利用数字图像相关技术表征血管组织样本上的局部应变

摘要

我们描述了使用数字图像相关技术来表征经受单轴拉伸试验的血管组织样本表面局部应变场的方法。这些测量有助于精确量化样本的力学响应，并建立本构应力-应变关系。

摘要

生物组织及工程化软组织力学行为的表征是基础生物医学研究和产品开发中的核心环节。通常通过力学测试数据获得应力-应变关系，以实现样本间的比较评估，并在某些情况下识别其本构力学特性。然而，若采用平均应变测量方法，可能会引入误差，因为样本几何形状的不均匀性以及测试系统中软组织安装/夹持所引起的应力集中，可能导致应变场存在显著的非均质性。当应变场非均质性显著时，准确评估样品的力学响应需要测量局部应变。本研究展示了一种新型生物力学测试方案，该方案结合力学测试装置、高分辨率相机和数字图像相关技术，用于计算局部表面应变。通过获取并分析一系列样品表面图像，量化血管组织试样在阶梯式单轴加载下的局部表面应变。该方法可提高血管生物力学实验的准确性，并在其他天然软组织、工程化软组织以及软水凝胶/聚合物材料中具有广泛的应用潜力。在视频中，我们演示了如何搭建系统组件，并对天然血管组织进行一次完整的实验操作。

引言

五十多年来，大量研究致力于量化血管组织的力学特性。这些研究有助于我们更好地理解血管的生理与病理行为，为评估血管内器械的有效性/相容性提供依据，并推动工程化血管结构的设计与构建^1-6。由于大多数组织具有力学上的异质性、各向异性和非线性特征，因此对软组织力学响应的精确测量及其力学特性的本构建模本质上具有挑战性。此外，在力学测试过程中，试样与夹具界面处引入的局部复杂性（例如，弯曲、摩擦、应力集中、撕裂）以及组织从活体动物中切除后力学性质不可避免的改变，常常使实验测量结果受到干扰。

单轴拉伸实验是对由固体材料制成的试样可进行的最简单的力学测试之一，常用于评估血管组织的力学响应。这些实验的结果可为天然和工程化组织来源提供有用的初步信息，并可用于比较特定治疗、疾病状态或药理化合物对血管壁力学行为的影响^7-11。

软组织的单轴力学测试通常在几何形状相对均匀的样品上进行，这些样品最常见为狗骨形或环形^7,8,12-14。然而，由于组织解剖、分离以及在测试系统中夹持时存在技术挑战，样品的实际几何形状可能显著偏离理想形态。当样品在单轴拉伸条件下受力时，任何几何上的不均匀性最终都会导致应力和应变场的非均质分布，其非均质程度取决于样品的实际形状、样品尺寸（相对于夹具）以及材料的力学特性^9,15,16。当场分布的非均质性显著时，基于夹具相对位置计算的样品应变是不准确的，因此不足以作为评估材料力学行为的依据。

视频分析系统已广泛用于软组织的应变测量，通常通过在样本表面施加高对比度染料标记来实现^17,18。数字图像相关法是一种光学计量技术，通过比较样本表面在变形前后灰度强度值的变化，测量全场表面应变，该技术已与软组织的视频分析结合使用^19-21。与可用于测量的干涉测量方法相比，数字图像相关法具有多项优势。首先，作为一种非接触式测量技术，它最大限度地减少了测量系统对样本的影响所导致的材料特性改变所带来的干扰效应。其次，该方法对测量环境的要求远低于其他方法，且具有更宽的灵敏度和分辨率范围。第三，由于具备获取全场视图的能力，该技术可同时表征平均和局部的力学响应。关于该方法的详细说明，建议读者参考Sutton所著的书籍²²。

为了获取试样表面的应变场，可采用二维数字图像相关技术（2D-DIC）。简而言之，需采集试样在未加载及不同加载状态下的图像。第一幅图像被划分为若干称为子区（M×M像素）的小方块，这些子区构成用于后续计算二维应变场的网格。通过图像匹配算法确定每个子区在变形后试样中的位置。随后逐帧追踪每个子区的运动，从而获得位移场，并进一步通过多种方法（如多项式拟合或有限元插值）推导出变形梯度和应变。在本文中，我们详细介绍了一种结合单轴拉伸试验与2D-DIC技术评估天然血管组织表面应变场的详细方法学。

方案

注意：以下所述操作步骤是根据南卡罗来纳州哥伦比亚市南卡罗来纳大学机构动物照护与使用委员会批准的方案进行的。

1. 组织获取与解剖

1. 在组织解剖前对所有手术器械进行灭菌。将手术剪、标准精细镊子以及手术刀片在15 psi压力和121 °C温度下高压灭菌15分钟。
2. 从当地屠宰场获取一组新鲜的猪肾（7月龄长白雄性猪，60–70 kg），保留完整的主动脉。将组织置于冰浴的1%磷酸盐缓冲液（PBS）溶液中运回实验室。
3. 到达后立即使用手术剪和镊子剥离腹主动脉周围的组织。
4. 使用装有PBS（pH 7.2）的50 ml注射器冲洗血管三次。用手术剪和镊子尽可能去除血管周围组织，同时确保样本完整性不受破坏。
5. 将锋利的剃刀刀片垂直置于血管中段，确保刀片与血管长轴垂直。用剃刀连续进行三次环向切割，制备两个宽度约为20 mm的环状样本。
6. 将锋利的剃刀刀片垂直置于其中一个环状样本上，使刀片沿径向方向定位。施加锐力进行径向切割，获得用于单轴力学测试的条状样本。将样本放入100 mm玻璃培养皿中，并浸没于PBS中，直至进行表面散斑处理。对第二个环状样本重复此操作。

2. 表面散斑图案的制备

1. 将喷笔连接到压力阀。
2. 调节喷笔的喷嘴直径，以产生直径为 60–100 µm 的斑点（喷嘴直径的合适范围应通过预实验确定）。
3. 将约 2 ml 的黑色组织标记染料倒入喷笔的重力式供料器中。
4. 将喷笔放置在距离样品约 0.5 m 的位置。
5. 从培养皿中取出样品。在 100 psi 的喷涂压力下，对样品内膜表面喷涂组织标记染料约 5 秒。重复三次，以确保斑点图案均匀覆盖样品表面。

3. 实验操作

1. 使用组织粘合剂将样品的两端分别固定在塑料条（1 cm 宽 × 1 cm 长 × 0.5 cm 厚）上。将样品置于组织切片板上，调整位置使其平整摊开，然后使用数字卡尺测量其尺寸。
2. 启动机械测试系统控制。在系统控制主屏幕上，选择 "波形" 位于任务栏上的 "设置" 表。
3. 将力学试验机上夹具的位置调节至-4 mm（相对于系统中指定的初始位置伸出4 mm）。将一条塑料条（见3.1中已连接至样品）轻轻固定于力学试验机的上夹具中，使样品自然下垂。使用数显卡尺测量，确保样品与上夹具之间的距离小于2 mm。
4. 手动调整下夹具的位置，使试样的自由端可在无拉伸状态下被固定。将试样自由端连接的塑料条轻轻固定到力学试验机的下夹具中。
   1. 使用数显卡尺确保样品与下夹具之间的距离小于2 mm。将系统载荷传感器归零。测量样品的长度，并将其作为计算整体周向应变的参考长度。
5. 输入机械测试程序。本演示中使用的程序包括4个单轴位移循环，每个循环以0.01 mm/sec的位移速率将样品长度拉伸18%。
6. 在剩余的检测流程中，间歇性地向样本喷洒 PBS，以确保其保持湿润。
7. 将相机（500万像素相机，100 mm镜头，像素尺寸为3.49 µm）安装在距离加载框架1.5 m的三脚架上。通过将相机设置为最小可用景深，并调整其对准位置，使整个视场清晰对焦，以确保相机与样品表面垂直。
8. 打开图像采集软件。
9. 选择 "PGR-2" 在选项中 "选择系统".
10. 选择用于保存待分析图像的项目路径。
11. 点击 "时代广场" 图标，并将采集间隔设置为 5 秒。
12. 调节镜头的曝光、数值孔径和焦距，以获得样品的清晰图像。
13. 调整LED的位置，为样品提供充足的照明。
14. 点击 "开始" 在图像采集软件中点击图标以获取样本表面的图像。
15. 打开图像分析软件。
16. 导入获取的图像。放大单个斑点，然后计算该单个斑点内的像素数量。
    注意：识别一个具有代表性的黑色斑点。将斑点尺寸定义为斑点两侧具有相似高灰度值的像素之间的线性距离。对于可接受的斑点尺寸，典型斑点宽度方向上的像素数应大于3个像素。为了提高测量的空间分辨率，在条件允许的情况下，大多数斑点的宽度方向上的像素数不应超过5至7个像素。因此，本案例中典型斑点的线性尺寸范围最小约为10 μm，最大约为23 μm。为确定合适的子区尺寸，一个典型的子区在其宽度方向上应至少包含3个白色斑点和3个黑色斑点。若典型斑点的线性尺寸为5个像素，则每个31×31的子区其线性尺寸至少为105 μm。子区中心之间的间距应至少为子区线性尺寸的1/6。因此，对于31×31的子区尺寸，该间距为5个像素，对应线性距离为18 μm。
17. 在确认散斑图案质量后，同时点击 "运行" 系统中的图标 "开始" 在图像采集软件中点击图标以开始测试。
18. 使用相机和图像采集软件在测试过程中连续拍摄一系列图像。

4. 实验后的清理程序

1. 将废弃样品放入生物危害袋中并封好袋口，联系南卡罗来纳大学环境健康与安全部门（EHS）进行妥善处理。
2. 用去磷酸盐消毒液按1:64的比例将消毒清洁剂与蒸馏水混合，将手术器械浸入该溶液中浸泡20分钟。
3. 用蒸馏水彻底冲洗步骤4.2中所述物品，用纸巾擦干器械后喷洒70%乙醇溶液，再次用纸巾将手术器械擦干，并放回手术工具箱中。

5. 图像分析以测量局部应变场

1. 打开图像分析软件。
2. 点击 "Speckle images" 选项卡，选择所有需要分析的图像。
3. 点击矩形工具，并在第一幅图像中选择感兴趣区域。
4. 输入子区尺寸为 41×41 像素，步长为 5 像素。
5. 点击软件中的“开始分析”选项卡，将插值方法设置为优化的 8-trap；将判据设置为零归一化平方差，子区权重选项设置为高斯分布。
6. 在软件中将阈值选项设置为默认值。
7. 在“开始分析”选项卡中点击后处理子选项卡。勾选应变计算选项，滤波器尺寸和类型保持软件默认设置。选择张量类型为拉格朗日（Lagrange）。
8. 选择数据选项卡，然后选择任意一幅已分析的图像以可视化表面应变场。

结果

通过对血管组织进行阶梯式单轴拉伸试验所获得的力学数据，包含在给定的位移速率下，载荷与施加的试样位移之间的关系。本研究中，结合二维数字图像相关法（2D-DIC）与单轴力学测试，用于测量试样在不同变形状态下正交方向上的表面应变场。血管组织的黏弹性特性表现为在力学预 conditioning 之前，载荷-位移曲线中存在明显的滞后现象。为了提高力学测试的可重复性并获得弹性力学响应，通过多次加载-卸载循环对组织进行力学预 conditioning，使滞后现象逐渐减弱（图 1）。尽管试样制备与安装过程极为谨慎，2D-DIC 测量结果仍表明，试样内膜表面的应变场在周向和纵向两个方向上均呈现高度非均匀性。正如预期，局部周向应变值随施加的试样位移增加而增大。周向应变分布的非均匀性通常导致试样中心区域的应变值低于试样与夹具接触界面附近的值，反映了夹具对局部应变的影响（图 2）。在纵向方向上，随着试样逐渐拉伸，试样内膜表面产生的非均匀压缩应变增大，且所产生的应变场相较于周向方向表现出更显著的非均匀性（图 3

讨论

尽管以往的研究已采用多种染料示踪视频方法来评估样品应变^{18,20,21,23,24}，但本研究的目的是提供一种综合性的方法，将单轴拉伸试验与二维数字图像相关法（2D-DIC）相结合，用于评估血管组织样品表面的应变。通过高分辨率相机和自主开发的图像分析软件，可在样品经历单轴加载过程中，测量预设表面区域内的应变场。对于血管组织的力学测试而言，该技术尤其具有相关性，可直接调整用于平面双轴试验中的表面应变评估，进而有助于识别材料的本构特性。

为了便于进行数字图像相关分析，需在样品表面施加散斑图案。用于生成散斑的涂料是一种组织标记染料，可轻易附着于大多数软组织表面。通过调节喷笔的喷嘴直径以及样品与喷笔之间的距离，可实现最佳散斑尺寸（60–100 µm）和喷涂距离（0.5 m），从而获得高质量的对比度和适宜的散斑密度。所用散斑尺寸直接影响最终测量结果的分辨率^23,25。每个散斑需被至少3–5个像素采样，才能获得可接受的图像相关性。在本实验中，视场为22 mm×18 mm，结合所用散斑尺寸，实验分辨率达到9 µm/像素。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
单轴拉伸力学测试仪	Enduratec	3230 AT/HR
蓝色组织标记染料	http://www.ebay.com/itm/组织标记染料-瓶装-2盎司-每瓶1个-/201193551510?pt=LH_DefaultDomain_0&hash=item2ed811f696
喷雾器	Anest-iwata	CM-B	定制微米B
相机	Point Grey	GS2-GE-50S5M-C
透镜	Tokina	AT-X M100
血管组织	Caughman 公司
0.9% 氯化钠注射液 PBS	巴克斯特医疗公司
Vic_snap	Correlated Solutions
Vic_2D	Correlated Solutions
Wintest 4.1	Bose ElectroForce
组织粘合剂	3M Vetbond	1469SB
消毒剂	Fisher Scientific	04-355-13	Decon BDD Bacdown 洗涤剂消毒剂