通过重组腺相关病毒载体注射立体的α-突触核蛋白基于大鼠模型为帕金森氏病的发展

摘要

这份手稿描述了病毒载体介导的局部基因递送如何提供一种有吸引力的方式来在中枢神经系统中表达转基因。 该方案概述了在大鼠黑质中进行病毒载体注射以开发基于病毒载体的帕金森病动物模型的所有关键步骤。

摘要

为了研究帕金森氏病（PD）的分子途径，并制定新的治疗策略，科学调查依靠动物模型。的PD-相关基因的鉴定已经导致遗传的PD模型的发展。大多数转基因α-SYN的小鼠模型开发逐渐α-SYN病理，但未能显示效果清晰多巴胺细胞损失和多巴胺相关的行为缺陷。这一障碍，通过用病毒载体过量表达的PD-相关基因的黑质的直接靶向克服。使用病毒载体本地基因递送提供了一个有吸引力的方式来表达在中枢神经系统中的转基因。特定的大脑区域可以靶向（ 例如黑质），表达可在成人设置被诱导，并且可以达到高表达水平。此外，可以使用基于各种病毒不同载体系统。的协议概括了所有关键步骤来执行的病毒载体注射的大鼠的黑质开发用于帕金森氏病的病毒的基于矢量的α-突触核蛋白的动物模型。

引言

研究PD的病理生理学和开发新的治疗策略，对于动物模型可以非常类似于人PD的神经病理学，生理和运动症状的迫切需要。较高的预测值，我们就能更好地转化动物模型的新疗法给患者。

α-突触核蛋白的发现（α-SYN）在1997年第一PARK基因导致了第一个基因PD模型的发展。许多表达人野生型（WT）或突变（A30P，A53T）的转基因小鼠α-SYN已在过去十年中产生的。 α-SYN过表达的水平已被证明是在病理学的发展是至关重要的。另外，小鼠品系，内源性α-SYN的和是否全长或截短形式表示存在或不存在，播放（由洋红色和Chesselet ¹详细审查）的作用。 WT和人类的几个临床突变体的过表达＃945; -SYN在转基因小鼠诱导α-SYN病理累积和神经元功能障碍^2-6。然而，直到现在大多数转基因α-SYN的小鼠模型未能显示效果清晰多巴胺细胞损失和多巴胺相关的行为缺陷。

这种障碍是由黑质（SN）用病毒载体过表达α-SYN的直接针对克服。病毒载体是从病毒，可以很容易感染细胞，引入遗传物质引入其宿主基因组中，并迫使宿主细胞中复制的病毒基因组中，以产生新的病毒颗粒衍生的。病毒可以被工程化以保留其进入细胞并引入基因的能力的非复制的病毒载体。通过删除的病毒基因组的某些部分与由感兴趣的基因替换它们，载体的应用将导致在单轮感染而不会在宿主细胞中，通常被指定为"转导"复制。病毒载体Ç一个同时用于过表达和基因沉默。所表达的转基因可以是一个报告蛋白（ 例如绿色荧光蛋白或萤火虫萤光素酶^）7，治疗性蛋白质的基因治疗应用^8-10，或如我们将集中于在本文中，用于疾病建模¹¹的疾病相关蛋白质^-14。

病毒载体介导的基因递送提供了另一种方式来表达在CNS转基因与几个优点。利用当地的转基因传送，特定的大脑区域可以有针对性。此外，转基因的表达可以减少成年后的补偿机制发展过程中的风险过程中引起的。此外，可以在不同的物种和株被创建的模型。最后，不同的转基因可以很容易地进行组合。使用病毒载体，高转基因表达水平可以实现，因为该疾病发病和严重程度常常取决于曝光过度的水平，这可能是重要的ression。

根据不同的病毒数载体系统已经开发出来。载体系统的选择依赖于感兴趣的基因，基因表达，靶细胞和生物安全问题的需要的持续时间的大小。在大脑中，慢病毒（LV）的稳定的基因转移和重组腺相关病毒（腺相关病毒）载体现在被认为是选择的载体系统，因为它们导致在啮齿动物脑有效和长期的基因表达。对于SN的多巴胺能神经元（DN）特异性靶向，腺相关病毒载体已逐渐outcompeted由于其较高的效价和DN的转染效率的LV载体。

目前可用的最佳α-SYN基于啮齿动物模型已经从使用较新的AAV血清型的组合的方法显影（腺相关病毒1，5，6，7，8）和优化的载体构建体，滴度和纯度^15,16。载体滴度以及载体纯度直接影响该模型的表型结果。过度载体滴度或充分纯化的载体批次，可能会导致非特异性毒性。因此，适当的控制向量是不可缺少的。在病毒载体生产，像素提升和纯化过程相当长的时间也投资已经证明必不可少获得可重复性和高品质的矢量批次。

方案

所有的动物实验是由比利时鲁汶大学生物伦理委员会（比利时）按照1986年11月24日（86/609 / EEC）的欧洲共同体委员会指令进行批准。

1.重组腺相关病毒生产和纯化

注意:rAAV载体生产和纯化由鲁汶病毒载体核（LVVC）如先前所述¹⁷进行。

1. 简言之，转染汇合低（<50）通道使用25KD线性聚乙烯亚胺150纳米的NaCl转染溶液和三种不同的质粒以1:1的比例粘附的HEK 293T细胞:1:1的DMEM培养基2％胎牛血清。后在37℃下在5％CO ₂温育24小时，替换以新鲜的DMEM培养基2％胎牛血清的培养基。
   注意:质粒包括用于AAV7血清型的构建体中，CMVIE的控制下，α-SYN编码人A53T突变的AAV转移质粒增强SYNAPSIN1子和pAdvDeltaF6腺病毒辅助质粒^17。
2. 收获中5天瞬时转染后使用切向流过滤¹⁷集中。
3. 净化从浓缩介质使用碘克沙醇步骤梯度¹⁷ rAAV载体颗粒。
4. 使用实时PCR基因组副本（GC）测定的标准技术。在这个协议中，3.0 E11 GC的向量滴度/ ml的用于开发基于α-SYN大鼠模型PD ^17。

2.重组腺相关病毒α-SYN的立体定向注射载体在大鼠的SN（图2）

1. 众议院8周龄雌性Wistar大鼠可免费使用颗粒状的食物和自来水一个正常的12小时光/暗周期下重约200-250克
2. 提交老鼠腹腔内（IP）含有氯胺酮（60毫克/千克），美托咪定（0.4毫克/公斤）混合物麻醉。一旦大鼠麻醉，并没有反应挤压不同爪子时，管理对大鼠的用微型发射机应答器植入背面为进一步识别微发射机应答皮下。检查，如果微发射机应答器被正确定位，并且可以通过读取装置读出。
3. 切头皮上的顶部的毛发。在头皮和耳都应用局部麻醉剂。使用无菌技术在层流下进行手术操作的其余部分。
4. 将使用两个耳朵酒吧，嘴和鼻子吧的立体定向头架的老鼠。覆盖纸毛毯的大鼠的体以避免在体温下降。应用眼部润滑剂，以防止眼睛变干。
5. 消毒在异丙醇70％与jodium 1％头皮和作一小切口在头皮的中线。轻轻刮掉头骨膜和用生理盐水冲洗。让头骨干几分钟。观察颅缝和两个参考点:前囟门和Lambda。
6. 注入rAAV载体进入SN，定义坐标对前囟门（正位5.3毫米;内外侧斜:2.0毫米，背腹:从硬脑膜计算7.2毫米）。
   注意:为每个感兴趣的区域的三维坐标可以使用大鼠大脑的立体图集进行计算，施加前囟如解剖参考点。
7. 填有10微升注射针筒（30计20毫米），腺相关病毒载体，并将其放置在与机动微量注射泵连接在立体定位仪。通过释放载体一滴控制音量和消除多元清洁剂pH值为9（ 如 RBS）。
8. 目视检查头直在头部框架固定和评估的左右轴。仔细直观定义前囟门和Lambda前后及中侧坐标和立体定位框架的背腹臂用30计20毫针刺测量自己的身高。
   1. 允许时在囟门和Lambda之间的高度0.3毫米差aximum。放置针回到前囟门和通过移动的前后和立体定位框架的中侧臂施加的前后和中侧坐标。
9. 在注射位置，测量头骨的高度，并确保它不会从囟的高度相差大于0.3毫米。钻在头骨的孔的直径为约2毫米。测量硬脑膜的高度，这将作为应用背腹坐标参考。可替代地减去对颅骨（0.9毫米）的固定厚度。
10. 使用26号针头穿透硬脑膜，用无菌组织吸收血液。等到所有出血已在继续之前停止。
11. 慢慢插入10微升注射注射器预加载了载体溶液进入脑到预先确定的深度（背腹坐标）。等待1分钟，以代替针。注射3微升使用机动微量注射泵，吞吐量0.25微升（的rAAV2 / 7α-SYN或绿色荧光蛋白控制向量的3.0 E11基因组拷贝/ ml（中等矢量剂量）或1.0 E12 GC /毫升（高矢量剂量））向量解/分钟。
12. 注射后，保持针到位再过5分钟，慢慢地，再取出。使用拼接编织涂层聚酯3.0头皮，消毒用1％jodium在70％异丙醇和轻轻地从立体定向仪取出的动物。首先松开鼻子和嘴棒，那么这两个耳酒吧。
13. 扭转麻醉，用0.5毫克/千克腹膜内阿替美唑注入大鼠和放置老鼠在一个干净的笼子上的38℃的加热板，直到其被唤醒。覆盖纸毛毯大鼠防止体温下降。
14. 提供容易获得食物和水的第一个小时。监测的最初几天的老鼠。如果需要应用镇痛。
    注意:没有必要去除从t线圈他的头骨。 1-2周后颅骨完全修复和拆线松动。

3.的rAAV2评估/ 7α-SYN注射的大鼠使用非侵入性的PET显像，行为测试和免疫组化分析

1. 跟进黑质纹状体多巴胺神经变性的动力学非侵入过在动物个体时，量化多巴胺转运蛋白（DAT），使用小动物正电子发射断层扫描（PET）和DA转运如的示踪剂结合^[18 F] -FECT ¹⁶ 。
2. 审查多巴胺能神经变性的程度是否足以诱发在大鼠运动障碍，若使大鼠在气缸试验，评价自发前肢使用。
   1. 放置老鼠在期间沿后部后壁和到达垂直运动宽透明玻璃筒和录像带的行为20厘米分数由每个前爪做触点数量共计20联系人。对的评分标准的详细描述，参见Schallert 等人 ¹⁸快速的受损前肢触点（ 例如左前爪），为总前肢接点的百分比（左加右前爪）的数目。
      注意:在使用两个爪同样非损伤对照大鼠应在此测试得分50％左右。
3. 进行免疫组织化学（IHC）分析来评估转基因表达和多巴胺能细胞损失的水平。
   1. 在不同的最终阶段，处死大鼠用戊巴比妥钠（60毫克/千克，IP）的过量，并用冷盐水随后在PBS ¹⁹ 4％多聚甲醛执行心脏内灌注。固定的大脑在4℃过夜，并用振动切片机切成50μm厚冠状脑切片。
   2. 使用抗α-SYN和酪氨酸羟化酶的抗体来分析α-SYN表达水平和乐自由浮动的部分进行IHC染色神经退行性疾病¹⁶德维尔。

结果

实验的总体方案在图1中所描绘

A53Tα-SYN的重组腺相关病毒2月7日-介导的过度表达导致多巴胺相关运动障碍。
为了检验α-SYN过表达水平是否足以诱发在大鼠运动障碍，我们进行了大鼠的气缸试验，评价自发前肢使用（ 图3A）。 3周至注射后，一个显著运动功能障碍主要出现在接受剂量3.0 E11 GC / ml的A53Tα-SYN的rAAV2 / 7载体的作用。在注射4周后没有观察到自发对侧（左）前爪使用降低50％，而对照的eGFP的rAAV2 / 7注射的动物显示在前爪使用（ 图3B）无不对称。这获得了较高的αA53T-SYN的rAAV2 / 7载体剂量大鼠表现出更为明显的impairm在29天前爪使用（70％）的耳鼻喉科注射后（ 图3C）。为了证明所观察到的运动功能障碍是多巴...

讨论

有该协议中的几个关键步骤。载体滴度以及载体纯度直接影响该模型的表型结果。过度载体滴度或充分纯化的载体批次，可能会导致非特异性毒性。因此，使用高品质的矢量批次，适当的控制载体是必不可少的。此外，鼠的头在立体框架的精确定位和坐标的精确确定是在指定目标的黑质是必不可少的。在注射部位钻在头骨的孔后，它在针插入直入老鼠的大脑不接触任何边距是重要的。针应注射病毒载体后慢慢取出，以防止载体的泄漏。最后，缝合后，头皮应与在70％的异丙醇1％jodium消毒由其他动物，以避免拆线的咬入。或者其他防腐试剂可以使用。

所描述的方法还可以用于开发用于帕金森氏病²⁴的rAAV2 / 7α-SYN基于小鼠模型。在小鼠中，我们注入2微升rAAV载体的SN中的体积。相比大鼠，小鼠的DN似乎有点到α-SYN过表达，导致神经变性的延迟表现不太敏感。此外，在脑的其他区域（ 例如纹状体，海马，皮质， 等 ）可被靶向。对于不同脑区的坐标可以在立体图谱中找到。的坐标的最优化可以通过中国墨或通过使用编码报道基因的病毒载体（ 例如 ，eGFP的）来完成。...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
雌性 8 周龄 Wistar 大鼠	Janvier	/	200-250 g
氯胺酮 （Nimatek）	Eurovet 动物保健	804132
美托咪定 （Dormitor）	Orion-Pharma/ Janssen Animal Health	1070-499
头皮和耳朵的局部麻醉剂：Xylocaïne 2% 凝胶	阿斯利康	0137-547
Terramycine	辉瑞	0132-472
Bupré去甲酰亚胺（Vetergesic）	依冯	2623-627
Jodium 1%异丙醇	VWR	0484-0100
定向头架	Stoeling	/
Hamilton注射器（30 gauge -20 mm -pst 2）	Hamilton/过滤器服务	7803-07
阿替帕唑（抗轿车）	Orion-Pharma/Elanco	1300-185
rAAV A53T &α;-SYN 载体	LVVC，KU 鲁汶	/	https://gbiomed.kuleuven.be/english/research/50000715/laboratory-of-molecular-virology-and-gene-therapy/lvvc/
戊巴比妥钠 （Nembutal）	Ceva Santé	0059-444
切片机	Microm	HM650
兔多克隆突触核蛋白抗体	Chemicon	5038	1：5,000
兔多克隆抗体 TH Ab	Chemicon	152	1：1,000
氧原硅酸镥探测器 基于 FOCUS 220 断层扫描	西门子/Concorde Microsystems	/
放射配体：18F-FECT	内部	/
L-多巴：Prolopa 125	Roche		6 mg/kg ip。
DMEM， Glutamax	Life Technologies	N° 31331-093
胎牛血清	Life Technologies	N° 10270-106
25 kD线性聚乙烯亚胺（PEI）	Polysciences	/
OptiPrep 密度梯度介质：碘沙醇	Sigma	D1556-250ML
Optimen	Life Technologies	N° 51985-026
Paxinos 1 watston 立体图谱，第四版	Elsevier	/