使用BrdU-ChIP-Slot-Western技术检测哺乳动物细胞中与新生DNA结合的蛋白质

摘要

在本实验方案中，我们描述了一种新型的BrdU-ChIP-Slot-Western技术，用于检测与新合成或新生DNA相关的蛋白质及组蛋白修饰。

摘要

组蛋白去乙酰化酶1和2（HDAC1,2）定位于DNA复制位点。在之前的研究中，我们利用选择性抑制剂和基因敲低系统，揭示了HDAC1,2在哺乳动物细胞中复制叉前进和新生染色质维持方面的新功能。此外，我们采用了一种BrdU-ChIP-Slot-Western技术，该技术结合了对溴脱氧尿苷（BrdU）标记DNA的染色质免疫沉淀（ChIP）、槽印迹和Western分析，以定量检测与新生DNA相关的蛋白质或组蛋白修饰。

将处于活跃分裂期的细胞用 HDAC1,2 特异性抑制剂处理，或转染针对 Hdac1 和 Hdac2 的 siRNA，随后使用胸苷类似物溴脱氧尿苷（BrdU）标记新合成的 DNA。BrdU 标记的时间点选择在因 HDAC1,2 功能缺失尚未引起显著细胞周期阻滞或凋亡的阶段。在完成 BrdU 标记后，使用特异性抗体对组蛋白乙酰化修饰或染色质重塑因子进行染色质免疫沉淀（ChIP）。将 BrdU 标记的输入 DNA 和免疫沉淀（或 ChIP）获得的 DNA 通过槽印迹技术点样至膜上，并用紫外光固定。随后利用抗 BrdU 抗体通过蛋白质印迹法对每个槽中新生 DNA 的含量进行定量分析。通过将处理样本获得的 BrdU-ChIP 信号相对于对照样本进行归一化，进而确定 HDAC1,2 功能缺失对新合成 DNA 相关联的组蛋白乙酰化修饰水平及染色质重塑因子的影响。

引言

DNA修复和/或DNA复制缺陷是基因组不稳定的首要原因，可引发细胞死亡。单个未修复的双链断裂就足以导致细胞死亡¹。在DNA复制和修复过程中，染色质结构会发生暂时性改变^2,3，若在这些过程中未能维持表观遗传信息，将威胁基因组完整性。HDAC3或HDAC1、2功能的缺失会阻碍S期进程、 DNA复制及修复，从而导致基因毒性应激（DNA损伤）和细胞 死亡^4-9。因此，采用选择性HDAC抑制剂破坏癌细胞中的DNA复制、修复及染色质结构，诱导DNA损伤，进而选择性地抑制快速增殖的癌细胞生长并促使其死亡，是一种切实可行的策略。

在DNA复制过程中，染色质会迅速解离，随后在DNA复制完成后重新组装。新合成的组蛋白H4在K5和K12位点发生乙酰化修饰（H4K5K12ac），在沉积到染色质上后，这些乙酰化修饰会迅速被组蛋白去乙酰化酶（HDACs）去除^10,11。若细胞无法通过组蛋白去乙酰化维持新生染色质的完整性，则可能导致复制叉崩溃，进而引发DNA损伤和细胞死亡。我们近期研究发现，选择性抑制HDAC1和HDAC2会增加组蛋白乙酰化水平（H4K5ac、H4K12ac和H4K16ac），并抑制SMARCA5染色质重塑因子在新生染色质上的活性，这与复制叉进程减缓、复制叉崩溃增加以及复制应激诱导的DNA损伤加剧相关⁶。因此，HDAC抑制剂处理可通过改变新生染色质结构，在癌细胞....

方案

1. 基于BrdU标记后的染色质免疫沉淀（ChIP）

1. 按照先前所述方法，在含有 DMSO 或 HDAC1,2 选择性抑制剂的条件下培养 NIH3T3 细胞⁶。
2. 经 DMSO 或 HDAC1,2 选择性抑制剂处理后，在无菌细胞培养超净台中向细胞加入 BrdU。将 2 × 10⁶ 个 NIH3T3 细胞接种于 10 ml NIH3T3 培养基中，加入溴脱氧尿苷（BrdU）至终浓度为 20 µM，于 37 °C 无菌细胞培养箱中孵育 60 分钟。
3. 通过向培养基中直接加入甲醛，使其终浓度为 1%，以实现细胞内蛋白质与 DNA 的交联。将 2 × 10⁶ 个 NIH3T3 细胞在室温下置于摇床上，与甲醛共同孵育 10 分钟 。
4. 加入甘氨酸至终浓度为 125 mM 以终止交联反应。在摇床上室温孵育 5 分钟。
5. 弃去培养基，用 PBS 收集细胞至 15 ml 离心管中。在 4 °C 条件下以 956 × g 离心 5 分钟。用预冷的 PBS 洗涤细胞沉淀两次。弃去 PBS。将交联后的细胞沉淀（不含 PBS，即去除了上清液）于 -80 °C 保存，直至使用。
6. 向交联后的细胞沉淀中加入 500 µl FA140 缓冲液（50 mM HEPES KOH pH 7.5，140 mM NaCl，1 mM EDTA（pH 8.0），1% Triton-X-10....

结果

为了确定 HDAC1,2 选择性抑制剂的特异性，使用了 Hdac1,2^FL/FL 和 Hdac3^FL/FL 纤维肉瘤细胞。利用携带 Cre 重组酶的腺病毒（Ad-Cre）在这些细胞中删除 Hdac1,2 和 Hdac3。在对 Hdac1,2^FL/FL 细胞感染 Ad-Cre 后，观察到 H4K5ac 水平显著升高。对 Hdac1,2 敲除细胞使用化合物 233 或 898 处理后，H4K5ac 水平未进一步升高，证实 233 和 898 在这些细胞中抑制的是 Hdac1,2 而非 Hdac3。相反，在 Hdac3 敲除细胞中加入 233 或 898 后，H4K5ac 水平较仅敲除 Hdac3 所引起的升高更为显著，这是由于 Hdac1,2 和 Hdac3 同时被抑制后对 H4K5ac 水平产生了叠加效应。因此，233 和 89.......

讨论

本论文所述方案是一种相对快速的方法，用于检测新复制或新生DNA上是否存在蛋白质或其翻译后修饰形式。此外，该技术还可用于测量蛋白质或其修饰形式与新生DNA结合与解离的动力学过程。该技术是对优雅的iPOND技术¹³的补充。在iPOND技术中，新合成的DNA通过乙炔基脱氧尿苷（EdU）进行标记，随后利用点击化学反应将生物素偶联物添加到EdU上。接着使用链霉亲和素磁珠免疫沉淀带有生物素标记的新生DNA，并通过蛋白质印迹法检测共纯化的蛋白质。相比之下，在我们的BrdU-ChIP-Slot-Western技术中，使用特异性识别蛋白质或其特定修饰形式的抗体对与新生DNA结合的蛋白质进行免疫沉淀，然后利用抗BrdU抗体通过Slot-印迹法对与该蛋白质结合的BrdU标记新生DNA进行定量检测。

本实验方案中有若干关键步骤需要特别注意。首先，必须确保目标抗体在标准ChIP实验中具有高效性且表现良好。在进行BrdU-CHIP-Slot-Western实验之前，应通过定量PCR检测抗体在ChIP实验中的效率。为了确保BrdU-.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗BrdU（Western印迹）	BD 生物科学	B555627
抗SMARCA5	Abcam	ab3749
抗H4K16ac	Active Motif	39167
Zeta-Probe GT 膜	伯乐（Bio-Rad）	162-0197
甲醛	Fisher	BP531-500
蛋白A琼脂糖	Millipore	16-156
Rnase A	Qiagen	19101
蛋白酶K	Sigma	P4850
PCR 纯化试剂盒	Qiagen	28106
甘氨酸	Sigma	G7403
蛋白酶抑制剂混合物	罗氏	11836170001
BrdU	Sigma	B9285
兔IgG	Millipore	12-370
HEPES	Sigma	H3375
NaCl	Sigma	S-3014
Triton-X-100	Sigma	93443
NP40	USB公司	19628
脱氧胆酸钠	Sigma	D6750
碳酸氢钠	Sigma	S-4019
乙醇	Decon Laboratories	04-355-222
DEPC处理水	Sigma	95284
Tris	Fisher	BP-152-5
EDTA	Invitrogen	15575-020
SDS	Ambion	AM9820
氢氧化钠	Mallinckrodt GenAR	MAL7772-06
20x SSC	Life Technologies	15557-036
脱脂奶粉	Lab Scientific 公司	M0841
ECL	赛默飞世尔科技	80196
X射线胶片	Genesee Sci	30-101
开发者	柯尼卡美能达	SRX-101A
紫外交联仪	Stratagene	XLE-1000
超声波破碎仪	Branson 超声破碎仪  数字超声波细胞破碎仪	型号：450
离心	Eppendorf	型号：5810R
水浴锅	Fisher Scientific Isotemp	型号：2322
NanoDrop 1000 分光光度计	赛默飞世尔科技	模型：1000
槽式印迹装置	Schleicher和Schuell Minifold II	44-27570
组织培养箱	赛默飞世尔科技	Series II 3110 水套式CO2培养箱