本文描述了病毒载体介导的局部基因递送如何为在中枢神经系统中表达外源基因提供一种有效的方法。该方案概述了在大鼠黑质内注射病毒载体以建立基于病毒载体的帕金森病动物模型所需的全部关键步骤。
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摘要
摘要
为了研究帕金森病（PD）的分子通路并开发新的治疗策略，科研人员依赖于动物模型。与帕金森病相关基因的发现推动了遗传性帕金森病模型的发展。大多数转基因α-SYN小鼠模型会逐渐出现α-SYN病理改变，但缺乏明显的多巴胺能细胞丢失以及多巴胺依赖性行为缺陷。这一难题通过使用过表达帕金森病相关基因的病毒载体直接靶向黑质得以解决。利用病毒载体进行局部基因递送，为在中枢神经系统中表达外源基因提供了一种有效的方法。可特异性靶向特定脑区（e.g. 黑质），可在成年动物中诱导基因表达，并实现高水平的表达。此外，还可采用基于不同病毒的多种载体系统。本实验方案详细阐述了在大鼠黑质中进行病毒载体注射以建立基于病毒载体的α-突触核蛋白帕金森病动物模型的全部关键步骤。
引言
为了研究帕金森病（PD）的病理生理机制并开发新的治疗策略，迫切需要建立能够紧密模拟人类帕金森病神经病理学、生理学及运动症状的动物模型。动物模型的预测价值越高，就越有助于将新疗法从动物模型成功转化应用于患者。
1997年发现α-突触核蛋白（α-SYN）是首个PARK基因，由此推动了首批遗传性帕金森病（PD）模型的建立。在过去十年中，已成功构建了多种过表达人源野生型（WT）或突变型（A30P、A53T）α-SYN的转基因小鼠模型。研究表明，α-SYN的过表达水平在病理发展过程中起着关键作用。此外，小鼠品系、内源性α-SYN的存在与否，以及所表达的是全长形式还是截短形式，均具有影响（详见Magen和Chesselet1的综述）。在转基因小鼠中过表达野生型及多种临床突变型人源α-SYN，均可导致α-SYN的病理性聚集和神经元功能障碍2-6。然而，迄今为止，大多数α-SYN转基因小鼠模型均未能表现出明显的多巴胺能神经元丢失以及多巴胺依赖性行为缺陷。
这一难题通过使用过表达α-突触核蛋白（α-SYN）的病毒载体直接靶向黑质（substantia nigra, SN）而得以克服。病毒载体来源于病毒，能够高效感染细胞，将遗传物质整合到宿主基因组中，并迫使宿主细胞复制病毒基因组以产生新的病毒颗粒。病毒可被改造为不能复制的病毒载体，但仍保留进入细胞和导入基因的能力。通过删除病毒基因组的部分序列，并....
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方案
所有动物实验均按照1986年11月24日欧洲共同体理事会指令（86/609/EEC）进行，并已获得比利时鲁汶大学生物伦理委员会的批准。
1. 重组腺相关病毒的生产与纯化
注意：rAAV 载体的生产和纯化由鲁汶病毒载体中心（LVVC）按照先前所述方法完成17。
- 简而言之，使用25 kDa线性聚乙烯亚胺（PEI）转染液（含150 nM NaCl）及DMEM培养基（含2%胎牛血清），以1:1:1的比例对低传代（<50代）、亚融合状态的贴壁HEK 293T细胞进行转染。在37 °C、5% CO2条件下孵育24小时后，更换为新鲜的DMEM培养基（含2%胎牛血清）。
注意：所用质粒包括AAV7血清型的包装质粒、携带在CMVie增强型突触素1启动子控制下表达人源A53T突变型α-SYN的AAV转移质粒，以及pAdvDeltaF6腺病毒辅助质粒17。 - 在瞬时转染后第5天收集培养上清，并采用切向流过滤法进行浓缩17。
- 利用碘克沙醇阶梯梯度离心法从浓缩后的上清中纯化重组AAV（rAAV）病毒颗粒17。
- 采用实时定量PCR标准技术测定基因组拷贝数（GC）。本方案中，使用3.0 E11 GC/ml的病毒滴度构建基于α-SYN的帕金森病大鼠模型17。
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结果
实验的整体方案如图1所示
rAAV 2/7 介导的 A53T α-SYN 过表达可诱导多巴胺依赖性运动功能障碍。
为了检测 α-SYN 过表达水平是否足以在大鼠中诱导运动功能障碍，我们对大鼠进行了筒壁实验，以评估其自发前肢使用情况（图 3A）。自注射后第 3 周起，接受 3.0 E11 GC/ml 剂量 A53T α-SYN rAAV2/7 载体的大鼠出现显著的运动功能障碍。注射后第 4 周，其自发对侧（左侧）前爪使用率下降了 50%，而对照组注射 eGFP rAAV2/7 载体的大鼠则未表现出前爪使用不对称性（图 3B）。接受更高剂量 A53T α-SYN rAAV2/7 载体的大鼠在注射后第 29 天表现出更明显的前爪使用障碍（下降 70%）（图 3C）。为了证实所观察到的.......
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讨论
实验方案中包含若干关键步骤。载体滴度以及载体纯度会直接影响模型的表型结果。过高的载体滴度或纯度不足的载体批次可能导致非特异性毒性。因此，使用高质量的载体批次以及适当的对照载体至关重要。此外，将大鼠头部在立体定位仪中的精确固定以及坐标参数的准确确定，对于靶向黑质区域至关重要。在颅骨注射位点钻孔后，必须将针头垂直插入大鼠脑内，避免触碰任何边缘组织。注射病毒载体后，应缓慢拔出针头，以防止载体泄漏。最后，缝合完成后，应使用含1%碘的70%异丙醇对头皮进行消毒，以防止其他动物啃咬缝线。也可选用其他抗菌试剂进行替代处理。
所述方法也可用于构建基于rAAV2/7 α-SYN的帕金森病小鼠模型24在小鼠中，我们在黑质（SN）内注射 2 µl 的 rAAV 载体。与大鼠相比，小鼠的致密部（DN）对 α-SYN 过表达的敏感性似乎略低，导致神经退行性变的表现延迟。此外，大脑中的其他区域（例如 纹状体，海马体，皮层 等等。) 可作为靶点。不同脑区的坐标可在立体定位图谱中找到。坐标的优化可通过注射碳素墨水或使用编码报告基因的病毒载体来实现。.......
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披露
作者声明不存在任何实际或潜在的利益冲突。
致谢
作者感谢 Joris Van Asselberghs 和 Ann Van Santvoort 提供的出色技术协助。本研究由 IWT-Vlaanderen（IWT SBO/80020）、FWO Vlaanderen（G.0768.10）、欧盟第六框架计划“DiMI”（LSHB-CT-2005-512146）、第七框架计划研发项目 MEFOPA（HEALTH-2009-241791）、第七框架计划“INMiND”（HEALTH-F2-2011-278850）、鲁汶大学（IOF-KP/07/001、OT/08/052A、IMIR PF/10/017）以及 MJFox 基金会（靶点验证 2010）资助。A. Van der Perren 和 C. Casteels 是 佛兰德科学基金会的博士后研究员。K. Van Laere 是佛兰德科学基金会的高级临床研究员。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 8周龄雌性Wistar大鼠 | 一月 | / | 200-250 g |
| 氯胺酮（Nimatek） | 欧洲兽医动物健康 | 804132 | |
| 美托咪定（Dormitor） | Orion-Pharma / Janssen动物健康 | 1070-499 | |
| 头皮和耳部局部麻醉：Xylocaï2% 琼脂糖凝胶 | 阿斯利康 | 0137-547 | |
| 土霉素 | 辉瑞 | 0132-472 | |
| 布普鲁卡因é诺啡（Vetergesic） | Ecuphar | 2623-627 | |
| 1%碘异丙醇 | VWR | 0484-0100 | |
| 立体定向头架 | 斯托林 | / | |
| Hamilton 注射器（30 号针头 -20 毫米 -pst 2） | 汉密尔顿/过滤服务 | 7803-07 | |
| 阿替美唑（Antisedan） | Orion-Pharma/Elanco | 1300-185 | |
| rAAV A53T α-SYN 载体 | LVVC，鲁汶大学 | / | https://gbiomed.kuleuven.be/chinese/research/50000715/laboratory-of-molecular-virology-and-gene-therapy/lvvc/ |
| 戊巴比妥钠（Nembutal） | Ceva Santé Animaleé | 0059-444 | |
| 切片机 | 微米 | HM650 | |
| 兔多克隆突触核蛋白抗体 | Chemicon | 5038 | 1:5,000 |
| 兔多克隆 TH 抗体 | Chemicon | 152 | 1:1,000 |
| 基于硅酸镥探测器的FOCUS 220断层扫描仪 | 西门子/康科德微系统公司 | / | |
| 放射性配体：18F-FECT | 内部 | / | |
| L-多巴：Prolopa 125 | 罗氏 | 6 mg/kg 腹腔注射 | |
| DMEM，Glutamax | Life Technologies | N° 31331-093 | |
| 胎牛血清 | Life Technologies | N° 10270-106 | |
| 25 kD 线性聚乙烯亚胺（PEI） | Polysciences | / | |
| OptiPrep 密度梯度介质：碘克沙醇 | Sigma | D1556-250ML | |
| Optimen | Life Technologies | N° 51985-026 | |
| Paxinos 第一卷 Watson 立体定位图谱，第四版 | 爱思唯尔 | / |
参考文献
- Magen, I., Chesselet, M. F. Genetic mouse models of Parkinson's disease The state of the art. Prog Brain Res. 183, 53-87 (2010).
- Masliah, E., et al. Dopaminergic loss and inclusion body formation in alpha-synuclein mice: implic....
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重印与许可
