方法文章

DamID-seq：通过高通量测序腺嘌呤甲基化DNA片段实现全基因组蛋白质-DNA相互作用作图

18.1K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/53620

⸱

2016年1月27日

 ,  , 
1Department of Cell Biology, Yale University School of Medicine

本文内容

摘要

本文介绍了一种将DNA腺嘌呤甲基转移酶鉴定技术（DamID）与高通量测序相结合的检测方法（DamID-seq）。该改进方法具有更高的分辨率和更宽的动态范围，可实现DamID-seq数据与其他高通量测序数据（如ChIP-seq、RNA-seq）的联合分析。 等等。

摘要

DNA腺嘌呤甲基转移酶鉴定（DamID）检测是一种强大的方法，可用于在局部及全基因组范围内检测蛋白质-DNA相互作用，是染色质免疫沉淀（ChIP）的一种替代方案。通过表达一种融合蛋白，该蛋白由目标蛋白与大肠杆菌（E. coli）DNA腺嘌呤甲基转移酶组成，可在蛋白质-DNA相互作用位点附近的GATC序列中对腺嘌呤碱基进行甲基化。随后可特异性扩增并检测腺嘌呤甲基化的DNA片段。传统的DamID检测通过将甲基化DNA片段与DNA微阵列杂交来确定其在基因组中的位置，但该方法受限于微阵列的可获得性以及预设探针的密度。本文中，我们报道了将高通量DNA测序技术整合到DamID中的详细实验方案（DamID-seq）。DamID-seq产生的大量短读长序列，使得全基因组范围内蛋白质-DNA相互作用的检测与定位具有高精度和高灵敏度。我们已应用DamID-seq检测哺乳动物细胞中基因组与核纤层（NL）之间的相互作用，并发现DamID-seq在检测基因组-NL相互作用时具有高分辨率和宽动态范围。DamID-seq方法能够探测基因结构内的NL关联，并支持将基因组-NL相互作用图谱与其他功能基因组数据（如ChIP-seq和RNA-seq）进行比较分析。

引言

DNA腺嘌呤甲基转移酶鉴定（DamID） 1,2 是一种用于检测蛋白质-DNA相互作用的方法 体内 是染色质免疫沉淀（ChIP）的一种替代方法 3使用相对较少的细胞量，且无需对蛋白质与DNA进行化学交联，也不需要高度特异性的抗体。当目标蛋白质与DNA松散或间接结合时，这一特性尤为重要。DamID已成功用于绘制多种蛋白质的结合位点，包括核膜蛋白 4-10染色质相关蛋白 11-13，染色质修饰酶 14转录因子和共调节因子15-18 和RNAi机制 19该方法适用于多种生物体，包括 S. cerevisiae 13, S. pombe 7, 秀丽隐杆线虫 9,17, D. melanogaster 5,11,18,20, A. thaliana 21,22 以及小鼠和人类细胞系 6,8,10,23,24.

DamID 检测技术的开发基于对缺乏内源性腺嘌呤甲基化的真核细胞中腺嘌呤甲基化DNA片段的特异性检测2。一种表达的融合蛋白，由目标DNA结合蛋白与大肠杆菌（E. ....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

1. 融合蛋白与游离 Dam 蛋白的生成与表达

  1. 将目的蛋白克隆至 DamID 载体中。
    1. 根据生产商说明书，使用高保真 DNA 聚合酶和相应引物扩增目的蛋白（POI）的 cDNA。通过实验确定最佳扩增条件，以确保插入片段正确扩增。
    2. 进行琼脂糖凝胶电泳，并根据生产商说明书使用凝胶回收试剂盒纯化扩增后的 POI cDNA。
    3. 根据生产商说明书，使用 BP Clonase II 将 POI 的 cDNA 克隆至 pDONR201 载体中。
    4. 根据生产商说明书，使用 LR Clonase II 将 POI 的 cDNA 从供体质粒克隆至 pLGW-RFC1-V5-EcoDam 载体或 pLGW-EcoDam-V5-RFC1 载体27，具体选择取决于将 POI 与大肠杆菌（E. coli）DNA 腺嘌呤甲基转移酶（EcoDam）N 端或 C 端融合的需要27。
    5. 通过测序验证克隆的 cDNA 序列正确，并与 EcoDam 形成正确的阅读框融合。
  2. 制备慢病毒原液。
    1. 使用慢病毒表达系统制备表达 Dam-V5-POI 和 V5-Dam（来自 pLGW-V5-EcoDam 载体27）的慢病毒原液。根据生....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

通过免疫荧光染色验证，Dam-V5-LmnB1 融合蛋白与内源性 Lamin B 蛋白共定位（图 1）。

腺嘌呤甲基化DNA片段的PCR扩增成功是DamID-seq实验的关键步骤。实验样本应扩增出大小为0.2–2 kb的弥散条带，而阴性对照（未加DpnI、未加连接酶或未加PCR模板）应无扩增或扩增信号明显减弱（图2）。

甲基化的DNA片段大小范围为0.2至2 kb，而下一代测序（NGS）文库所需的插入片段大小为200至300 bp。因此，必须将甲基化PCR产物打断至合适的片段大小范围内。然而，研究发现，在单一的打断时间内，同时将较大的DNA片段断裂至合适大小，并保持大多数较小DNA片段完整，是不切实际的。因此，通过时间进程实验确定将1 µg DNA打断至主带集中在2.......

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

在进行 DamID-seq 实验之前，应检测 Dam 标签蛋白是否保留了内源蛋白的功能。应始终确定 Dam 标签核膜蛋白的亚细胞定位，并将其与内源蛋白的定位进行比较。在研究转录因子时，建议检测 Dam 融合蛋白是否能够恢复内源蛋白在调控基因表达方面的功能。该功能检测可在内源 DNA 结合蛋白敲除突变体可获得的生物体中进行。由于基因组编辑技术的进步，现已有可能敲除任何感兴趣的内源基因，因此 Dam 标签 DNA 结合蛋白的功能也可在培养的哺乳动物细胞中进行检测。

本方案的关键步骤是将 DpnII 消化的 DamID PCR 产物成功片段化至约 200 bp。该步骤旨在将扩增的腺嘌呤甲基化片段调整为适合测序的狭窄大小范围，并使测序文库中 DNA 片段的起始核苷酸实现随机化。若片段化效率低下，大部分 DNA 片段将起始于 GATC（来自第二次 DpnII 消化的 5' 突出端），从而导致 Illumina 测序性能显著下降、产量降低，甚至测序失败。也可采用其他 DNA 片段化方法作为替代方案。

DNA腺嘌呤甲基转移酶鉴定技术（Dam.......

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢 Bas van Steensel 博士提供了 DamID 哺乳动物表达载体。感谢耶鲁基因组学分析中心和耶鲁干细胞中心基因组学核心在构建下一代测序文库及实施高通量 DNA 测序方面的指导。本研究得到了耶鲁医学院启动资金、美国心脏协会科学家发展奖（12SDG11630031）以及康涅狄格创新公司种子基金（13-SCA-YALE-15）的支持。

....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
ViraPower 慢病毒表达系统Life TechnologiesK4950-00、K4960-00、K4970-00、K4975-00、K4980-00、K4985-00、K4990-00、K367-20、K370-20 和 K371-20
Gateway BP Clonase II 酶混合液Life Technologies11789-020
Gateway LR Clonase II 酶混合物Life Technologies11791-020
DNeasy 血液 & 组织试剂盒 (250)QIAGEN69506 或 69504  
Gateway pDONR 201Life Technologies11798-014
293T细胞美国典型培养物保藏中心CRL-11268
胰蛋白酶-EDTA（0.05%），酚红Life Technologies25300-054
DMEM，高糖，丙酮酸Life Technologies11995-065
胎牛血清SigmaF4135
Tris品牌不限
EDTA品牌不限
200 Proof EtOH品牌不限
异丙醇品牌不限
乙酸钠品牌不限
DpnI新英格兰生物实验室R0176缓冲液供应
DamID接头 "AdRt" 和 "AdRb"Integrated DNA Technologies参见参考文献24中的序列；5'或3'末端未进行磷酸化，以防止自连。
T4 DNA连接酶罗氏生命科学10481220001缓冲液供应
DpnIINew England BiolabsR0543缓冲液供应
DamID PCR 引物 "AdR_PCR"Integrated DNA Technologies参考文献24中提供的序列
脱氧核苷酸（dNTP）溶液套装New England BiolabsN0446100 mM 的 dATP、dCTP、dGTP 和 dTTP 各一种
优势2  聚合酶混合液Clontech639201缓冲液供应
1Kb Plus DNA LadderLife Technologies107870181.0 µ克/µl
QIAquick PCR 纯化试剂盒QIAGEN28104 或 28106
MinElute PCR 纯化试剂盒QIAGEN28004 或 28006洗脱体积小于30 µl
SPRI 磁珠 / Agencourt AMPure XP贝克曼库尔特A63880如果少于40，需增加混匀时间和洗脱时间 µ使用洗脱缓冲液
缓冲液 EBQIAGEN19086
NEBNext dsDNA 片段化酶New England BiolabsM0348缓冲液供应
T4 DNA连接酶反应缓冲液New England BiolabsB0202
T4 DNA聚合酶New England BiolabsM0203
DNA聚合酶I大（Klenow）片段New England BiolabsM0210
T4 多核苷酸激酶New England BiolabsM0201
Klenow片段（3′’ → 5’ 外泌体（exo-）New England BiolabsM0212缓冲液供应
测序接头Integrated DNA Technologies参考文献28中提供的序列
快速连接试剂盒New England BiolabsM2200在3.4.3中使用；随Quick Ligation反应缓冲液和Quick T4 DNA连接酶提供
测序引物1和2Integrated DNA Technologies参考文献28中提供的序列
KAPA HiFi PCR 试剂盒Kapa BiosystemsKK2101 或 KK2102KAPA HiFi DNA 聚合酶、5× KAPA HiFi 高保真缓冲液和 10 mM dNTP 混合物
琼脂糖Sigma AldrichA4679
溴化乙锭Sigma AldrichE1510-10ML10 mg/ml
QIAquick 凝胶回收试剂盒QIAGEN28704 或 28706
iTaq Universal SYBR Green Supermix伯乐生命科学公司1725121 或 1725122
分光光度计品牌不限
0.45 μm PVDF 滤膜品牌不限
25 ml 注射器品牌不限
10 cm 组织培养板品牌不限
6孔组织培养板品牌不限
S1000型热循环仪伯乐生命科学公司
C1000 Touch 梯度PCR仪伯乐生命医学产品（上海）有限公司用于 qPCR
涡旋混合器品牌不限
干浴器或恒温混匀仪品牌不限
微型离心机品牌不限
带有电源的凝胶电泳系统品牌不限
磁力架用于SPRI磁珠纯化DNA；应能容纳1.5–2 ml离心管；品牌不限
紫外透射仪品牌不限
E-gel 电泳系统Life TechnologiesG6400，G6500，G6512ST

参考文献

  1. van Steensel, B., Delrow, J., Henikoff, S. Chromatin profiling using targeted DNA adenine methyltransferase. Nat Genet. 27, 304-308 (2001).
  2. van Steensel, B., Henikoff, S. Identification of in vivo DNA targets of chromatin proteins using tethered dam methyltr....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

DNA

相关文章