本文描述了病毒载体介导的局部基因递送如何为在中枢神经系统中表达外源基因提供一种有效的方法。该方案概述了在大鼠黑质内注射病毒载体以建立基于病毒载体的帕金森病动物模型所需的全部关键步骤。
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摘要
摘要
为了研究帕金森病（PD）的分子通路并开发新的治疗策略，科研人员依赖于动物模型。与帕金森病相关基因的发现推动了遗传性帕金森病模型的发展。大多数转基因α-SYN小鼠模型会逐渐出现α-SYN病理改变，但缺乏明显的多巴胺能细胞丢失以及多巴胺依赖性行为缺陷。这一难题通过使用过表达帕金森病相关基因的病毒载体直接靶向黑质得以解决。利用病毒载体进行局部基因递送，为在中枢神经系统中表达外源基因提供了一种有效的方法。可特异性靶向特定脑区（e.g. 黑质），可在成年动物中诱导基因表达，并实现高水平的表达。此外，还可采用基于不同病毒的多种载体系统。本实验方案详细阐述了在大鼠黑质中进行病毒载体注射以建立基于病毒载体的α-突触核蛋白帕金森病动物模型的全部关键步骤。
引言
为了研究帕金森病（PD）的病理生理机制并开发新的治疗策略，迫切需要建立能够紧密模拟人类帕金森病神经病理学、生理学及运动症状的动物模型。动物模型的预测价值越高，就越有助于将新疗法从动物模型成功转化应用于患者。
1997年发现α-突触核蛋白（α-SYN）是首个PARK基因，由此推动了首批遗传性帕金森病（PD）模型的建立。在过去十年中，已成功构建了多种过表达人源野生型（WT）或突变型（A30P、A53T）α-SYN的转基因小鼠模型。研究表明，α-SYN的过表达水平在病理发展过程中起着关键作用。此外，小鼠品系、内源性α-SYN的存在与否，以及所表达的是全长形式还是截短形式，均具有影响（详见Magen和Chesselet1的综述）。在转基因小鼠中过表达野生型及多种临床突变型人源α-SYN，均可导致α-SYN的病理性聚集和神经元功能障碍2-6。然而，迄今为止，大多数α-SYN转基因小鼠模型均未能表现出明显的多巴胺能神经元丢失以及多巴胺依赖性行为缺陷。
这一难题通过使用过表达α-突触核蛋白（α-SYN）的病毒载体直接靶向黑质（substantia nigra, SN）而得以克服。病毒载体来源于病毒，能够高效感染细胞，将遗传物质整合到宿主基因组中，并迫使宿主细胞复制病毒基因组以产生新的病毒颗粒。病毒可被改造为不能复制的病毒载体，但仍保留进入细胞和导入基因的能力。通过删除病毒基因组的部分序列，并用目的基因替代，该载体可在宿主细胞中实现单轮感染而不发生复制，通常称为“转导”（transduction）。病毒载体既可用于基因过表达，也可用于基因沉默。所表达的外源基因可以是报告蛋白（例如绿色荧光蛋白或萤火虫荧光素酶）7、用于基因治疗的治疗性蛋白8–10，或如本文所关注的，用于疾病建模的疾病相关蛋白11–14。
病毒载体介导的基因递送为在中枢神经系统中表达外源基因提供了一种具有多种优势的替代方法。通过局部递送外源基因，可靶向特定脑区。此外，可在成年期诱导外源基因表达，从而降低发育过程中出现代偿机制的风险。同时，可在不同物种和品系中构建模型。最后，可轻松组合不同的外源基因。利用病毒载体可实现高水平的外源基因表达，这一点可能至关重要，因为疾病的发生时间和严重程度通常依赖于过表达的水平。
基于不同病毒的多种载体系统已被开发出来。载体系统的选择取决于目的基因的大小、所需基因表达的持续时间、靶细胞类型以及生物安全问题。对于脑内的稳定基因转移，目前认为慢病毒（LV）和重组腺相关病毒（rAAV）载体是首选的载体系统，因为它们能够在啮齿类动物脑内实现高效且长期的基因表达。为了特异性靶向黑质中的多巴胺能神经元（DN），由于rAAV载体具有更高的滴度和对DN更高的转导效率，已逐渐取代了LV载体。
目前可用的最佳基于α-SYN的啮齿类动物模型是通过结合使用新型AAV血清型（rAAV 1、5、6、7、8）以及优化的载体构建体、滴度和纯度而开发的15,16。载体滴度及载体纯度直接影响模型的表型结果。过高的载体滴度或纯度不足的载体批次可能导致非特异性毒性。因此，合适的对照载体不可或缺。在病毒载体的生产、放大和纯化流程中投入大量时间也被证明对于获得可重复且高质量的载体批次至关重要。
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方案
所有动物实验均按照1986年11月24日欧洲共同体理事会指令（86/609/EEC）进行，并已获得比利时鲁汶大学生物伦理委员会的批准。
1. 重组腺相关病毒的生产与纯化
注意：rAAV 载体的生产和纯化由鲁汶病毒载体中心（LVVC）按照先前所述方法完成17。
- 简而言之，使用25 kDa线性聚乙烯亚胺（PEI）转染液（含150 nM NaCl）及DMEM培养基（含2%胎牛血清），以1:1:1的比例对低传代（<50代）、亚融合状态的贴壁HEK 293T细胞进行转染。在37 °C、5% CO2条件下孵育24小时后，更换为新鲜的DMEM培养基（含2%胎牛血清）。
注意：所用质粒包括AAV7血清型的包装质粒、携带在CMVie增强型突触素1启动子控制下表达人源A53T突变型α-SYN的AAV转移质粒，以及pAdvDeltaF6腺病毒辅助质粒17。 - 在瞬时转染后第5天收集培养上清，并采用切向流过滤法进行浓缩17。
- 利用碘克沙醇阶梯梯度离心法从浓缩后的上清中纯化重组AAV（rAAV）病毒颗粒17。
- 采用实时定量PCR标准技术测定基因组拷贝数（GC）。本方案中，使用3.0 E11 GC/ml的病毒滴度构建基于α-SYN的帕金森病大鼠模型17。
2. 大鼠黑质中rAAV α-SYN载体的立体定位注射（图2）
- 将约200-250 g重的八周龄雌性Wistar大鼠饲养在12小时光照/12小时黑暗的正常循环条件下，自由摄取颗粒饲料和自来水。
- 对大鼠进行腹腔注射（i.p.）麻醉，麻醉剂为氯胺酮（60 mg/kg）和美托咪啶（0.4 mg/kg）的混合液。当大鼠已麻醉且挤压各足爪均无反应时，使用微型应答器植入器在其背部皮下植入微型应答器，以便后续识别。检查微型应答器是否定位正确，并能被读取设备正常读取。
- 剪除头顶部的毛发，在头皮和耳朵部位涂抹局部麻醉剂。在层流罩内采用无菌技术进行后续手术操作。
- 使用两个耳杆、一个口部固定器和一个鼻部固定器将大鼠固定于立体定位仪中。用纸毯覆盖大鼠身体，防止体温下降。涂抹眼用润滑剂以防止眼睛干燥。
- 用70%异丙醇中含1%碘伏消毒头皮，并沿中线做一小切口。轻轻刮除颅骨表面的膜状组织，并用生理盐水冲洗。让颅骨干燥数分钟。观察颅骨缝线及两个解剖参考点：前囟（Bregma）和后囟（Lambda）。
- 为将rAAV载体注射至黑质（SN），需以前囟为参考点确定坐标（前后向：5.3 mm；内外向：2.0 mm；背腹向：7.2 mm，自硬脑膜起计算）。
注意：可通过大鼠脑立体定位图谱，以前囟作为解剖参考点，计算出各目标区域的三维坐标。 - 用rAAV载体填充10 µl微量注射器（30号，20 mm），并将其安装至连接电动微量注射泵的立体定位装置上。通过释放一滴载体液体来校准注射体积，并将其滴入pH为9的多效清洗消毒剂（例如 RBS）中清除。
- 目视检查头部是否在头架中保持正直，并评估左右轴线。仔细目测前囟和后囟的前后向与内外向坐标，并使用立体定位仪背腹向臂上的30号20 mm针头测量其高度。
- 前囟与后囟之间的高度差不得超过0.3 mm。将针头重新置于前囟位置，并通过调节立体定位仪的前后向和内外向臂来设定前后向与内外向坐标。
- 在注射位点测量颅骨高度，确保其与前囟高度相差不超过0.3 mm。用直径约2 mm的钻头在颅骨上钻孔。测量硬脑膜的高度，作为设定背腹向坐标的参考值；也可采用固定的颅骨厚度值（0.9 mm）进行减除估算。
- 使用26号针头穿破硬脑膜，并用无菌纱布吸除血液。等待直至出血完全停止后再继续操作。
- 将预先装有载体溶液的10 µl微量注射器缓慢插入脑内至预定深度（背腹向坐标）。针头留置1分钟。使用电动微量注射泵以0.25 µl/min的速度注射3 µl载体溶液（3.0 E11 基因组拷贝/ml（中等剂量）或1.0 E12 GC/ml（高剂量）的rAAV2/7 α-SYN 或 eGFP对照载体）。
- 注射完成后，将针头留置5分钟后再缓慢拔出。使用涂层编织聚酯缝线（3.0）缝合头皮，用70%异丙醇中含1%碘伏消毒，然后小心将动物从立体定位仪中取出。先松开鼻部和口部固定器，再松开两个耳杆。
- 为逆转麻醉效果，向大鼠腹腔注射0.5 mg/kg阿替美唑，并将其置于38 °C加热板上的清洁笼盒中直至苏醒。用纸毯覆盖大鼠以防止体温下降。
- 术后最初几小时内应确保食物和水易于获取。在最初几天内密切观察大鼠状态，必要时给予镇痛处理。
注意：无需拆除头皮缝线。1-2周后颅骨完全愈合，缝线会自行脱落。
3. 采用非侵入性PET成像、行为学测试和免疫组织化学分析评估rAAV2/7 α-SYN注射大鼠
- 为在单个动物体内无创地长期追踪黑质纹状体多巴胺能神经变性的动力学过程，可使用小动物正电子发射断层扫描（PET）结合多巴胺转运体（DAT）示踪剂，对多巴胺转运体（DAT）结合进行定量分析 例如 [18F]-FECT16.
- 为检测多巴胺能神经变性程度是否足以诱导大鼠出现运动功能障碍，对大鼠进行圆筒实验以评估其自发前肢使用情况。
- 将大鼠放入一个20 cm宽的透明玻璃圆筒中，记录其沿筒壁垂直运动及后肢站立后着陆时的行为视频。记录每只前肢接触筒壁的次数，总计20次接触。有关评分标准的详细描述参见Schallert 等18 表达受损前肢接触次数（例如 左前爪接触次数占双侧前肢总接触次数（左前爪加右前爪）的百分比。
注意：未损伤的对照组大鼠应双侧前肢使用均衡，其得分在此测试中应约为50%。
- 将大鼠放入一个20 cm宽的透明玻璃圆筒中，记录其沿筒壁垂直运动及后肢站立后着陆时的行为视频。记录每只前肢接触筒壁的次数，总计20次接触。有关评分标准的详细描述参见Schallert 等18 表达受损前肢接触次数（例如 左前爪接触次数占双侧前肢总接触次数（左前爪加右前爪）的百分比。
- 进行免疫组织化学（IHC）分析，以评估转基因表达水平及多巴胺能细胞的丢失情况。
- 在不同终点时间点，通过腹腔注射过量戊巴比妥钠（60 mg/kg，i.p.）处死大鼠，随后进行心脏灌注，先用冷生理盐水灌注，再用含4%多聚甲醛的PBS溶液灌注19. 在4 °C下过夜固定脑组织，使用振动切片机切割50 µm厚的冠状脑切片。
- 使用抗α-SYN和酪氨酸羟化酶抗体对游离切片进行免疫组化染色，以分析α-SYN表达水平及神经退行性变程度16.
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结果
实验的整体方案如图1所示
rAAV 2/7 介导的 A53T α-SYN 过表达可诱导多巴胺依赖性运动功能障碍。
为了检测 α-SYN 过表达水平是否足以在大鼠中诱导运动功能障碍，我们对大鼠进行了筒壁实验，以评估其自发前肢使用情况（图 3A）。自注射后第 3 周起，接受 3.0 E11 GC/ml 剂量 A53T α-SYN rAAV2/7 载体的大鼠出现显著的运动功能障碍。注射后第 4 周，其自发对侧（左侧）前爪使用率下降了 50%，而对照组注射 eGFP rAAV2/7 载体的大鼠则未表现出前爪使用不对称性（图 3B）。接受更高剂量 A53T α-SYN rAAV2/7 载体的大鼠在注射后第 29 天表现出更明显的前爪使用障碍（下降 70%）（图 3C）。为了证实所观察到的...
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讨论
实验方案中包含若干关键步骤。载体滴度以及载体纯度会直接影响模型的表型结果。过高的载体滴度或纯度不足的载体批次可能导致非特异性毒性。因此，使用高质量的载体批次以及适当的对照载体至关重要。此外，将大鼠头部在立体定位仪中的精确固定以及坐标参数的准确确定，对于靶向黑质区域至关重要。在颅骨注射位点钻孔后，必须将针头垂直插入大鼠脑内，避免触碰任何边缘组织。注射病毒载体后，应缓慢拔出针头，以防止载体泄漏。最后，缝合完成后，应使用含1%碘的70%异丙醇对头皮进行消毒，以防止其他动物啃咬缝线。也可选用其他抗菌试剂进行替代处理。
所述方法也可用于构建基于rAAV2/7 α-SYN的帕金森病小鼠模型24在小鼠中，我们在黑质（SN）内注射 2 µl 的 rAAV 载体。与大鼠相比，小鼠的致密部（DN）对 α-SYN 过表达的敏感性似乎略低，导致神经退行性变的表现延迟。此外，大脑中的其他区域（例如 纹状体，海马体，皮层 等等。) 可作为靶点。不同脑区的坐标可在立体定位图谱中找到。坐标的优化可通过注射碳素墨水或使用编码报告基因的病毒载体来实现。...
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披露
作者声明不存在任何实际或潜在的利益冲突。
致谢
作者感谢 Joris Van Asselberghs 和 Ann Van Santvoort 提供的出色技术协助。本研究由 IWT-Vlaanderen（IWT SBO/80020）、FWO Vlaanderen（G.0768.10）、欧盟第六框架计划“DiMI”（LSHB-CT-2005-512146）、第七框架计划研发项目 MEFOPA（HEALTH-2009-241791）、第七框架计划“INMiND”（HEALTH-F2-2011-278850）、鲁汶大学（IOF-KP/07/001、OT/08/052A、IMIR PF/10/017）以及 MJFox 基金会（靶点验证 2010）资助。A. Van der Perren 和 C. Casteels 是 佛兰德科学基金会的博士后研究员。K. Van Laere 是佛兰德科学基金会的高级临床研究员。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 8周龄雌性Wistar大鼠 | 一月 | / | 200-250 g |
| 氯胺酮（Nimatek） | 欧洲兽医动物健康 | 804132 | |
| 美托咪定（Dormitor） | Orion-Pharma / Janssen动物健康 | 1070-499 | |
| 头皮和耳部局部麻醉：Xylocaï2% 琼脂糖凝胶 | 阿斯利康 | 0137-547 | |
| 土霉素 | 辉瑞 | 0132-472 | |
| 布普鲁卡因é诺啡（Vetergesic） | Ecuphar | 2623-627 | |
| 1%碘异丙醇 | VWR | 0484-0100 | |
| 立体定向头架 | 斯托林 | / | |
| Hamilton 注射器（30 号针头 -20 毫米 -pst 2） | 汉密尔顿/过滤服务 | 7803-07 | |
| 阿替美唑（Antisedan） | Orion-Pharma/Elanco | 1300-185 | |
| rAAV A53T α-SYN 载体 | LVVC，鲁汶大学 | / | https://gbiomed.kuleuven.be/chinese/research/50000715/laboratory-of-molecular-virology-and-gene-therapy/lvvc/ |
| 戊巴比妥钠（Nembutal） | Ceva Santé Animaleé | 0059-444 | |
| 切片机 | 微米 | HM650 | |
| 兔多克隆突触核蛋白抗体 | Chemicon | 5038 | 1:5,000 |
| 兔多克隆 TH 抗体 | Chemicon | 152 | 1:1,000 |
| 基于硅酸镥探测器的FOCUS 220断层扫描仪 | 西门子/康科德微系统公司 | / | |
| 放射性配体：18F-FECT | 内部 | / | |
| L-多巴：Prolopa 125 | 罗氏 | 6 mg/kg 腹腔注射 | |
| DMEM，Glutamax | Life Technologies | N° 31331-093 | |
| 胎牛血清 | Life Technologies | N° 10270-106 | |
| 25 kD 线性聚乙烯亚胺（PEI） | Polysciences | / | |
| OptiPrep 密度梯度介质：碘克沙醇 | Sigma | D1556-250ML | |
| Optimen | Life Technologies | N° 51985-026 | |
| Paxinos 第一卷 Watson 立体定位图谱，第四版 | 爱思唯尔 | / |
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