 EB，随后合并洗脱液。

3. 高通量测序文库的制备

  1. 片段化DNA
    1. 为每批新的双链DNA片段化酶确定适当的消化时间。由于酶活性可能随时间降低，在开展新实验前需重复该测试。为保留2.5.4步骤中的DNA用于实际片段化，此步骤可使用2.4.6中纯化的甲基化PCR产物或之前实验中多余的DNA。
      1. 配制含有6的主混合液 µg DNA，12 µl 10x Fragmentase 缓冲液并用 H2O至总体积114 µ1.
      2. 涡旋Fragmentase原液管3秒，加入6 µl 加入主混合液中，涡旋振荡主混合液 3 秒。总体积为 120 µl.
      3. 分装 20 µ将主混合液各 l 分装至 5 个新管中。将全部 6 个管在 37 ℃ 下孵育 °C，每次增加10分钟，持续5至55分钟。加入5 µl 用 0.5 M EDTA 终止反应。
      4. 分析 12.5 µl 消化（0.5 µ每个反应的g DNA以及0.5 µ在琼脂糖凝胶上未消化的 DNA图3）。确定最短时间（T0.2 kb) 需要消化大部分弥散条带至约 0.2 kb。在 5 分钟和 T 之间选择 6 个时间点0.2 kb （包括 5 分钟和 T0.2 kb）以相同的增量进行实际的片段化。
    2. 按照 3.1.1.1–3.1.1.3 所述设置实际的片段化反应。在 37 ℃ 下孵育反应体系 °C，持续时间由3.1.1.4节确定。
    3. 将6个反应合并，按照制造商的说明，使用PCR纯化试剂盒或SPRI磁珠纯化消化产物。用51 μL洗脱液洗脱DNA。 µl 缓冲液 EB。最终洗脱液约为 50 µ1.
  2. 修复片段化DNA的末端
    1. 在冰上设置一个反应，加入3.1.3步骤的洗脱液25 µl H2O, 10 µl 10x T4 DNA连接酶缓冲液（含10 mM ATP，4） µl 10 mM dNTP 混合物，5 µl T4 DNA聚合酶（3 U/µl), 1 µl Klenow DNA聚合酶（5 U/µl）和 5 µl T4 多核苷酸激酶。总体积为 100 µl. 用移液器充分混匀，避免产生泡沫和气泡。
    2. 在 20 ℃ 下孵育 °30 分钟，C
    3. 使用 PCR 纯化试剂盒或 SPRI 磁珠，按照制造商的说明书纯化 DNA。用 33 μL 洗脱液洗脱 DNA。 µl 缓冲液 EB。最终洗脱液约为 32 µ1.
  3. 添加 "A" 突出端
    1. 在冰上设置一个反应，加入3.2.3步骤洗脱的产物，5 µl 10x Klenow缓冲液，10 µ1 mM dNTP，以及3 µl Klenow (3'→5' 外切酶-)（5 U/µl). 总体积为 50 µl. 用移液器充分混匀。避免产生泡沫和气泡。
    2. 37℃孵育 °30 分钟，37°C
    3. 使用 PCR 纯化试剂盒或 SPRI 磁珠，按照制造商提供的方案纯化 DNA。用 22 μL 洗脱液洗脱 DNA。 µl 缓冲液 EB。最终洗脱液约为 21 µ1.
  4. 连接测序接头
    1. 制备测序接头 28.
      1. 将每种接头引物重悬至100 μM的浓度 µ在 10 mM Tris-Cl (pH 7.8)、0.1 mM EDTA (pH 8.0) 和 50 mM NaCl 中的 M
      2. 混合等体积的通用接头 28 以及带索引的接头 28.
      3. 在热循环仪中按照以下程序退火接头：95 °C，2 分钟；140 个循环，每个循环 30 秒，起始温度 95 °C，并以0.5递减 °每个循环的 C；保持在 4 °C.
      4. 分装接头并置于 -20 ℃ 保存 °C.
    2. 在冰上设置反应体系，加入3.3.3步骤洗脱液25 µl 2x 连接缓冲液, 1.5 µ50 µM 退火测序接头（来自 3.4.1.4 和 2.5，冰上解冻） µl T4 DNA连接酶。用移液器充分混匀，避免产生泡沫和气泡。若需进行多重测序，则每个样本使用不同的带索引接头。
    3. 室温孵育1小时。
    4. 使用 PCR 纯化试剂盒或 SPRI 磁珠，按照制造商的说明书纯化 DNA。用 24 μL 洗脱液洗脱 DNA。 µl 缓冲液 EB。最终洗脱液体积约为 23 µl.
  5. 将Y形接头转化为双链DNA，以准确测定DNA片段大小 28
    1. 在冰上设置一个反应，加入3.4.4步骤洗脱液12.5 µl H2O, 1 µ25 µM 引物 1 28, 1 µ25 µM 引物 2 28, 1.5 µl 10 mM dNTP，10 µl 5x PCR 缓冲液和 1 µl DNA聚合酶（1 U/µl)。
    2. 按如下条件进行PCR扩增：95 °C，3 分钟；5 个循环的 98 °63℃，15 秒，C °℃，30 秒，72 °C，30 秒；72 °C，1 分钟；4 °C 暂停。
    3. 使用 PCR 纯化试剂盒或 SPRI 磁珠，按照制造商的说明书纯化 DNA。用 11 μL 洗脱液洗脱 DNA。 µl 缓冲液 EB。最终洗脱液体积约为 10 µl.
  6. 对文库进行片段大小筛选
    1. 制备含1x TAE缓冲液的2%琼脂糖凝胶。加入溴化乙锭（注意！)至终浓度为500 ng/ml，待熔化的TAE-琼脂糖溶液冷却后加入，以避免吸入溴化乙锭。确保凝胶中留有足够的泳道用于所有样品、DNA ladders及空白泳道。
    2. 加入 8 µl 6x 上样染料至 3.5.3 步骤所得洗脱液中
    3. 通过混合1 kb plus DNA ladder（1.0）制备DNA标记物 µ克µl），6×上样染料和H2O 按 1:1:4 的比例混合。
    4. 加载 6 µl DNA 标记，来自 3.6.2 的样品及其他 6 个样品 µl DNA 标记物，每个标记物单独点样于不同的泳道，且与相邻样品/标记物之间至少留出一个空泳道。
    5. 以120 V电压电泳60分钟。
    6. 在紫外透射仪上观察凝胶（尽量缩短暴露于紫外光的时间）。佩戴安全眼镜和面部防护罩。确保至少有一条DNA分子量标记物的条带在300 bp至400 bp区间内具有适当的间距（足以切下3块凝胶条带）。间距过窄会增加切取多条凝胶条带的难度，而间距过宽则会增加切取凝胶的体积。
    7. 每个泳道使用新的手术刀或剃须刀片。从每个泳道中切取三个位于300至400 bp之间的薄胶片。图 4）并分别放入微量离心管中。每块凝胶的体积应尽可能小（< 100 µl)
    8. 测量每块凝胶切片的体积（1 µl 凝胶重约 1 mg）中加入 6 倍体积的 QG 缓冲液，于 50 ℃ 孵育 °C.
    9. 每2-3分钟涡旋振荡QG凝胶混合物，直至凝胶完全溶解。加入两倍凝胶体积的异丙醇，混匀。
    10. 从这一步开始，按照凝胶回收试剂盒的说明书进行操作。用51 μL洗脱液洗脱DNA。 µl 缓冲液 EB。最终洗脱液体积约为 50 µ1.
  7. 富集测序接头修饰的DNA片段
    1. 优化PCR循环次数 29.
      1. 在冰上设置一个反应，包含1 µ来自 3.6.10 的洗脱液，1 µ25 µM 引物 1 28, 1 µl 25 µM 引物 2 28, 7 µl H2O 和 10 µl SYBR Green Supermix。总体积为20 µ1.
      2. 按照以下程序运行 qPCR：95 °C，持续3分钟；20个循环：95 °30秒，63℃ °30 秒，72 ℃ °30 秒，读板。
      3. 使用 qPCR 分析软件分析数据，并根据制造商的说明书确定每个样本的定量循环数（Cq）或阈值循环数（Ct）。继续处理 Cq/Ct ≤ 14 的样本。采用最大 Cq（Cq0）减 1（向上取整至下一个更高的整数）作为最终的 PCR 循环数（NPCR).
      4. 调整DNA模板的用量，使不同样本在经历相同PCR循环次数后扩增出大致相等的产物量。使用8 µCq 值最高（Cq0），并使用以下公式计算其他样品的模板体积：
        卷i = 8 × 1.8Cqi-Cq0
    2. 在冰上配制PCR反应体系，模板体积根据3.7.1.4节计算确定：1 µl 25 µM 引物 1 28, 1 µ25 l µM 引物 2 28, 1.5 µl 10 mM dNTP，10 µl 5x 缓冲液，1 µl DNA聚合酶（1 U/µl）并用 H 充满2O，总体积为50 µl.
    3. 按照如下条件进行PCR反应：95 °C，45 秒；NPCR 循环数（由 3.7.1.3 确定）为 98 °C，15 秒，63 °C，30 秒，72 °30 秒 72℃ °C，1 分钟；4 °C 暂停。
    4. 分析 5 µl 在2%琼脂糖凝胶中电泳PCR产物（图 5A）。一个清晰的 "单个" 条带表明扩增的DNA片段长度范围较窄，DNA文库可进行后续分析。
    5. 对选定的样本重复一次反应，并合并来自同一样本的扩增DNA文库。
    6. 纯化用于测序的选定DNA文库。
      1. 如果在 3.7.4 中未观察到引物/接头二聚体，根据制造商说明书，使用 PCR 纯化试剂盒或 SPRI 磁珠纯化 DNA 文库。用 21 μL 洗脱液洗脱 DNA µl 缓冲液 EB。最终洗脱液约为 20 µl. 如果用户的测序机构对洗脱缓冲液、最终体积有特定要求， 等等。，相应地准备样品。
      2. 如果在 3.7.4 中明显可见引物/接头二聚体，则按如下方法纯化文库。
        1. 将3.7.5中的DNA和DNA Ladder加入2%预制琼脂糖凝胶中。样品可根据3.7.6.1所述进行纯化以减少体积，或可上样至多个加样孔中。将琼脂糖凝胶置于合适的电泳系统中，电泳运行15分钟。
        2. 使用合适的透射仪，用洁净的手术刀/剃刀切下每个样品的目标条带，并将凝胶切片置于1.5 ml微量离心管中。
        3. 使用凝胶回收试剂盒提取 DNA，按照制造商提供的方案进行，但需进行以下两项修改：将缓冲液 QG 与凝胶的混合物在 37 °C 的恒温混合仪中孵育 °4 °C、1,000 rpm 离心 30 分钟，加入 2 倍胶体积的异丙醇。
  8. 将纯化的DNA文库提交至测序机构。 遵循所有机构的规定。
    注意：使用 Bioanalyzer 进行质量分析（图 5B在测序之前应进行DNA文库的精确大小范围和浓度测定。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

通过免疫荧光染色验证，Dam-V5-LmnB1 融合蛋白与内源性 Lamin B 蛋白共定位（图 1）。

腺嘌呤甲基化DNA片段的PCR扩增成功是DamID-seq实验的关键步骤。实验样本应扩增出大小为0.2–2 kb的弥散条带，而阴性对照（未加DpnI、未加连接酶或未加PCR模板）应无扩增或扩增信号明显减弱（图2）。

甲基化的DNA片段大小范围为0.2至2 kb，而下一代测序（NGS）文库所需的插入片段大小为200至300 bp。因此，必须将甲基化PCR产物打断至合适的片段大小范围内。然而，研究发现，在单一的打断时间内，同时将较大的DNA片段断裂至合适大小，并保持大多数较小DNA片段完整，是不切实际的。因此，通过时间进程实验确定将1 µg DNA打断至主带集中在2...

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讨论

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在进行 DamID-seq 实验之前，应检测 Dam 标签蛋白是否保留了内源蛋白的功能。应始终确定 Dam 标签核膜蛋白的亚细胞定位，并将其与内源蛋白的定位进行比较。在研究转录因子时，建议检测 Dam 融合蛋白是否能够恢复内源蛋白在调控基因表达方面的功能。该功能检测可在内源 DNA 结合蛋白敲除突变体可获得的生物体中进行。由于基因组编辑技术的进步，现已有可能敲除任何感兴趣的内源基因，因此 Dam 标签 DNA 结合蛋白的功能也可在培养的哺乳动物细胞中进行检测。

本方案的关键步骤是将 DpnII 消化的 DamID PCR 产物成功片段化至约 200 bp。该步骤旨在将扩增的腺嘌呤甲基化片段调整为适合测序的狭窄大小范围，并使测序文库中 DNA 片段的起始核苷酸实现随机化。若片段化效率低下，大部分 DNA 片段将起始于 GATC（来自第二次 DpnII 消化的 5' 突出端），从而导致 Illumina 测序性能显著下降、产量降低，甚至测序失败。也可采用其他 DNA 片段化方法作为替代方案。

DNA腺嘌呤甲基转移酶鉴定技术（Dam...

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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感谢 Bas van Steensel 博士提供了 DamID 哺乳动物表达载体。感谢耶鲁基因组学分析中心和耶鲁干细胞中心基因组学核心在构建下一代测序文库及实施高通量 DNA 测序方面的指导。本研究得到了耶鲁医学院启动资金、美国心脏协会科学家发展奖（12SDG11630031）以及康涅狄格创新公司种子基金（13-SCA-YALE-15）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
ViraPower 慢病毒表达系统Life TechnologiesK4950-00、K4960-00、K4970-00、K4975-00、K4980-00、K4985-00、K4990-00、K367-20、K370-20 和 K371-20
Gateway BP Clonase II 酶混合液Life Technologies11789-020
Gateway LR Clonase II 酶混合物Life Technologies11791-020
DNeasy 血液 & 组织试剂盒 (250)QIAGEN69506 或 69504  
Gateway pDONR 201Life Technologies11798-014
293T细胞美国典型培养物保藏中心CRL-11268
胰蛋白酶-EDTA（0.05%），酚红Life Technologies25300-054
DMEM，高糖，丙酮酸Life Technologies11995-065
胎牛血清SigmaF4135
Tris品牌不限
EDTA品牌不限
200 Proof EtOH品牌不限
异丙醇品牌不限
乙酸钠品牌不限
DpnI新英格兰生物实验室R0176缓冲液供应
DamID接头 "AdRt" 和 "AdRb"Integrated DNA Technologies参见参考文献24中的序列；5'或3'末端未进行磷酸化，以防止自连。
T4 DNA连接酶罗氏生命科学10481220001缓冲液供应
DpnIINew England BiolabsR0543缓冲液供应
DamID PCR 引物 "AdR_PCR"Integrated DNA Technologies参考文献24中提供的序列
脱氧核苷酸（dNTP）溶液套装New England BiolabsN0446100 mM 的 dATP、dCTP、dGTP 和 dTTP 各一种
优势2  聚合酶混合液Clontech639201缓冲液供应
1Kb Plus DNA LadderLife Technologies107870181.0 µ克/µl
QIAquick PCR 纯化试剂盒QIAGEN28104 或 28106
MinElute PCR 纯化试剂盒QIAGEN28004 或 28006洗脱体积小于30 µl
SPRI 磁珠 / Agencourt AMPure XP贝克曼库尔特A63880如果少于40，需增加混匀时间和洗脱时间 µ使用洗脱缓冲液
缓冲液 EBQIAGEN19086
NEBNext dsDNA 片段化酶New England BiolabsM0348缓冲液供应
T4 DNA连接酶反应缓冲液New England BiolabsB0202
T4 DNA聚合酶New England BiolabsM0203
DNA聚合酶I大（Klenow）片段New England BiolabsM0210
T4 多核苷酸激酶New England BiolabsM0201
Klenow片段（3′’ → 5’ 外泌体（exo-）New England BiolabsM0212缓冲液供应
测序接头Integrated DNA Technologies参考文献28中提供的序列
快速连接试剂盒New England BiolabsM2200在3.4.3中使用；随Quick Ligation反应缓冲液和Quick T4 DNA连接酶提供
测序引物1和2Integrated DNA Technologies参考文献28中提供的序列
KAPA HiFi PCR 试剂盒Kapa BiosystemsKK2101 或 KK2102KAPA HiFi DNA 聚合酶、5× KAPA HiFi 高保真缓冲液和 10 mM dNTP 混合物
琼脂糖Sigma AldrichA4679
溴化乙锭Sigma AldrichE1510-10ML10 mg/ml
QIAquick 凝胶回收试剂盒QIAGEN28704 或 28706
iTaq Universal SYBR Green Supermix伯乐生命科学公司1725121 或 1725122
分光光度计品牌不限
0.45 μm PVDF 滤膜品牌不限
25 ml 注射器品牌不限
10 cm 组织培养板品牌不限
6孔组织培养板品牌不限
S1000型热循环仪伯乐生命科学公司
C1000 Touch 梯度PCR仪伯乐生命医学产品（上海）有限公司用于 qPCR
涡旋混合器品牌不限
干浴器或恒温混匀仪品牌不限
微型离心机品牌不限
带有电源的凝胶电泳系统品牌不限
磁力架用于SPRI磁珠纯化DNA；应能容纳1.5–2 ml离心管；品牌不限
紫外透射仪品牌不限
E-gel 电泳系统Life TechnologiesG6400，G6500，G6512ST

参考文献

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