延时视频显微镜用于评估EYFP-Parkin聚集作为细胞有丝分裂吞噬的标志物

摘要

本文详细描述了一种通过延时视频显微技术来检测EYFP-Parkin在选择性清除受损线粒体过程中时间依赖性募集的方法。这种依赖EYFP-Parkin的受损线粒体清除的动态过程，可作为在不同实验条件下评估细胞健康状态的指标。

摘要

延时视频显微技术可定义为对活细胞进行实时成像的方法。该技术依赖于在不同时间点采集图像，时间间隔可通过控制显微镜集成相机的计算机界面进行设定。此类显微技术既需要能够捕捉快速发生的事件，也需要在这些事件过程中被观察的细胞结构产生足够的信号。图像采集完成后，将整个实验的图像序列组合成一部视频，以展示所关注分子事件的动态过程。延时视频显微技术在生物医学研究领域具有广泛的应用，是实时追踪细胞事件动态变化的一种强大且独特的工具。通过该技术，我们可以评估细胞迁移、分裂、信号转导、生长和死亡等细胞过程。此外，利用荧光分子探针，我们能够标记特定分子（如DNA、RNA或蛋白质），并追踪其在分子通路中的分布与功能。延时视频显微技术具有多种优势，其中最主要的是能够在单细胞水平上收集数据，使其成为细胞生物学研究领域中一项独特而重要的技术。然而，该技术也存在一些局限性，可能影响高质量图像的获取。图像质量可能受到外部因素（如温度波动、振动、湿度）和内部因素（如pH值、细胞运动性）的干扰。本文中，我们描述了一种利用延时视频显微技术动态采集一种特定蛋白——与增强型黄色荧光蛋白（EYFP）融合的Parkin蛋白——的实验方案，以追踪受损线粒体的选择性清除过程。

引言

大自噬是一种细胞内过程，涉及对受损和功能失调的细胞组分（如细胞器和蛋白质）进行分解代谢降解，以实现回收利用或产生能量。为了启动这一代谢过程，细胞将受损的组分包裹进一种双层膜结构中，称为自噬体；随后自噬体与溶酶体融合，其内容物被降解并回收利用^1,2。自噬主要分为两种类型：非选择性自噬和选择性自噬。当细胞处于营养缺乏条件时，会启动非选择性自噬，以获取必需的营养物质和能量。而选择性自噬则用于清除可能具有毒性的功能失调或受损的细胞器和蛋白质。目前研究最为深入的选择性自噬过程之一是线粒体的清除，称为线粒体自噬（mitophagy）^1,3-5。

线粒体是细胞代谢的中心细胞器，主要通过电子传递链、脂肪酸氧化和三羧酸（TCA）循环中的氧化磷酸化过程产生三磷酸腺苷（ATP）。此外，线粒体还调控活性氧（ROS）的生成，并释放参与细胞死亡通路的蛋白质^6-8。

PTEN诱导的假定激酶1（PINK1）和Parkin RBR E3泛素连接酶（Parkin）是参与线粒体自噬过程的关键蛋白。Parkin可通过维持线粒体质量控制来保持细胞健康，从而保护细胞免于死亡⁹。当线粒体膜电位丧失时，细胞质中的Parkin会被PINK1招募至线粒体上，这一招募过程会触发线粒体自噬的级联事件¹⁰。大量证据表明，线粒体自噬是一种基本的线粒体质量控制机制，该过程的异常可导致疾病的发生⁷。例如，常染色体隐性遗传的帕金森病与编码Parkin和PINK1的基因（分别为PARK2和PINK1）突变相关¹¹。线粒体健康的质量控制对于清除那些促进活性氧（ROS）积累的线粒体至关重要¹²。细胞内ROS的过度积累可导致核DNA和线粒体DNA（分别简称为DNA和mtDNA）的损伤。

在此，我们展示了一种延时视频显微镜方法，用于追踪在永生化小鼠胚胎成纤维细胞中通过诱导Parkin介导的线粒体自噬后Parkin的聚集过程 体外 使用解偶联剂羰基氰化物-4-（三氟甲氧基）苯腙（FCCP）。FCCP 通过使质子在 mitochondria 外膜上发生短路，破坏 ATP 合成，从而将氧化磷酸化与电子传递链解偶联。 ¹³线粒体膜去极化的触发会导致线粒体结构破坏及Parkin依赖性的选择性清除。因此，将目的细胞转染表达载体，该载体编码与荧光标记物（增强型黄色荧光蛋白，EYFP）融合的Parkin，可作为荧光标签用于追踪有丝分裂过程中Parkin的募集情况。为了可视化线粒体，我们共转染了pDsRed2-Mito质粒，该质粒编码含有细胞色素c氧化酶亚基VIII线粒体靶向序列（Mito）的红色荧光蛋白（DsRed2）。pDsRed2-Mito专用于线粒体的荧光标记。¹⁴Parkin 转位至线粒体膜所需的时间可以被测量，并可间接反映细胞的健康状况。例如，若某一特定目的基因敲除的细胞系在 FCCP 诱导线粒体自噬后，表现出 Parkin 募集速度加快或减慢，则可认为该基因产物在维持细胞代谢速率于生理状态以及预防疾病发生方面起着关键作用。因此，延时视频显微镜技术为在基础与临床研究中追踪标记蛋白在其分子过程中的动态变化，以及理解这些过程在病理条件下如何受到影响，提供了极为强大的工具。

方案

1. 使用表达载体EYFP-Parkin和pDsRed2-Mito对成纤维细胞进行电穿孔

1. 使用添加了10%胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/mL 青霉素和100 mg/mL链霉素的DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基），在10厘米组织培养皿中培养永生化小鼠胚胎成纤维细胞，于含5% CO₂的湿润环境中37 °C培养。
   1. 当细胞融合度达到80%时，通过无菌抽吸弃去完全DMEM培养基，加入10 mL无菌1×磷酸盐缓冲液（PBS）（80 g NaCl、2.0 g KCl、14.4 g Na₂HPO₄、2.4 g KH₂PO₄溶于1 L蒸馏H₂O，pH：7.4）。
   2. 通过无菌抽吸弃去PBS，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA。将培养皿在37 °C孵育至细胞脱落（2–3分钟）。加入4 mL完全DMEM培养基，重悬细胞，并取出10 μL 细胞悬液用于血细胞计数板计数。
      注：血细胞计数板的设计使得一组16个角方格中的细胞数相当于细胞数×10⁴/mL。
2. 在电穿孔前24小时，将1×10⁶个细胞接种至10 cm组织培养皿中。
3. 通过无菌抽吸弃去完全DMEM培养基，加入10 mL无菌PBS。再次通过无菌抽吸弃去PBS，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA。将培养皿在37 °C孵育至细胞脱落（2–3分钟）。加入4 mL完全DMEM培养基，将细胞重悬于15 mL离心管中。
4. 使用冷藏离心机（4 °C）以250 × g离心5分钟 。通过无菌抽吸弃去上清液，将沉淀用1 mL无菌PBS重悬。在4 °C下以250 × g再次离心5分钟 。
5. 通过无菌抽吸弃去上清液，向细胞沉淀中加入100 µL电穿孔溶液混合液（82 µL电穿孔溶液V + 18 µL辅助溶液1），轻轻吹打重悬沉淀（更多细节请参阅用户指南）。向细胞悬液中加入2 µg EYFP-Parkin（激发/发射波长514/527）和1 µg pDsRed2-Mito（激发/发射波长565/620）。
6. 使用一次性巴斯德吸管（试剂盒中提供）将溶液转移至无菌电穿孔杯中，并使用预设程序NIH/3T3 U-030（单脉冲，电压200 V，电容960 µF，脉冲时间20毫秒，脉冲次数：1）进行电穿孔。
7. 电穿孔后立即加入500 µL新鲜预热的完全DMEM培养基，将细胞接种至6 cm活细胞成像级组织培养皿中，在含5% CO₂的湿润环境中37 °C孵育24小时。

2. 时间推移视频显微镜技术

1. 使用前将显微镜腔室温度设置为 37 °C。
2. 此时准备特定的活细胞成像培养基以继续实验方案。按如下方法配制活细胞成像培养基：将无酚红 DMEM 培养基补充 10% 胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/mL 青霉素和 100 mg/mL 链霉素。将活细胞成像培养基在 37 °C 水浴中预热。
3. 用无菌吸管吸除电穿孔细胞的培养基，使用 P1000 移液器加入 1 mL 预热的活细胞成像培养基，并将培养板在 37 °C 下孵育 30 min 。
4. 在培养板孵育期间，向已稳定在 37 °C 的显微镜腔室内通入 5% CO₂。
5. 将含有电穿孔细胞的培养板放入显微镜腔室中，避免剧烈移动或振荡。
6. 通过软件界面设置显微镜，以检测共转染载体所编码的两种融合蛋白的荧光信号：EYFP-Parkin（激发波长范围 495 至 510 nm，发射波长范围 520 至 550 nm，绿色）和 pDsRed2-Mito（最大激发波长 558 nm，最大发射波长 583 nm，红色）。
   1. 打开延时视频显微镜软件。在顶部菜单中选择 FITC 对应 EYFP-Parkin，Rhodamine 对应 pDsRed2-Mito。在顶部菜单中选择放大倍数（20X）。
7. 通过软件界面寻找同时表达两种共转染载体的单个细胞，并记录其位置。对每种实验条件（实验组）重复此步骤，直至至少收集 10 个细胞。
   1. 选择菜单 "Apps"，点击“多维采集”（Multi Dimensional Acquisition）。在多维采集窗口中设置所需参数，例如采集次数、每次采集之间的时间间隔以及记录细胞的位置。点击 "Acquire" 开始采集过程。
8. 开始对 EYFP-Parkin 和 DsRed2-Mito 荧光信号进行基础采集，每 5 分钟采集一次图像，持续 15 分钟。
9. 准备预热的活细胞成像培养基，其中 FCCP 浓度为最终工作浓度的两倍（0.1 - 10 µM，取决于细胞类型）。
10. 暂停采集过程，使用 P1000 移液器将 1 mL 含 FCCP 的预热活细胞成像培养基轻轻加入显微镜腔室内的培养板中。
11. 按照前述方法重新启动采集过程，总时长为 3 小时，使用之前记录的细胞位置。保存所有采集的图像，以便在采集结束后进行分析并生成线粒体自噬过程的视频。

3. 分析

1. 在个人计算机上收集所有以 ".tiff " 格式获取的图像
2. 使用图形软件打开图像，并确定从线粒体经FCCP诱导去极化到首次观察到Parkin募集至线粒体膜之间的时相间隔（图像每5分钟采集一次）。对实验组中的每个细胞重复此分析。
3. 在电子表格中，将实验组名称标注为该列的第一个细胞。针对每个实验组，测量至少10个细胞的Parkin募集时相间隔。计算各实验组Parkin募集时相间隔的平均值，并确定其标准偏差（均值 ± 标准差，N = 10）。
   1. 将各个计算所得的时相间隔数据按列整理。每列包含该实验组的 n = 10 个测量值。
   2. 从公式构建器菜单中选择 "average" 函数，选中该列数据；再从公式构建器菜单中选择 "Standard Deviation" 函数，并选中该列数据。
4. 采用适当的统计学方法对实验组进行比较，以确定各实验组在线粒体自噬动态过程中是否存在显著差异（例如，两组之间采用 Student's t-Test，三组及以上采用 ANOVA 加 post-hoc 检验）

结果

本文展示了延时视频显微镜是一种强大的技术，可用于追踪单个细胞中荧光标记蛋白的分子事件。代表性结果还表明，该技术能够获得高质量的图像。在获取分子过程的图像后，我们可以采用多种方式对其进行分析。本文中，我们分析了诱导线粒体自噬过程启动后的时间间隔，该过程是一种关键的分子机制，可通过选择性清除受损线粒体来维持细胞稳态。

该技术具有广泛的应用基础，可用于监测宏观的细胞过程（如细胞迁移），或通过标记参与特定研究过程的关键分子来监测微观的分子事件。

Parkin 介导的线粒体自噬

选择性Parkin介导的受损及功能障碍线粒体清除过程如图1所示：解偶联试剂FC...

讨论

延时显微镜技术可定义为将活细胞成像从单一时间点的观察扩展为对细胞动态过程进行长时间连续观察的技术。该方法不同于普通的共聚焦显微镜或活细胞显微镜，因为它允许观察者实时识别单个荧光标记的蛋白质，并追踪其在单个活细胞内的动态变化。事实上，共聚焦显微镜能够利用荧光抗体轻松识别免疫标记的蛋白质，但无法在细胞的活体环境中观察细胞及其分子事件的发生过程。

延时视频显微镜主要用于研究不同类型细胞中的分子过程，例如 HEK293¹⁶、原代神经元¹⁷和 Hela 细胞¹⁸，但也具有临床应用价值，如辅助妊娠及预测非整倍体^19,20。延时显微镜可为胚胎学家提供有关胚胎发育的额外信息，有助于临床妊娠，这些信息可能提升我们筛选可移植存活胚胎的能力。使用延时显微镜的其他优势还包括减少了对胚胎及其培养皿在中间观察过程中的操作，从而降低实验室中样本丢失或污染的风险¹⁹。

细胞能够通过线粒体自噬（mitophagy）降解受损和功能失调的线粒体，从而维持健...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	Corning Life Science	10-013-CV	使用前于 37 °C 预热
无酚红 DMEM	Corning Life Science	17-205-CV	使用前于 37 °C 预热
胎牛血清	Sigma-Aldrich	F2442	使用前于 37 °C 预热
L-谷氨酰胺	Gibco	25030	使用前于 37 °C 预热
青霉素/链霉素	Corning Life Science	30-002-CI	使用前于 37 °C 预热
EYFP-PARKIN 表达载体	Addgene	23955
pDsRed2-Mito 表达载体	Clontech	632421
Nucleofector 2B 电转仪	LONZA	AAD-1001S
NIH/3T3 细胞用 R 套件 Nucleofector	LONZA	VCA-1001
ZEISS AXIOVERT 200M 倒置显微镜	CARL ZEISS
羰基氰-4-(三氟甲氧基)苯腙（FCCP）	Sigma-Aldrich	C2920
MetaMorph	Molecular Devices	Experimental Builder
ImageJ	美国国立卫生研究院	Experimental Builder