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方法文章

使用BrdU-ChIP-Slot-Western技术检测哺乳动物细胞中与新生DNA结合的蛋白质

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DOI：

10.3791/53647

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2016年1月14日

1Department of Radiation Oncology, Department of Oncological Sciences, Huntsman Cancer Institute, University of Utah School of Medicine

本文内容

摘要

在本实验方案中，我们描述了一种新型的BrdU-ChIP-Slot-Western技术，用于检测与新合成或新生DNA相关的蛋白质及组蛋白修饰。

摘要

组蛋白去乙酰化酶1和2（HDAC1,2）定位于DNA复制位点。在之前的研究中，我们利用选择性抑制剂和基因敲低系统，揭示了HDAC1,2在哺乳动物细胞中复制叉前进和新生染色质维持方面的新功能。此外，我们采用了一种BrdU-ChIP-Slot-Western技术，该技术结合了对溴脱氧尿苷（BrdU）标记DNA的染色质免疫沉淀（ChIP）、槽印迹和Western分析，以定量检测与新生DNA相关的蛋白质或组蛋白修饰。

将处于活跃分裂期的细胞用 HDAC1,2 特异性抑制剂处理，或转染针对 Hdac1 和 Hdac2 的 siRNA，随后使用胸苷类似物溴脱氧尿苷（BrdU）标记新合成的 DNA。BrdU 标记的时间点选择在因 HDAC1,2 功能缺失尚未引起显著细胞周期阻滞或凋亡的阶段。在完成 BrdU 标记后，使用特异性抗体对组蛋白乙酰化修饰或染色质重塑因子进行染色质免疫沉淀（ChIP）。将 BrdU 标记的输入 DNA 和免疫沉淀（或 ChIP）获得的 DNA 通过槽印迹技术点样至膜上，并用紫外光固定。随后利用抗 BrdU 抗体通过蛋白质印迹法对每个槽中新生 DNA 的含量进行定量分析。通过将处理样本获得的 BrdU-ChIP 信号相对于对照样本进行归一化，进而确定 HDAC1,2 功能缺失对新合成 DNA 相关联的组蛋白乙酰化修饰水平及染色质重塑因子的影响。

引言

DNA修复和/或DNA复制缺陷是基因组不稳定的首要原因，可引发细胞死亡。单个未修复的双链断裂就足以导致细胞死亡1。在DNA复制和修复过程中，染色质结构会发生暂时性改变2,3，若在这些过程中未能维持表观遗传信息，将威胁基因组完整性。HDAC3或HDAC1、2功能的缺失会阻碍S期进程、 DNA复制及修复，从而导致基因毒性应激（DNA损伤）和细胞 死亡4-9。因此，采用选择性HDAC抑制剂破坏癌细胞中的DNA复制、修复及染色质结构，诱导DNA损伤，进而选择性地抑制快速增殖的癌细胞生长并促使其死亡，是一种切实可行的策略。

在DNA复制过程中，染色质会迅速解离，随后在DNA复制完成后重新组装。新合成的组蛋白H4在K5和K12位点发生乙酰化修饰（H4K5K12ac），在沉积到染色质上后，这些乙酰化修饰会迅速被组蛋白去乙酰化酶（HDACs）去除10,11。若细胞无法通过组蛋白去乙酰化维持新生染色质的完整性，则可能导致复制叉崩溃，进而引发DNA损伤和细胞死亡。我们近期研究发现，选择性抑制HDAC1和HDAC2会增加组蛋白乙酰化水平（H4K5ac、H4K12ac和H4K16ac），并抑制SMARCA5染色质重塑因子在新生染色质上的活性，这与复制叉进程减缓、复制叉崩溃增加以及复制应激诱导的DNA损伤加剧相关6。因此，HDAC抑制剂处理可通过改变新生染色质结构，在癌细胞中迅速引发DNA损伤和细胞死亡，因为这些细胞增殖迅速，频繁经历S期。因此，深入理解HDACs如何调控组蛋白乙酰化及蛋白质结合以维持哺乳动物细胞中DNA复制的正常进行，具有重要意义。

为了定量测量DNA复制过程中与新生DNA相关的组蛋白乙酰化水平以及SMARCA5染色质重塑因子的结合情况，我们设计了一种改进的ChIP检测方法，称为BrdU-ChIP-Slot-Western技术。在对目标蛋白或组蛋白修饰进行染色质免疫沉淀（ChIP）后，可通过Slot Blot装置将ChIP样品中新生DNA（使用胸苷类似物BrdU标记）转移至膜上，并利用抗BrdU的Western印迹检测ChIP产物中新生DNA的含量。利用该技术，我们发现H4K16ac（一种参与染色质包装的修饰标记）以及ISWI家族成员SMARCA5（SWI/SNF相关、基质结合、肌动蛋白依赖性染色质调节因子）染色质重塑因子在S期细胞中与新生DNA相关联6。我们还发现，新生链上的H4K16ac修饰在DNA复制过程中被HDAC1,2去乙酰化6。H4K16ac可抑制ISWI家族成员SMARCA5的染色质重塑活性12。因此，通过BrdU-ChIP-Slot-Western技术，我们揭示了HDAC1,2在调控DNA复制期间染色质重塑过程中的功能联系。由此可见，BrdU-ChIP-Slot-Western印迹技术是一种强大的方法，可用于定量分析结合于新生DNA的蛋白质或其翻译后修饰的结合与解离动态。

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方案

1. 基于BrdU标记后的染色质免疫沉淀（ChIP）

  1. 按照先前所述方法，在含有 DMSO 或 HDAC1,2 选择性抑制剂的条件下培养 NIH3T3 细胞6。
  2. 经 DMSO 或 HDAC1,2 选择性抑制剂处理后，在无菌细胞培养超净台中向细胞加入 BrdU。将 2 × 106 个 NIH3T3 细胞接种于 10 ml NIH3T3 培养基中，加入溴脱氧尿苷（BrdU）至终浓度为 20 µM，于 37 °C 无菌细胞培养箱中孵育 60 分钟。
  3. 通过向培养基中直接加入甲醛，使其终浓度为 1%，以实现细胞内蛋白质与 DNA 的交联。将 2 × 106 个 NIH3T3 细胞在室温下置于摇床上，与甲醛共同孵育 10 分钟 。
  4. 加入甘氨酸至终浓度为 125 mM 以终止交联反应。在摇床上室温孵育 5 分钟。
  5. 弃去培养基，用 PBS 收集细胞至 15 ml 离心管中。在 4 °C 条件下以 956 × g 离心 5 分钟。用预冷的 PBS 洗涤细胞沉淀两次。弃去 PBS。将交联后的细胞沉淀（不含 PBS，即去除了上清液）于 -80 °C 保存，直至使用。
  6. 向交联后的细胞沉淀中加入 500 µl FA140 缓冲液（50 mM HEPES KOH pH 7.5，140 mM NaCl，1 mM EDTA（pH 8.0），1% Triton-X-100 和 0.1% 脱氧胆酸钠），并补充蛋白酶抑制剂混合物，以制备裂解液。
  7. 通过超声处理剪切染色质：将样品以 35% 功率超声处理 5 次，每次脉冲 15 秒 ，工作时间 0.9 秒，间歇时间 0.1 秒。每次超声后将管子置于冰上，防止样品过热。
    1. 在 DNA 琼脂糖凝胶上检测剪切效果，因为不同超声仪的剪切效率可能不同。为检测超声效果，加入 NaCl 至终浓度 0.16 M 以逆转交联，并执行步骤 1.17.1. - 1.22。取 10 µl 洗脱的 DNA 在 1.5% 琼脂糖凝胶上电泳，检测剪切片段是否在 300 - 700 bp 范围内，且平均强度位于 500 bp 左右。
  8. 超声处理后，在 4 °C 条件下以 17,949 × g 离心 10 分钟，将上清液转移至新管中。
    1. 根据制造商说明书，使用商用蛋白定量试剂盒进行蛋白浓度测定。ChIP 实验中，对照组与实验组应使用等量的裂解液。通常每项 ChIP 反应使用 1 mg 总裂解液。
  9. 使用含蛋白酶抑制剂混合物的 FA140 缓冲液制备 50% 蛋白 A-琼脂糖悬液。加入相当于总体积 1/10 的蛋白酶抑制剂混合物。根据样品总数计算所需磁珠体积。
    1. 用 FA140 缓冲液洗涤蛋白 A-琼脂糖磁珠两次，以去除保存液，然后加入等体积的 FA140 缓冲液，制成 50% 悬液。
    2. 为去除非特异性结合蛋白，向样品中加入 50 µl 50% 蛋白 A-琼脂糖悬液，在 4 °C 条件下于旋转混合仪中持续翻转孵育 30 分钟。
  10. 在 4 °C 条件下以 956 × g 离心 1 分钟。收集上清液，并向上清液中加入 8 μl H4K16ac 抗体或 5 μl（5 μg）1 mg/ml 的 SMARCA5 抗体，进行免疫沉淀。在 4 °C 条件下于旋转混合仪中持续翻转孵育过夜 。
  11. 保留十分之一的提取物作为“input”对照，置于 -20 °C 保存。input 样品需与免疫沉淀样品一同进行交联逆转。
  12. 使用等量的兔 IgG（5 μl，1 mg/ml）作为阴性对照免疫沉淀样品。
  13. 次日，向提取物中加入 50 μl 50% 蛋白 A-琼脂糖悬液，在 4 °C 条件下旋转孵育 1 小时。
  14. 在 4 °C 条件下以 956 × g 离心 2 分钟，沉淀琼脂糖磁珠，小心弃去上清液，并依次用以下缓冲液洗涤磁珠。配制缓冲液时，应在使用前立即加入蛋白抑制剂。
    1. 用低盐免疫复合物洗涤缓冲液（FA140；终浓度为 50 mM HEPES KOH pH 7.5，140 mM NaCl，1 mM EDTA（pH 8.0），1% Triton-X-100 和 0.1% 脱氧胆酸钠）在 4 °C 条件下翻转孵育 5 分钟。
    2. 用高盐免疫复合物洗涤缓冲液（FA500；终浓度为 50 mM HEPES KOH pH 7.5，500 mM NaCl，1 mM EDTA（pH 8.0），1% Triton-X-100 和 0.1% 脱氧胆酸钠）在 4 °C 条件下翻转孵育 5 分钟。
    3. 用 LiCl 免疫复合物洗涤缓冲液（终浓度为 10 mM Tris-Cl pH 8.0，250 mM LiCl，0.5% NP40 和 0.5% 脱氧胆酸钠）在 4 °C 条件下翻转孵育 5 分钟。
  15. 按上述步骤洗涤后，加入 200 µl 洗脱液（终浓度为 1% SDS 和 100 mM 碳酸氢钠），在室温下翻转孵育 15 分钟。
  16. 在室温下以 956 × g 离心，将洗脱液转移至新的 1.5 ml 离心管中。用额外的 200 µl 洗脱液重复步骤 1.15。
  17. 向 400 µl 洗脱液中加入 NaCl 至终浓度 0.16 M，充分混匀。
    1. 此外，向之前保留的 10 µl input 样品（步骤 1.11）中加入 400 µl 洗脱液，并加入 NaCl 至终浓度 0.16 M，以同时逆转交联。将样品置于 65 °C 水浴中孵育 5 小时，完成交联逆转。
  18. 向逆转交联后的洗脱液中加入 1 ml 100% 乙醇，充分混匀，于 -80 °C 孵育 2 - 3 小时，或于 -20 °C 过夜。以 17,949 × g 离心 15 分钟，弃去乙醇。
  19. 加入 800 µl 70% 乙醇洗涤沉淀。在 4 °C 条件下以 17,949 × g 离心 15 分钟，弃去乙醇。短暂离心以去除残留乙醇。在 37 °C 下空气干燥 10 分钟，以彻底去除残留乙醇。
  20. 将 DNA 溶解于 90 µl 无 RNase 和 DNase 的水中，并加入 2 µl 10 mg/ml RNase，使其终浓度为 0.2 mg/ml。在 37 °C 水浴中孵育 30 分钟。
  21. 加入 10 µl 10x 蛋白酶 K 缓冲液（100 mM Tris-Cl pH 8.0，50 mM EDTA pH 8.0，5% SDS）。充分混匀后加入 1 µl 蛋白酶 K。在 42 °C 条件下孵育 1 小时。
  22. 根据制造商说明书，使用商用 PCR 纯化试剂盒纯化 input 和 ChIP DNA，并用 50 µl 水洗脱 DNA。将 DNA 于 -20 °C 保存，以备后续使用。

2. ChIP DNA 的槽点印迹分析

  1. 使用分光光度计在280 nm处按照制造商说明书测定步骤1.22中以50 µl水洗脱的输入DNA和ChIP DNA的产量。
  2. 取等体积（50 µl）处于检测线性范围内的输入DNA或免疫沉淀DNA。
    1. 例如，若输入DNA产量为1.5 ng/µl，则取30 µl（即总共45 ng DNA），并用水补足至50 µl。对于因子ChIP，直接取步骤2.1中得到的全部50 µl洗脱液，并进行步骤2.3。
  3. 通过加入2.5倍体积的0.4 N NaOH使50 µl输入DNA或免疫沉淀DNA变性，短暂涡旋混匀后以956 × g离心10秒，并在室温下孵育30分钟。
  4. 加入175 µl 1 M Tris-HCl（pH 6.8）中和变性DNA，涡旋混匀，以956 × g离心10秒，然后将样品置于冰上。
  5. 按照以下说明为Slot Blot实验制备输入DNA和免疫沉淀DNA的系列稀释液。
    1. 按照步骤2.3–2.4操作，获得总体积为350 µl的样品（即，50 µl 输入/ChIP DNA、125 µl 0.4 N NaOH、175 µl 1 M Tris-HCl，pH 6.8）。
      注意：以上述示例为例，45 ng输入DNA最终浓度为0.129 ng/µl。
    2. 对于输入DNA，标记三支离心管分别为100、50和25，分别加入100 µl、50 µl和25 µl变性并中和后的DNA样品，并用无核酸酶水补足至终体积100 µl。对于ChIP DNA，标记三支离心管分别为200、100和50，分别加入200 µl、100 µl和50 µl变性并中和后的DNA样品，并用无核酸酶水补足至终体积200 µl 。
  6. 将膜裁剪至与Slot Blot装置大小相匹配。在加入DNA前，用20× SSC缓冲液预先润湿膜和吸水纸。按照制造商说明书将它们组装到Slot Blot装置中。
  7. 将步骤2.5.2中的DNA样品加入相应的加样孔中。缓慢施加真空，使DNA吸附到zeta-probe膜上。待所有样品完全通过装置后停止抽真空。
    1. 拆卸装置，并立即使用紫外交联仪将DNA固定在膜上。将膜的DNA面朝上放入紫外交联仪中，使用自动交联程序进行交联。操作遵循制造商说明书。
  8. 通过Western blot方法检测Slot Blot上的BrdU。
    1. 用含0.1% Tween-20的PBS（PBST）配制的5%脱脂奶粉在室温下封闭膜1小时 ，以防止抗体与膜发生非特异性结合。
    2. 将一抗抗BrdU抗体（1:500稀释）用含1%脱脂奶粉的PBST稀释后加入膜中，在摇床上室温孵育3小时。一抗孵育结束后用PBST洗涤膜三次。
    3. 加入HRP标记的抗小鼠二抗（1:5,000稀释），室温孵育1小时。二抗孵育结束后用PBST洗涤膜三次。
      注意：在一抗和二抗孵育过程中，应使用足够体积的抗体溶液以完全覆盖膜。
  9. 根据制造商说明书配制ECL显色液并将其加入膜上。室温孵育5分钟。
    1. 将膜放入X光片暗盒中，使膜与X光胶片接触曝光，并按照制造商说明书显影。
    2. 使用Image J软件按照制造商说明书对扫描后的膜图像进行信号定量分析。定量时应选择处于检测线性范围内的信号，以确保测量结果的准确性。

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结果

为了确定 HDAC1,2 选择性抑制剂的特异性，使用了 Hdac1,2FL/FL 和 Hdac3FL/FL 纤维肉瘤细胞。利用携带 Cre 重组酶的腺病毒（Ad-Cre）在这些细胞中删除 Hdac1,2 和 Hdac3。在对 Hdac1,2FL/FL 细胞感染 Ad-Cre 后，观察到 H4K5ac 水平显著升高。对 Hdac1,2 敲除细胞使用化合物 233 或 898 处理后，H4K5ac 水平未进一步升高，证实 233 和 898 在这些细胞中抑制的是 Hdac1,2 而非 Hdac3。相反，在 Hdac3 敲除细胞中加入 233 或 898 后，H4K5ac 水平较仅敲除 Hdac3 所引起的升高更为显著，这是由于 Hdac1,2 和 Hdac3 同时被抑制后对 H4K5ac 水平产生了叠加效应。因此，233 和 89...

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讨论

本论文所述方案是一种相对快速的方法，用于检测新复制或新生DNA上是否存在蛋白质或其翻译后修饰形式。此外，该技术还可用于测量蛋白质或其修饰形式与新生DNA结合与解离的动力学过程。该技术是对优雅的iPOND技术13的补充。在iPOND技术中，新合成的DNA通过乙炔基脱氧尿苷（EdU）进行标记，随后利用点击化学反应将生物素偶联物添加到EdU上。接着使用链霉亲和素磁珠免疫沉淀带有生物素标记的新生DNA，并通过蛋白质印迹法检测共纯化的蛋白质。相比之下，在我们的BrdU-ChIP-Slot-Western技术中，使用特异性识别蛋白质或其特定修饰形式的抗体对与新生DNA结合的蛋白质进行免疫沉淀，然后利用抗BrdU抗体通过Slot-印迹法对与该蛋白质结合的BrdU标记新生DNA进行定量检测。

本实验方案中有若干关键步骤需要特别注意。首先，必须确保目标抗体在标准ChIP实验中具有高效性且表现良好。在进行BrdU-CHIP-Slot-Western实验之前，应通过定量PCR检测抗体在ChIP实验中的效率。为了确保BrdU-...

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披露

我不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本手稿的研究工作得到了放射肿瘤学系、亨斯迈癌症研究所和美国国立卫生研究院基金（R01-CA188520）对SB的资助。感谢我实验室的Danielle Johnson和Steven Bennett演示本实验方案并讲解其优势。感谢Mahesh Chandrasekharan博士（亨斯迈癌症研究所）对本手稿提出的宝贵意见。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗BrdU（Western印迹）BD 生物科学B555627
抗SMARCA5Abcamab3749
抗H4K16acActive Motif39167
Zeta-Probe GT 膜伯乐（Bio-Rad）162-0197
甲醛FisherBP531-500
蛋白A琼脂糖Millipore16-156
Rnase AQiagen19101
蛋白酶KSigmaP4850
PCR 纯化试剂盒Qiagen28106
甘氨酸SigmaG7403
蛋白酶抑制剂混合物罗氏11836170001
BrdUSigmaB9285
兔IgG Millipore12-370
HEPESSigmaH3375
NaClSigmaS-3014
Triton-X-100Sigma93443
NP40USB公司19628
脱氧胆酸钠SigmaD6750
碳酸氢钠SigmaS-4019
乙醇Decon Laboratories04-355-222
DEPC处理水Sigma95284
TrisFisherBP-152-5
EDTAInvitrogen15575-020
SDSAmbionAM9820
氢氧化钠Mallinckrodt GenAR MAL7772-06
20x SSCLife Technologies15557-036
脱脂奶粉Lab Scientific 公司M0841
ECL赛默飞世尔科技80196
X射线胶片Genesee Sci30-101
开发者柯尼卡美能达SRX-101A
紫外交联仪StratageneXLE-1000
超声波破碎仪Branson 超声破碎仪  数字超声波细胞破碎仪型号：450
离心Eppendorf型号：5810R
水浴锅Fisher Scientific Isotemp型号：2322
NanoDrop 1000 分光光度计赛默飞世尔科技模型：1000
槽式印迹装置 Schleicher和Schuell Minifold II44-27570
组织培养箱赛默飞世尔科技Series II 3110 水套式CO2培养箱

参考文献

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