利用酶解法和梯度分离法从小鼠皮肤中分离浸润性白细胞

摘要

本方案描述了在营养丰富的培养基中对小鼠皮肤进行酶消化，随后通过梯度分离来纯化白细胞。由此获得的细胞可用于多种下游应用。该方法是一种高效、经济且改进的替代方案，可取代组织解离仪以及更剧烈的胰蛋白酶和中性蛋白酶介导的组织消化方案。

摘要

将小鼠皮肤解离为单细胞悬液，对于后续细胞分析至关重要，例如在皮肤炎症的啮齿类动物模型中表征浸润性免疫细胞。本文介绍一种使用富含营养的溶液联合胶原酶D消化小鼠皮肤的实验方案，随后通过不连续密度梯度离心分离造血细胞。所获得的细胞可用于 体外 研究， 体内 转移以及其他下游细胞和分子分析，包括流式细胞术。本方案是一种经济有效的替代方法，可取代昂贵的机械解离装置、专用分离柱以及更具破坏性的胰蛋白酶和分散酶消化法，后者可能影响细胞活力或与表型鉴定及细胞功能相关的重要表面蛋白的表达水平。正如本研究代表性数据所示，该方案获得的细胞活力高，含有特定的免疫细胞亚群，并且对流式细胞术分析中常用表面标志蛋白的完整性无任何影响。

引言

从接触性皮炎、湿疹、银屑病、蜂窝织炎、真菌感染和脓肿到非黑色素瘤皮肤癌，这些皮肤疾病被发现是全球50种最常见疾病之一，并且在2010年成为全球非致死性疾病中的第四大病因¹。因此，研究多种皮肤病理背后的分子与细胞机制是当前必要且活跃的研究领域。啮齿类动物模型在理解特应性皮炎²、银屑病³或Staphylococcus aureus感染⁴等炎症性皮肤疾病方面具有显著价值。低成本、高效且操作简便的小鼠皮肤组织酶消化方案，可获得可用于多种下游应用的细胞样本，有助于更深入地理解皮肤疾病的病理生理机制。本文介绍一种简单且经济的方法，用于小鼠皮肤组织的酶消化及皮肤浸润性白细胞的分离，所得细胞可用于细胞培养、体内过继转移、流式细胞术分析与分选，或基因表达研究。该实验方案的总体目标是在尽量降低通常与定制试剂盒和机械解离仪相关成本的同时，制备出高细胞活力的皮肤浸润性白细胞单细胞悬液。

现有的皮肤组织解离方法^5-7 可能导致细胞活力低下和表面标志物完整性受损，或需要定制酶试剂盒和昂贵的组织解离设备^8-11虽然小鼠耳部皮肤组织的消化较为常见^12-13，消化高度角化的皮肤组织（例如来自 flank 的组织）可能导致细胞悬液中混有大量非细胞碎片。在最近的一项研究中，Zaid 及同事将小鼠 flank 皮肤消化了 90 分钟 在 2.5 mg/ml dispase 中孵育，随后 45 分钟 3 mg/ml 胶原酶⁷在另一项研究中，这些研究人员采用多次孵育，总消化时间为2.5小时，包括使用胰蛋白酶/EDTA、胶原酶III和分散酶⁵不建议使用胰蛋白酶进行皮肤组织的酶解消化，因为不同生产商的胰蛋白酶处理已被证明会显著影响哺乳动物细胞表面蛋白的完整性。^14-15此外，dispase 可能对 CD4 和 CD8α T 细胞的增殖能力产生显著影响，并影响至少 20 种分子的表面丰度，包括常见的 T 细胞活化标志物 CD62L¹⁶其他方案在消化液中使用 RPMI 1640⁶。然而，Mg的存在²⁺ 和 Ca²⁺ 在RPMI中可引起广泛的细胞聚集¹⁷.

理想的组织解离方案应力求实现高细胞存活率、低细胞聚集水平以及对细胞表面蛋白的最小损伤。通过采用较短的酶消化时间、无钙（Ca²⁺）和无镁（Mg²⁺）培养基，并避免使用胰蛋白酶和分散酶¹⁸，已成功获得高质量的淋巴结基质细胞制备物。然而，此类方案尚未建立用于完整小鼠皮肤的解离。

本文描述了一种从过敏原刺激的小鼠 flank 皮肤中分离、提取并富集皮肤浸润性白细胞的实验方案。简言之，切除的皮肤组织先在含10%胎牛血清的汉克斯平衡盐溶液（HBSS）中预孵育1小时，以软化组织便于后续消化，并去除多余的坏死皮肤或脂肪组织。随后使用0.7 mg/mL胶原酶D进行30分钟 的酶消化。胶原酶D对细胞表面标志物的密度影响极小，且在体外不影响T细胞增殖in vitro^16,18，因此非常适合用于细胞表面蛋白表征的相关实验。酶消化完成后，采用不连续密度梯度离心法从单细胞悬液中去除上皮细胞和碎片，并富集造血细胞。重要的是，该方法无需使用昂贵的基于柱状结构的磁性细胞分选试剂或组织解离仪^8-11，仅需基础生物医学研究实验室常见的设备和材料即可完成。本研究中，该方案用于从已致敏的ND4 Swiss小鼠 flank 皮肤（此前经三硝基氯苯类似物oxazolone（Ox）三次刺激）中分离白细胞（方案改编自文献19）。细胞通过多参数流式细胞术进行分析。该技术获得的细胞悬液碎片极少，分离所得淋巴细胞存活率>95%，并利用多参数流式细胞术检测了T淋巴细胞和中性粒细胞向病变皮肤的浸润情况。

方案

注意：本研究使用8-12周龄雌性ND4 Swiss Webster小鼠，常规饲养，自由摄食和饮水。 所采用的实验方案（B13S1）已获得麦克莱斯特学院动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 奥沙唑酮致敏与激发

1. 第0天
   1. 在4 L带盖玻璃罐底部的网状结构下方放置吸水毛巾，并加入3 ml异氟烷，制备麻醉室。对于本实验所用的ND4雌性小鼠，将小鼠置于麻醉室内30–60秒 ，直至其充分麻醉；应根据所使用的小鼠品系优化麻醉给药时间。
   2. 使用动物毛发修剪器剃除每只已麻醉小鼠背部和侧腹部的毛发。
2. 第1天
   1. 将4-乙氧基亚甲基-2-苯基-2-恶唑啉-5-酮（Ox）溶于无水乙醇，配制成2%溶液，并在50 °C孵育箱中的旋转平台上孵育15分钟 。
   2. 按照步骤1.1.1所述方法短暂麻醉小鼠，分多次每次约20 µl ，累计共100 µl，将2% Ox溶液涂抹于剃毛的背部。每次涂抹后等待5–10秒 ，使溶液干燥后再进行下一次涂抹。
   3. 注意避免将2% Ox溶液溅到背部以外的区域，且每次涂抹之间需等待溶液完全干燥。
3. 第5–7天
   1. 将（Ox）溶于无水乙醇，配制成1%溶液，并在50 °C孵育箱中的旋转平台上孵育15分钟 。
   2. 用手牢固但轻柔地抓住小鼠颈背部和尾根部，使腹部朝上，颈部略微向下倾斜（类似于腹腔注射时的抓持方式），分多次将共100 µl的1% Ox溶液涂抹于剃毛的侧腹部，并参照上述方法在涂抹后留出足够时间使皮肤干燥。
   3. 对于对照组小鼠，在剃毛的侧腹部涂抹100 µl无水乙醇溶剂。

2. 侧腹皮肤采集

1. 使用二氧化碳吸入法处死小鼠，并用 10 cm 外科剪仔细切除所需部位的 flank 皮肤（约 25 mm × 25 mm）。
2. 使用洁净锋利的手术刀片，刮除 flank 皮肤上多余的脂肪和结缔组织。
3. 将来自 3 只小鼠的 3 块 flank 皮肤放入一个含有 10 ml 室温 HBSS（含酚红，不含钙或镁，5 mM 乙二胺四乙酸（EDTA），10 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）和 10% 胎牛血清（FBS））的 50 ml 锥形管中。

3. 消化前组织清洗

1. 将含有皮肤碎片的离心管置于旋转板上，在37°C的干燥无气体环境的培养箱中孵育30分钟 。
2. 孵育结束后，剧烈涡旋振荡10秒。
3. 通过70 µm细胞筛过滤管内物质，弃去洗涤缓冲液并收集组织。在同一个生物学处理组内，单个细胞筛可在整个操作过程中重复使用。
4. 使用镊子将侧腹皮肤从细胞筛转移至新的50 ml锥形管中，管内含有10 ml新鲜的室温HBSS培养基（含EDTA、HEPES和FBS，如上所述）。
5. 将一把12.5 cm长的外科解剖剪浸入管中，将每块侧腹皮肤剪碎，使组织碎片的平均尺寸约为2.2 mm × 2.2 mm。
6. 将含有皮肤碎片的离心管置于旋转板上，在37°C的干燥无气体环境的培养箱中孵育30分钟 。
7. 孵育结束时剧烈涡旋振荡10秒。

4. 皮肤的胶原酶消化

1. 将管中的内容物通过70 µm滤网过滤，收集并转移腹侧皮肤组织块至一个新的50 ml锥形管中，管内含10 ml新鲜的、室温HBSS培养基，并添加0.7 mg/ml胶原酶D。
2. 将含有消化液和皮肤碎片的管子置于37°C干燥无气体环境的培养箱中的旋转板上，孵育30 min 。
3. 孵育结束时，剧烈涡旋振荡管内物质10秒。
4. 将管内物质通过70 µm滤网过滤至一个新的50 ml锥形管中；保留含有消化后组织的滤过液，弃去滤网及腹侧皮肤残渣。
5. 用50 ml HBSS培养基洗涤滤过液，350 g离心5 min ，然后弃去上清液。

5. 密度梯度离心

1. 使用刻度移液管，将 3 ml 室温的 67% 密度梯度离心介质（溶于 1× 磷酸盐缓冲液（PBS））加入每个样本的新 15 ml 圆锥形离心管中。
2. 用 5 ml 室温的含酚红的 44% 密度梯度离心介质（溶于 HBSS）重悬细胞沉淀。
3. 使用刻度移液管，将含有细胞的 5 ml 44% 密度梯度离心介质缓慢铺加到 67% 密度梯度离心介质样本上方。确保将移液器调至最慢流速，并将移液管沿圆锥形离心管管壁缓慢加入。注意避免振荡、搅动或颠倒梯度层。
4. 将离心机加速度设为最低档，关闭刹车，于室温下以 931 × g 离心 20 min ，并确保离心机已平衡。
5. 离心结束后，小心地从离心机中取出梯度管，保持管体直立，轻柔转移至实验台。使用 5 ml 塑料移液管，吸取 44% 与 67% 密度梯度离心介质之间的界面处细胞层，并转移至新的 15 ml 圆锥形离心管中。若界面不清晰，可简单吸取 67%–44% 界面处约 2 ml 液体。
6. 用含 2% FBS 的冰浴 1× PBS 将来自界面的细胞悬液补至满管，于 350 × g 离心 5 min ，弃去上清液。
   注意：自消化步骤（37°C）及密度梯度离心介质操作步骤（室温）以来，此为首次可将细胞冷却或保持低温。此时可将细胞重悬于 1:1 台盼蓝稀释液中，进行细胞计数并获取细胞活力信息。

6. 流式细胞术分析的封闭与染色

1. 阻断细胞上的 FcγRII/III 受体，以防止非特异性抗体染色。在本实验中，将抗 CD16/32（2.4G2）的未偶联抗体按 1:100 稀释比例加入含 2% FBS 的 PBS 中，配制抗体主混合液，用于结合并阻断 FcγRII/III 受体。
2. 将已阻断的细胞与针对 CD3ɛ（145-2C11）、CD4（RM4-5）、CD8α（53-6.7）、CD11b（M1/70）、CD11c（N418）、CD44（IM7）、CD45（30-F11）、CD45R（RA3-6B2）、CD62L（MEL-14）和 Ly-6G/Ly-6C（Gr-1）（RB6-8C5）的相应抗体主混合液，以及 Brilliant Violet 510 活/死细胞染料共同孵育，以识别死细胞。所有抗体应按照生产商推荐的稀释比例或研究者先前优化的条件使用。在本实验中，所有抗体均使用 1:100 的稀释比例。
3. 洗涤细胞后，重悬于 50 µl 含 2% FBS 的 1× PBS 染色缓冲液中，并置于冰上，直至在流式细胞仪上获取荧光数据。
   注意：在获取荧光数据前，应使用淋巴组织和常见细胞表面抗原（如 CD4 或 CD8）预先优化补偿参数。
4. 为增加后续流式细胞术分析的细胞数量，应对染色后的全部样本进行数据采集。

7. 使用标准方法分析流式细胞术数据以完成下述步骤

1. 首先，在前向散射（面积）与侧向散射（面积）图中圈选淋巴细胞区域。
2. 然后，利用前向散射（宽度）与侧向散射（宽度）图选择单细胞，以避免分析双联体。此步骤也可通过前向散射高度与侧向散射高度图完成。
3. 接着，圈选谱系标记（CD11b、CD11c 和 CD45R/B220）阴性且 CD3 阳性的细胞事件，以分别排除巨噬细胞、树突状细胞和 B 细胞，从而将分析限定于 T 细胞区室；若实验目的如本研究中所示为评估浸润性 T 细胞，则应采用此策略。
4. 随后，圈选排除活死染料的活细胞。
5. 最后，圈选目标细胞群体（参见代表性结果部分）。

结果

经胶原酶 D 处理的脾细胞在 T 细胞上显示的 CD4 和 CD8α 水平与培养基处理的对照组相似
首先，使用次级淋巴组织作为对照，评估胶原酶 D 对 T 细胞亚群上谱系标志物和活化标志物频率及表面丰度的潜在影响。从 ND4 小鼠中获得脾细胞悬液，并用 HBSS 培养基洗涤 1 小时。接着，将一半细胞用 0.7 mg/ml 胶原酶 D 处理（如上文第 4 节所述），其余细胞则重悬于对照 HBSS 培养基中。随后，如上文第 5 节所述，使用密度梯度离心法处理两组脾细胞。然后用抗表面 CD4 和 CD8α 的抗体对细胞进行染色，并在流式细胞仪上进行分析。分析时设门于单细胞、活细胞、CD45⁺、非 T 谱系^-（B220^-CD11b^-CD11c^-）、CD3ɛ⁺ 的细胞，以排除 B 细胞、巨噬细胞和树突状细胞。在经胶原酶 D 消化处理和未暴露于酶的脾细胞表面，CD4 和 CD8α 蛋白的检测水平相当，两种处理均...

讨论

表征特应性皮炎或银屑病等皮肤疾病啮齿类动物模型中皮肤驻留白细胞的变化，对于理解炎症细胞浸润与疾病病理之间的机制联系至关重要。本文介绍一种经济有效的方法，利用大多数生物医学研究实验室常见的基本设备从皮肤组织中分离白细胞。该方法相对快速，无需使用昂贵的组织解离仪器以及专用耗材和试剂，有助于节约资源并减少实验操作时间。通过温和的酶消化和不连续梯度离心可去除大部分上皮细胞和碎片，所获得的细胞可用于多种后续实验，包括流式细胞术分析、细胞分选、细胞转移、细胞培养以及体外刺激实验。使用胶原酶D进行酶消化不会影响T细胞表面标志物的完整性，并能保持细胞活性。本方案可轻松修改以适用于除侧腹部以外其他部位的皮肤组织处理。

该操作流程中最关键的步骤包括：1）在取材皮肤时彻底去除所有脂肪和结缔组织；2）快速处理组织以最大限度地提高浸润细胞的得率，同时尽量减少细胞死亡；3）轻柔地分层叠加密度梯度介质；4）仔细收集梯度界面处的细胞。在开展大规模实验之前，应先练习密度梯度离心介质的分层叠加及界面收集操作。可通过将整个小鼠脾脏研磨，经70 µm细胞筛滤入1×PBS染色缓冲液中，然后按照上述第5步所...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
含酚红、无钙、无镁的HBSS液体	Sigma Aldrich	55021C	使用前保持无菌。
HEPES，≥99.5%（滴定法）	Sigma Aldrich	H3375
EDTA二钠盐溶液	Sigma Aldrich	E7889	使用前保持无菌。
胎牛血清，USDA认证，热灭活，优选级	MidSci	S01520HI	使用前保持无菌。
Percoll，pH 8.5–9.5（25°C）	Sigma Aldrich	P1644	保持无菌。使用前需用无菌的10× PBS将Percoll调至等渗状态。
修毛组合套装	Kent Scientific	CL9990-1201	使用较大的修毛器修剪小鼠 flank 和背部的毛发。
4-乙氧基亚甲基-2-苯基-2-恶唑啉-5-酮	Sigma Aldrich	E0753-10G	在旋转平台上于50°C条件下用100%乙醇溶解15分钟。
纯化抗小鼠CD16/CD32抗体（2.4G2）	Tonbo Biosciences	70-0161	用于在流式细胞术抗体染色过程中阻断非特异性抗体结合
抗CD3ε-BV650抗体（145-2C11）	Becton Dickinson	564378	用于细胞流式染色的抗体
抗CD4-APC-eFluor780抗体（RM4-5）	eBioscience	47-0042-80	用于细胞流式染色的抗体
抗CD8α-BV785抗体（53-6.7）	BioLegend	100749	用于细胞流式染色的抗体
抗CD11b-eFluor450抗体（M1/70）	eBioscience	48-0112-80	用于细胞流式染色的抗体
抗CD11c-eFluor450抗体（N418）	eBioscience	48-0114-80	用于细胞流式染色的抗体
抗CD44-BV711抗体（IM7）	Becton Dickinson	563971	用于细胞流式染色的抗体
抗CD45-FITC抗体（30-F11）	Tonbo Biosciences	35-0451-U025	用于细胞流式染色的抗体
抗CD45R-eFluor450抗体（RA3-6B2）	eBioscience	48-0452-80	用于细胞流式染色的抗体
抗CD62L-PerCP-Cy5.5抗体（MEL-14）	BioLegend	104431	用于细胞流式染色的抗体
抗Ly-6G/Ly-6C（Gr-1）-PE抗体（RB6-8C5）	BioLegend	108407	用于细胞流式染色的抗体
Ghost Dye-BV510	Tonbo Biosciences	13-0870-T100	用于流式细胞术的细胞活性染料
LSR Fortessa	Becton Dickinson	N/A	细胞分析仪（18个参数）
来自Clostridium histolyticum的胶原酶D	Roche Applied Science	11088858001	将冻干酶以5 mg/mL的浓度分装于含酚红、无钙、无镁的HBSS中，每管1 mL。 立即于-20°C保存，可保存六个月。
ND4品系雌性小鼠	Harlan	0-32	8–12周龄；常规饲养，自由摄食饮水，实验操作遵循Macalester学院IACUC指南。