本文详细描述了一种通过延时视频显微技术来检测EYFP-Parkin在选择性清除受损线粒体过程中时间依赖性募集的方法。这种依赖EYFP-Parkin的受损线粒体清除的动态过程，可作为在不同实验条件下评估细胞健康状态的指标。
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本文内容
摘要
摘要
延时视频显微技术可定义为对活细胞进行实时成像的方法。该技术依赖于在不同时间点采集图像，时间间隔可通过控制显微镜集成相机的计算机界面进行设定。此类显微技术既需要能够捕捉快速发生的事件，也需要在这些事件过程中被观察的细胞结构产生足够的信号。图像采集完成后，将整个实验的图像序列组合成一部视频，以展示所关注分子事件的动态过程。延时视频显微技术在生物医学研究领域具有广泛的应用，是实时追踪细胞事件动态变化的一种强大且独特的工具。通过该技术，我们可以评估细胞迁移、分裂、信号转导、生长和死亡等细胞过程。此外，利用荧光分子探针，我们能够标记特定分子（如DNA、RNA或蛋白质），并追踪其在分子通路中的分布与功能。延时视频显微技术具有多种优势，其中最主要的是能够在单细胞水平上收集数据，使其成为细胞生物学研究领域中一项独特而重要的技术。然而，该技术也存在一些局限性，可能影响高质量图像的获取。图像质量可能受到外部因素（如温度波动、振动、湿度）和内部因素（如pH值、细胞运动性）的干扰。本文中，我们描述了一种利用延时视频显微技术动态采集一种特定蛋白——与增强型黄色荧光蛋白（EYFP）融合的Parkin蛋白——的实验方案，以追踪受损线粒体的选择性清除过程。
引言
大自噬是一种细胞内过程，涉及对受损和功能失调的细胞组分（如细胞器和蛋白质）进行分解代谢降解，以实现回收利用或产生能量。为了启动这一代谢过程，细胞将受损的组分包裹进一种双层膜结构中，称为自噬体；随后自噬体与溶酶体融合，其内容物被降解并回收利用1,2。自噬主要分为两种类型：非选择性自噬和选择性自噬。当细胞处于营养缺乏条件时，会启动非选择性自噬，以获取必需的营养物质和能量。而选择性自噬则用于清除可能具有毒性的功能失调或受损的细胞器和蛋白质。目前研究最为深入的选择性自噬过程之一是线粒体的清除，称为线粒体自噬（mitophagy）1,3-5。
线粒体是细胞代谢的中心细胞器，主要通过电子传递链、脂肪酸氧化和三羧酸（TCA）循环中的氧化磷酸化过程产生三磷酸腺苷（ATP）。此外，线粒体还调控活性氧（ROS）的生成，并释放参与细胞死亡通路的蛋白质6-8。
PTEN诱导的假定激酶1（PINK1）和Parkin RBR E3泛素连接酶（Parkin）是参与线粒体自噬过程的关键蛋白。Parkin可通过维持线粒体质量控制来保持细胞健康，从而保护细胞免于死亡9。当线粒体膜电位丧失时，细胞质中的Parkin会被PINK1招募至线粒体上，这一招募过程会触发线粒体自噬的级联事件10。大量证据表明，线粒体自噬是一种基本的线粒体质量控制机制，该过程的....
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方案
1. 使用表达载体EYFP-Parkin和pDsRed2-Mito对成纤维细胞进行电穿孔
- 使用添加了10%胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/mL 青霉素和100 mg/mL链霉素的DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基），在10厘米组织培养皿中培养永生化小鼠胚胎成纤维细胞，于含5% CO2的湿润环境中37 °C培养。
- 当细胞融合度达到80%时，通过无菌抽吸弃去完全DMEM培养基，加入10 mL无菌1×磷酸盐缓冲液（PBS）（80 g NaCl、2.0 g KCl、14.4 g Na2HPO4、2.4 g KH2PO4溶于1 L蒸馏H2O，pH：7.4）。
- 通过无菌抽吸弃去PBS，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA。将培养皿在37 °C孵育至细胞脱落（2–3分钟）。加入4 mL完全DMEM培养基，重悬细胞，并取出10 μL 细胞悬液用于血细胞计数板计数。
注：血细胞计数板的设计使得一组16个角方格中的细胞数相当于细胞数×104/mL。
- 在电穿孔前24小时，将1×106个细胞接种至10 cm组织培养皿中。
- 通过无菌抽吸弃去完全DMEM培养基，加入10 mL....
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结果
本文展示了延时视频显微镜是一种强大的技术，可用于追踪单个细胞中荧光标记蛋白的分子事件。代表性结果还表明，该技术能够获得高质量的图像。在获取分子过程的图像后，我们可以采用多种方式对其进行分析。本文中，我们分析了诱导线粒体自噬过程启动后的时间间隔，该过程是一种关键的分子机制，可通过选择性清除受损线粒体来维持细胞稳态。
该技术具有广泛的应用基础，可用于监测宏观的细胞过程（如细胞迁移），或通过标记参与特定研究过程的关键分子来监测微观的分子事件。
Parkin 介导的线粒体自噬
选择性Parkin介导的受损及功能障碍线粒体清除过程如图1所示：解偶联试剂FC.......
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讨论
延时显微镜技术可定义为将活细胞成像从单一时间点的观察扩展为对细胞动态过程进行长时间连续观察的技术。该方法不同于普通的共聚焦显微镜或活细胞显微镜，因为它允许观察者实时识别单个荧光标记的蛋白质，并追踪其在单个活细胞内的动态变化。事实上，共聚焦显微镜能够利用荧光抗体轻松识别免疫标记的蛋白质，但无法在细胞的活体环境中观察细胞及其分子事件的发生过程。
延时视频显微镜主要用于研究不同类型细胞中的分子过程，例如 HEK29316、原代神经元17和 Hela 细胞18，但也具有临床应用价值，如辅助妊娠及预测非整倍体19,20。延时显微镜可为胚胎学家提供有关胚胎发育的额外信息，有助于临床妊娠，这些信息可能提升我们筛选可移植存活胚胎的能力。使用延时显微镜的其他优势还包括减少了对胚胎及其培养皿在中间观察过程中的操作，从而降低实验室中样本丢失或污染的风险19。
细胞能够通过线粒体自噬（mitophagy）降解受损和功能失调的线粒体，从而维持健.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作部分由美国国立卫生研究院（NIH）资助（项目编号：1R01CA137494、R01CA132115、R01CA086072，授予 R.G.P.），Kimmel 癌症中心 NIH 癌症中心核心资助 P30CA056036（R.G.P.），乳腺癌研究基金会资助，Dr. Ralph 和 Marian C. Falk 医学研究信托基金的慷慨资助（R.G.P.），以及宾夕法尼亚州卫生部资助（R.G.P.）。部分工作还得到了美意癌症基金会博士后奖学金（G.D.）和 Sidney Kimmel 癌症中心生物成像共享资源（NCI 5 P30 CA-56036）的资助。该部门明确声明不对任何分析、解释或结论承担责任。本稿件不存在利益冲突。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM | Corning Life Science | 10-013-CV | 使用前于 37 °C 预热 |
| 无酚红 DMEM | Corning Life Science | 17-205-CV | 使用前于 37 °C 预热 |
| 胎牛血清 | Sigma-Aldrich | F2442 | 使用前于 37 °C 预热 |
| L-谷氨酰胺 | Gibco | 25030 | 使用前于 37 °C 预热 |
| 青霉素/链霉素 | Corning Life Science | 30-002-CI | 使用前于 37 °C 预热 |
| EYFP-PARKIN 表达载体 | Addgene | 23955 | |
| pDsRed2-Mito 表达载体 | Clontech | 632421 | |
| Nucleofector 2B 电转仪 | LONZA | AAD-1001S | |
| NIH/3T3 细胞用 R 套件 Nucleofector | LONZA | VCA-1001 | |
| ZEISS AXIOVERT 200M 倒置显微镜 | CARL ZEISS | ||
| 羰基氰-4-(三氟甲氧基)苯腙（FCCP） | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| MetaMorph | Molecular Devices | Experimental Builder | |
| ImageJ | 美国国立卫生研究院 | Experimental Builder |
参考文献
- Youle, R. J., Narendra, D. P. Mechanisms of mitophagy. Nat Rev Mol Cell Biol. 12, 9-14 (2011).
- Zhi, X., Zhong, Q. Autophagy in cancer. F1000Prime Rep. 7, 18(2015).
- Ding, W. X., Yin, X. M.
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