本文介绍了一种用于检测和定量马呼吸道分泌物中EHV-2 DNA的定量PCR方法的建立与验证方案。EHV-2 qRT-PCR的验证流程包括三个部分：方法建立、qRT-PCR检测体系的单独表征，以及整个分析方法的全面表征。
本文内容
摘要
摘要
本方案描述了一种根据NF U47-600标准，利用定量RT-PCR方法检测和定量马呼吸道样本中EHV-2的实验流程。在完成方法开发和初步验证后，依据AFNOR标准进行了两个独立的表征步骤：（a）单独对qRT-PCR检测进行表征；（b）对整个分析方法进行表征。整个分析方法的验证涵盖了从核酸提取到最终PCR分析之间所有步骤的全面评估。
为了准确测定病毒基因组载量，对整个方法进行验证在通过qRT-PCR检测病毒时至关重要。由于提取步骤是生物材料损失的主要来源，因此可被视为不同实验方案之间定量误差的主要来源。基于此原因，AFNOR标准NF-U-47-600建议在提取步骤之前加入质粒稀释梯度。此外，定量限取决于病毒提取来源。以国际单位（IU）表示的病毒基因组载量结果更便于不同实验室之间的结果比较。
这种qRT-PCR表征的新方法应有助于实现实验室之间数据呈现和解释的标准化。
引言
马疱疹病毒-2（EHV-2）与一种呼吸系统综合征相关，可能的临床表现包括鼻腔分泌物、咽炎和淋巴结肿大1-3。该病毒还被认为与马匹运动性能下降有关，可能对马业造成显著的负面经济影响2。
迄今为止，γ-疱疹病毒（γ-EHV）检测的金标准是细胞培养法。该方法的第一个缺陷是无法区分EHV-2与其他γ-EHV例如， EHV-5）。第二个问题是细胞病变过程发展缓慢，通常需要12至28天才能显现4,5.
建立经过验证且标准化的定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）方法，将有助于快速检测病毒，区分马疱疹病毒2型（EHV-2）与马疱疹病毒5型（EHV-5），并借助其定量特性研究病毒基因组载量与疾病之间的关系。
聚合酶链式反应（PCR）由Mullis于1986年首次描述6，现正成为生物诊断领域（人类、环境和兽医）新的金标准。该方法基于对病原体基因组特定片段的扩增，具有诸多优势：特异性强、灵敏度高、反应迅速。此外，随着实时荧光定量逆转录PCR（qRT-PCR）技术的出现以及质量保证体系的建立，扩增产物污染的风险已显著降低7。然而，要使PCR被认可为新的金标准方法，仅靠性能的提升尚不足够，还必须证明整个方法在开发与验证过程中各环节均得到有效控制，且其性能在长期使用中不会下降。
最初用于检测马疱疹病毒2型（EHV-2）的分子工具耗时较长，需采用套式PCR进行非特异性扩增，随后进行测序8。针对疱疹病毒的靶基因包括脱氧核糖核酸（DNA）聚合酶基因和DNA包装基因9。然而，套式PCR存在较高的扩增子污染风险。此后，已设计出常规PCR检测方法，用于扩增白细胞介素10样基因或糖蛋白B基因，相关研究在2009年已有综述2。近年来，已有研究描述了用于EHV-2定量检测的实时PCR特性10，但尚无关于包含提取步骤在内的整个方法学验证的完整数据报道。
本方案描述了根据相关标准建立和验证一种用于检测和定量马呼吸道液体中EHV-2 DNA的定量PCR方法的步骤 法国标准化协会 （法国标准化协会）标准 NF U47-6003,11,12，即国际标准化委员会的法国代表。该标准详细说明了 "兽用PCR在动物健康分析方法中实施、开发与验证的要求和建议"11,12，依据 NF EN ISO/CEI 17025:200513 以及世界动物卫生组织（OIE）2010年建议14EHV-2 的 qRT-PCR 验证方案包括三个部分：（a）建立 qRT-PCR 检测方法，（b）单独表征 qRT-PCR 检测性能，以及（c）对整个分析方法（从生物样本中提取核酸至 PCR 分析）进行表征。
对qRT-PCR检测及整个分析方法的表征包括两个限值的确定：检出限（LOD）和定量限（LOQ）。LOD95% PCR 表示在95%的情况下能够检测到的每单位体积最低核酸拷贝数。LOQ95% PCR 表示在考虑不确定度的前提下可测定的最低核酸拷贝数量。
该qRT-PCR方法可实现对呼吸道液体中EHV-2的精确定性和快速定量。此外，该方法可在其他实验室推广应用，以确保操作流程的标准化，并可作为开发其他新型qRT-PCR检测方法的通用模板。
方案
注意：请参考 图1 中所示的所有不同步骤。
1. 核酸提取
注意：应在通风橱内进行提取操作，以限制核酸对呼吸道的污染。使用经DEPC处理的水作为空白提取对照，以确保所用试剂未被外源DNA污染。
- 根据先前描述的方案15和制造商说明书，从生物样本中提取核酸。
- 将140 µl生物样本加入560 µl裂解液（AVL缓冲液）中，在室温下孵育10分钟。加入560 µl乙醇。取上述溶液（样本+裂解液+乙醇）的前630 µl加入硅胶柱中，并进行离心。
- 将剩余的630 µl溶液加入同一硅胶柱中，离心。随后用500 µl两种不同的洗涤缓冲液（AW1和AW2）清洗硅胶柱。
- 用50 µl洗脱缓冲液（AVE缓冲液）洗脱核酸，并平衡至室温。盖紧管盖，在室温下孵育1分钟。在6,000 g下离心1分钟。
2. 扩增程序
- 为每个反应配制 22.5 µl 反应混合液。向其中加入 12.5 µl PCR 预混液、x µl 20 µM 正向引物、x µl 20 µM 反向引物、y µl 10 µM 探针，以及 z µl 超纯水，使总体积达到 22.5 µl（x、y 和 z 的体积通过滴定确定，参见第 3.2.3 和 3.2.6 节）。
- 将适量的反应混合液各 22.5 µl 分装至 96 孔板的各个反应孔中。
注意：应设置提取阴性对照和 PCR 阴性对照，以确保所用试剂未被非目标 DNA 污染。 - 向对应的反应孔中分别加入 2.5 µl 待测样本、2.5 µl 提取阴性对照、2.5 µl PCR 阴性对照以及 2.5 µl 阳性样本（参考菌株或质粒）。加样完成后，用粘性封板膜密封反应板，并在 6,000 g 离心 10 秒。
- 将反应板放入实时荧光定量 PCR 系统中。选择合适的检测布局模板并启动运行程序。PCR 程序设置如下：95 °C 预变性 10 分钟，随后进行 45 个循环，每个循环包括 95 °C 变性 15 秒和 60 °C 退火延伸 1 分钟（表 1）。
- 将实时荧光定量 PCR 系统中的原始数据导出至电子表格。在扩增曲线图中，将阈值设定在基线以上且处于指数增长区域，以获得各样本的阈值循环数（Ct 值）。将每组标准品点绘制为标准曲线，评估线性关系，并根据标准曲线计算各样本的拷贝数。
3. 定量RT-PCR的建立
注意：qRT-PCR 检测方法的建立需要参考毒株、特异性定量质粒、多种对照，并需对引物和探针进行滴定。
- 初步测试
- 根据先前的建议16，使用特定软件设计引物和探针。
- 按照第1节所述方法提取参考菌株。
- 按照第2节所述进行扩增，引物终浓度为900 nM，探针终浓度为250 nM。按照第2.5节所述分析信号。
- 同时，对参考菌株DNA（如第3.1.3节所述）进行无探针的扩增。采用Sanger法对获得的扩增产物进行测序17,18。通过运行核苷酸BLAST19分析序列。
- 引物与探针的滴定
- 配制3种不同的反应体系，每种体系中探针终浓度为250 nM，正向与反向引物的终浓度分别为50 nM/50 nM、300 nM/300 nM和900 nM/900 nM，每种条件设3个阳性样本重复及1个阴性对照。对于每种体系，加入相应体积的20 µM正向引物和20 µM反向引物（0.25 µl以获得50 nM终浓度，1.5 µl以获得300 nM终浓度，或4.5 µl以获得900 nM终浓度），50 µl PCR预混液，2.5 µl 10 µM探针，并用超纯水补足至90 µl。
- 按照第2节所述进行扩增操作。
- 选择扩增水平最高、循环阈值（Ct）最早出现且3种条件下重复性最佳的条件。确定最佳引物浓度及其对应体积x µl。
- 针对4个样本（3个阳性样本重复及1个阴性对照），配制5种不同反应体系，探针终浓度分别为50 nM、100 nM、150 nM、200 nM和250 nM。对于每种体系，加入先前确定的x µl 20 µM正向引物和x µl 20 µM反向引物（已在第3.2.3节中确定），50 µl PCR预混液，适当体积的10 µM探针（0.5 µl以获得50 nM浓度，1 µl以获得100 nM浓度，1.5 µl以获得150 nM浓度，2 µl以获得200 nM浓度，或2.5 µl以获得250 nM浓度），并用超纯水补足至90 µl。
- 按照第2节所述进行扩增操作。
- 选择扩增水平最高、循环阈值（Ct）最早出现且5种条件下重复性最佳的条件。确定最佳探针浓度及其对应体积y µl。
4. 定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）的表征
注意：在完成扩增步骤并确定最佳使用条件后，qRT-PCR 的表征步骤包括特异性、检测下限、线性范围以及定量下限。
- 质粒的制备与滴定
- 订购含有PCR所选目标基因相关DNA片段的商用质粒（在本方案中，为EHV-2糖蛋白B基因的核苷酸2081-2381，参见 表1).
注意：为降低气道被合成DNA污染的风险，应在独立房间的通风橱内进行质粒的系列稀释，并在方法开发与验证过程的所有步骤中使用稀释后的DNA。 - 用超纯水重悬质粒，配制浓度为 50 ng/ml 的储备液。充分涡旋振荡质粒储备液后短暂离心。
注意：在重悬后测定质粒储存液的实际浓度，以计算质粒的拷贝数。 - 添加 1 µl 将质粒加入分光光度计。在230 nm、260 nm和280 nm处读取光密度（OD）。通过分光光度计软件读取DNA浓度（OD，260 nm）。
- 使用阿伏伽德罗常数计算质粒的拷贝数NA）以及公式：
拷贝数/µl = (NA [质粒，单位为 ng/µl])/(质粒长度 × 109 x 碱基对的平均质量）=（6,022 x 1023 x [质粒])/(质粒长度 x 109 x 660
- 订购含有PCR所选目标基因相关DNA片段的商用质粒（在本方案中，为EHV-2糖蛋白B基因的核苷酸2081-2381，参见 表1).
- 检测qRT-PCR的特异性（包容性与排他性）
- 检测PCR体系的包容性。选择先前通过测序鉴定为EHV-2阳性的DNA样本（已确认阳性状态）。
- 按照第2节所述进行扩增操作。
- 按照第2.5节所述方法分析每个样本的PCR数据。检查第4.2.1节所选所有样本是否存在指数扩增曲线，并确认PCR的包容性。
- 使用与目标病原体具有遗传相似性的病原体DNA提取物（在本例中为EHV-1、EHV-4、EHV-3、EHV-5以及驴疱疹病毒-5，具体如文中所述）检测PCR体系的特异性 表2）以及与宿主呼吸道疾病相关的其他病原体（本例中为马动脉炎病毒、马流感病毒， 贝氏柯克斯体，马红球菌，马链球菌马亚种, 马链球菌兽疫亚种，流产亲衣原体 和 肺炎克雷伯菌, 见 表2).
- 按照第2节所述进行扩增操作。
- 按照第2.5节所述方法分析每个样本的PCR数据。检查第4.2.4节所选所有样本是否存在指数扩增曲线，以确认PCR反应的特异性。
- qRT-PCR 的检测限
- 分配 90 µl 将超纯水加入6个管中。
- 进行质粒的6次十倍梯度稀释，以确定扩增信号消失的区间（Ct值检测不到）。转移 10 µl 从质粒工作稀释液转移到含有 90 µl 超纯水。涡旋振荡并短暂离心该离心管。重复步骤4.3.2，直至系列稀释中的最后一个离心管均加入质粒。
- 按照第2节所述，对质粒的6个十倍系列稀释液进行扩增。
- 确定消除区：质粒呈现阳性信号的最后稀释度与首次未检测到信号的稀释度之间的区域（参见 图2).
- 开始进行6次六倍梯度稀释时，选择质粒的最后一次稀释液，该稀释液应能产生阳性信号（参见第4.3.4节）。
注意：进行3次独立实验以确定qRT-PCR的检测下限（LOD）95% PCR) - 分配 25 µl 将超纯水加入6个管中。
- 对质粒进行6次两倍连续稀释。转移 25 µl 从第4.3.5节确定的质粒工作稀释液中，加入至含有 25 µl 超纯水。涡旋振荡并短暂离心该离心管。重复步骤4.3.7，直至系列稀释中的最后一支离心管加入质粒。
- 对质粒的6个两倍系列稀释样本进行扩增，具体步骤如第2节所述。重复步骤4.3.7至4.3.8两次，以获得每个质粒6个十倍系列稀释样本的3次试验，每次试验包含8个复孔（共24个复孔）。
注意：qRT-PCR 的检测下限（LOD95% PCR) 定义为在95%的情况下可检测到的每单位体积最低DNA拷贝数。 - 计算每个质粒浓度水平下24个重复样本中的阳性重复数。
- 确定检测限95% PCR. 检出限95% PCR 即在24个重复样本中检测到23个阳性样本的水平。
- qRT-PCR 的线性范围与定量限
注意：对质粒进行4次独立实验，每次设置6个10倍系列稀释浓度，以确保所用浓度范围中的最低浓度对应检测限（LOD）95% PCR 在4.3.10中先前已确定- 分配 45 µl 6 支管中各加入超纯水。
- 从质粒工作稀释液的浓度开始进行6次十倍系列稀释，该浓度对应于107 检测限95% PCR
- 对质粒进行6次十倍倍比稀释。转移 5 µl 从质粒工作稀释液（由第4.4.2节确定）加入至含有 45 µl 超纯水。涡旋振荡并短暂离心该离心管。重复步骤4.4.3，直至系列稀释中的最后一个离心管均加入质粒。
- 按照第2节所述，对质粒进行6个十倍梯度稀释并进行扩增。
- 追踪线性回归 y = ax + b 与 a 斜率 b 截距图3).
- 根据斜率计算扩增效率（E） a 标准曲线（见4.4.5）的方程：
.
重复步骤 4.4.1 至 4.4.6 三次。
注意：扩增效率表示每个循环后PCR产物的增加量。理想的反应效率接近100%。在实际操作中，E（%）通常介于75%至125%之间。较高的E值可能提示非特异性产物的扩增或在连续稀释过程中存在移液误差；较低的E值也可能提示连续稀释过程中的移液误差、引物设计不佳或反应条件非最优化。 - 计算偏差（表3）。针对每个质粒水平，验证其绝对偏差值是否小于临界偏差值（0.25 log）10）。确定平均偏差和线性不确定度（ULINi）针对每个质粒水平（表3) 以评估线性回归在EHV-2 qPCR中的性能（图4). U LINi 每次测定的线性不确定度 i 质粒水平根据标准差计算（SD'i）和平均偏差。确定合并的线性度不确定度（ULINEHV-2 qPCR 的公式给出的值：
注：偏倚的可接受范围由实验室规定（通常为绝对偏倚不超过 0.25 log）10) 对应于 0.5 log 的最低值与最高值之间的差值10 （以对数为单位测量的数量）10 拷贝数）。ULIN 该数值有助于比较不同实验室qPCR的性能。 - 确定qRT-PCR的定量限（LOQ）PCR): 定量限PCR 偏差为0.25 log时的最低浓度10 用于线性范围（表3).
5. 整体分析方法的表征（从DNA提取到qRT-PCR结果）
注意：该方法的整体表征是对获得qRT-PCR数据所需所有步骤的验证（即从呼吸道样本中提取DNA（见第1节）到目标片段的扩增与定量（见第2节）。
- 使用以下公式建立 PCR 反应中的拷贝数与生物样本中存在的拷贝数之间的对应关系：
。
其中
表示 PCR 反应中质粒的拷贝数，
表示加入 PCR 混合液用于扩增的样本体积，
表示用于洗脱核酸的 Buffer AVE 体积，
表示提取样本的体积。 - 检测整个分析方法的灵敏度和特异性
注意：本节仅使用已知的 EHV-2 阳性（或阴性）样本。- 通过分析目标物（EHV-2）阳性样本，测试 qRT-PCR 方法的“灵敏度”。
- 选择先前已鉴定为 EHV-2 阳性的 DNA 样本（阳性状态）。
- 按照第 1 节所述提取核酸。按照第 2 节所述进行扩增程序。
- 确定真实阳性样本数（使用该 RT-PCR 检测为阳性的阳性样本）和假阴性样本数（已知为阳性但使用该 RT-PCR 检测为阴性的样本）。
- 通过分析阴性样本测试 qRT-PCR 方法的“特异性”
- 选择 EHV-2 阴性 DNA 样本（阴性状态）。
- 按照第 1 节所述提取核酸。按照第 2 节所述进行扩增程序。
- 确定真实阴性样本数（已知使用该 RT-PCR 检测为阴性的阴性样本）和假阳性样本数（已知为阴性但使用该 RT-PCR 检测为阳性的样本）。
- 按下述方式计算整个方法的“诊断灵敏度”（Se）和“诊断特异性”（Sp）（表 4）：Se = 真实阳性数 /（真实阳性数 + 假阴性数），Sp = 真实阴性数 /（真实阴性数 + 假阳性数）（见 表 4）。
- 使用 Greiner 和 Gardner 关系式12,20计算整个方法灵敏度和特异性的 95% 置信区间：
其中 e 为估计误差，θ 为 Se（或 Sp），n 为分析的样本数量。
注意：当样本数量较少时，应根据 AFNOR 标准12使用 Schwartz 表计算整个方法灵敏度和特异性的 95% 置信区间。
- 通过分析目标物（EHV-2）阳性样本，测试 qRT-PCR 方法的“灵敏度”。
- 为完整分析方法的表征制备阴性资源材料
警告：为确定整个方法的检测限和定量限（LODMethod 和 LOQMethod），需将已知浓度的质粒添加至已知不含目标物（本例中为 EHV-2）的生物样本中。这些样本连同已定量的质粒共同构成阳性标准品，用于确定 LODMethod 和 LOQMethod。- 确认用于构建阳性标准品的生物样本中不存在目标物（EHV-2）。
- 选择多个已知为阴性的生物样本。
- 按照第 1 节所述提取生物样本。按照第 2 节所述进行扩增程序。
- 通过这些样本中无 PCR 信号来确认目标物的缺失。
注意：在步骤 5.4 至 5.5 的所有步骤中使用相同的阴性资源材料。
- 将不同的阴性样本混合，获得 15 ml 阴性资源材料（完整验证所需的体积）。将此阴性资源材料以每管 135 µl 分装至 100 个管中。短期保存置于 +4 °C，长期保存置于 -80 °C。
- 确认用于构建阳性标准品的生物样本中不存在目标物（EHV-2）。
- 整个分析方法的检测限
- 确定整个方法的衰减区间。
- 在 6 个管中各加入 45 µl 超纯水。
- 对质粒进行 6 次十倍系列稀释。从对应于 107 LOD95% PCR 的质粒工作稀释液（如第 4.3.10 节所确定）中取 5 µl，加入含 45 µl 超纯水的管中。涡旋混匀并短暂离心。重复此步骤 5.4.1.2，直至系列稀释的最后一个管中均加入质粒。
- 从每个质粒稀释液中取 5 µl，分别加入 2 个含 135 µl 阴性资源材料的管中，以获得 6 个阳性标准品的双重复。涡旋混匀并短暂离心。
- 按照第 1 节所述对 6 个阳性标准品的双重复进行提取。按照第 2 节所述进行扩增程序。
- 确定衰减区间：即产生阳性信号的最后一个质粒浓度与首次无信号的浓度之间的区间。
- 通过两次独立试验确定方法的检测限（LOD Method）
注意：进行两次独立试验以确定整个方法的检测限（LODMethod）。- 从比产生阳性信号的最后一个质粒浓度高 4 倍的质粒工作稀释液开始，进行 6 次两倍系列稀释（见第 5.4.1.5 节）。
- 在 6 个管中各加入 25 µl 超纯水。
- 对质粒进行 5 次两倍系列稀释。从质粒工作稀释液（如第 5.4.2.1 节所确定）中取 25 µl，加入含 25 µl 超纯水的管中。涡旋混匀并短暂离心。重复此步骤 5.4.2.3，直至系列稀释的最后一个管中均加入质粒。
- 从每个质粒稀释液中取 5 µl，分别加入 4 个含 135 µl 阴性资源材料的管中，以获得 5 个阳性标准品的四重复。涡旋混匀并短暂离心。
- 按照第 1 节所述对 5 个阳性标准品的四重复进行提取。按照第 2 节所述进行扩增程序。
- 重复步骤 5.4.2.1 至 5.4.2.5 一次，以获得每个质粒浓度水平的八重复。
- 统计每个质粒浓度水平下八重复中阳性重复的数量。
- 确定 LODMethod。LODMethod 是指八重复中全部为阳性的最后一个浓度水平（如第 5.4.2.7 节所述）。
- 确定整个方法的衰减区间。
- 整个分析方法的线性范围和定量限
注意：为确定整个方法的定量限（LOQMethod），需将已知浓度的质粒添加至已知不含目标物（本例中为 EHV-2）的生物样本中。这些样本构成用于确定 LOQMethod 的阳性标准品。- 在 6 个管中各加入 45 µl 超纯水。
- 对质粒进行 6 次十倍系列稀释。从对应于 107 LODMethod 的质粒工作稀释液（如第 5.4.2.8 节所确定）中取 5 µl，加入含 45 µl 超纯水的管中。涡旋混匀并短暂离心。重复此步骤 5.5.2，直至系列稀释的最后一个管中均加入质粒。
- 从每个质粒稀释液中取 5 µl，分别加入 2 个含 135 µl 阴性生物资源材料的管中，以获得 6 个阳性标准品的双重复。涡旋混匀并短暂离心。
- 按照第 1 节所述对 6 个阳性标准品的双重复进行提取。按照第 2 节所述进行扩增程序。重复步骤 5.5.1 至 5.5.4 三次。
- 建立准确度概况，以评估和验证该方法的定量性能。
- 定义实验室对整个方法的可接受限。在本方案中，LABéO Frank Duncombe 将可接受限定义为 ± 0.75 Log10 。
- 对于一次试验，以每个标准曲线估计值对应的一个 Ct 值重复为基础，绘制第一条线性回归 y = ax+ b（a 为斜率，b 为截距）。利用此第一条线性回归，计算用于第一条标准曲线的 Ct 值重复的拷贝数实验值。对第二组 Ct 值重复重复步骤 5.5.5.2，获得第二条线性回归，并计算用于第二条标准曲线的第二组 Ct 值重复的拷贝数实验值。
- 对第二和第三次试验重复步骤 5.5.5.2。
- 根据 NF U47-600-212 计算每个质粒水平的精密度、正确度和准确度限。
- 创建电子表格，汇总所有标准点的信息（5.5.5.4），并利用先前在 5.5.5.1 中定义的可接受限、数据的正确度以及在 5.5.5.4 中计算的下限和上限准确度限，创建准确度概况（图 5）。
- 确定 LOQMethod：该值对应于线性范围计算中（5.5.5.5）正确度在 0.75 log10 以内的标准曲线的最低浓度。
- 重复性和重现性的评估
注意：通过标准偏差与重复测量均值之比（变异系数，CV = 标准偏差 / 均值）来检查重复性和重现性。- 由一名分析人员评估整个方法的重复性：
- 选择 3 个具有不同病毒基因组载量的生物样本（例如，先前已通过 PCR 检测过）。
- 按照第 1 节所述提取这 3 个样本的 8 个重复。按照第 2 节所述进行扩增程序。
- 计算每个样本所收集的 Ct 值的均值和标准偏差。
- 使用公式 CV = 标准偏差 / 均值计算批内 CV。
- 由三名分析人员评估整个方法的重现性：
- 选择 3 个具有不同病毒基因组载量的生物样本（例如，先前已通过 PCR 检测过）
- 按照第 1 节所述提取在 5.6.2.1 中选定的 3 个样本的 2 个重复。按照第 2 节所述进行扩增程序。由另外两名独立的分析人员重复步骤 5.6.2.2。
- 计算每个样本所收集的 Ct 值的均值和标准偏差。
- 使用公式 CV = 标准偏差 / 均值计算批间 CV。
- 由一名分析人员评估整个方法的重复性：
结果
如上所述，采用定量RT-PCR方法检测并定量呼吸道液体中的马疱疹病毒-2。 图1 展示了根据AFNOR标准NF U47-600建立和验证定量RT-PCR方法的示意图工作流程。在PCR逐步开发过程中，已验证引物和探针的特异性。该体系仅扩增EHV-2毒株。随后需对qRT-PCR的性能进行表征。
首先，为了估算 LODPCR，进行了6次十倍系列稀释，以确定下降区间（图2）。在本示例中，进行了从10-5到10-10的6次十倍系列稀释（相当于每2.5 µl样本中26,000至0.26个拷贝），用于估算 LODPCR。下降区间位于10-9和10-10稀释度之间（相当于每2.5 µl样本中2.6至0.26个拷贝）。为确定本例中的 LODPCR 值，在该下降区间内对质粒进行了6次两倍系列稀释，稀释范围为每2.5 µl样本中5.2至0.16个拷贝。最终确定的 LODPCR 值为每2.5 µl样本2.6个拷贝。
确定线性范围和定量限PCR，检测限PCR 用于确定2.6（LOD）之间的6个十倍系列稀释范围的起始值PCR）和 260,000 拷贝/2.5 µl 样品 图3 展示了一次试验中EHV2 qRT-PCR的线性回归结果。线性回归的性能（图4) 采用文中所述计算方法进行四次重复验证。 表3根据绝对偏倚标准计算以确定线性范围i 值 ≤0.25 log10，无论何种水平 i 质粒载量。在此情况下，线性范围介于 2.6 至 260,000 拷贝/2.5 µl 样品。定量限（LOQ）PCR 在线性范围内最低的浓度（即，2.6 拷贝/2.5 µl 样本在此情况下）。ULIN 被确定为 0.12 log10 2.6–260,000 拷贝/2.5 µl DNA
在完成qRT-PCR方法的开发（图1，蓝色）和表征（图1，黄色）之后，AFNOR NF U47-600 标准建议对从DNA提取到qRT-PCR的整个分析方法进行表征（图1，橙色）。诊断灵敏度和特异性按表4所述进行计算。qRT-PCR整个分析方法的定量性能通过准确度轮廓进行评估和验证（图5）。
本方案采用先进的分子技术，使我们能够检测并定量172份来自患有呼吸道疾病和/或临床疑似感染马匹的鼻拭子样本中的EHV-2病毒基因组载量。在该群体中，EHV-2在田间（生物）样本中的检出率为50%（86/172）。定量分析显示，EHV-2病毒基因组载量在幼龄马匹中显著更高，且病毒基因组载量的分布随年龄增长而下降（图6）。在本研究中，EHV-2病毒基因组载量最高值（1.9 × 1011 拷贝/ml）出现在幼驹中（图6）。
图1：根据AFNOR标准NF U47-600-2，定量RT-PCR的开发（蓝色）、定量RT-PCR的表征（黄色）以及从DNA提取到qRT-PCR整个分析方法的表征（橙色）的工作流程图。 该工作流程图汇总了定量RT-PCR开发、定量RT-PCR表征以及从DNA提取到qRT-PCR整个分析方法表征的各个步骤。对于每个步骤，工作流程图标明了所需运行次数、需进行的稀释梯度以及所需分析人员数量。请点击此处查看此图的放大版本。
图2：通过质粒6个10倍系列稀释样本获得的实时PCR扩增曲线代表性结果确定衰减区。为估算衰减区，将质粒进行6个10倍系列稀释，稀释范围从10-5 （26,000 拷贝/2.5 µl 样本）至10-10（0.26 拷贝/2.5 µl 样本）。衰减区位于10-9（2.6 拷贝/2.5 µl 样本）与10-10（0.26 拷贝/2.5 µl 样本）之间。本实验中，在该衰减区内对质粒进行6个2倍系列稀释，以确定LOD95%PCR，范围为5.2至0.16 拷贝/2.5 µl 样本。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：EHV2 定量反转录 PCR 的线性回归分析。 定量检测的线性关系是指检测结果在特定范围内与目标物浓度呈正比的能力。该特性可通过仪器响应值（循环阈值，Ct）与目标物数量对数值（每 2.5 µl 样本中的目标拷贝数）之间的线性回归模型（y = ax + b）进行评估。请点击此处查看该图的放大版本。
图4：EHV-2 qPCR线性回归性能。 平均偏差表示每个质粒水平下测得的质粒数量（
）与理论质粒数量（x'i）之间的平均差值。垂直条表示线性不确定度（ULINi），其计算公式为
其中 SD'i 为测得的质粒数量的标准差。请点击此处查看该图的放大版本。
图5：基于EHV-2定量逆转录PCR方法验证结果的准确度分析图。 绿色线（圆圈）代表数据的准确性（系统误差或偏差）。实验室将可接受限定义为±0.75 Log10（虚线）。每个质粒载量水平的下限和上限准确度限值由平均偏差±可靠性数据标准差的两倍确定（红线）。请点击此处查看该图的放大版本。
图 6：根据年龄对EHV-2病毒基因组载量进行定量分析。 本图展示了在鼻拭子样本中检测到的EHV-2病毒基因组载量在不同年龄组中的分布情况。水平线表示标准差范围内的中位数值（m = 月）。* 经ANOVA方差分析及Newman-Keuls事后检验，差异具有统计学意义（p <0.05）。请点击此处查看该图的放大版本。
| 目的基因 | 引物、探针及质粒序列（5'-3'） | 核苷酸位置 | 扩增产物大小（核苷酸） | 热循环条件 | 参考文献 | |||
| EHV2 gB (HQ247755.1) | 上游引物：GTGGCCAGCGGGGTGTTC | 2113-2130 | 78 | 95 °C 5 min | 11 | |||
| 下游引物：CCCCCAAAGGGATTYTTGAA | 2189-2170 | 95 °C 15 sec | 45 个循环 | |||||
| 探针：FAM-CCCTCTTTGGGAGCATAGTCTCGGGG-MGB | 2132-2157 | 60 °C 1 min | ||||||
| 质粒： ACCTGGGCACCATAGGCAAGGTGGTGGTCA ATGTGGCCAGCGGGGTGTTCTCCCTCTTTG GGAGCATAGTCTCGGGGGTGATAAGCTTTTT CAAAAATCCCTTTGGGGGCATGCTGCTCATA GTCCTCATCATAGCCGGGGTAGTGGTGGTG TACCTGTTTATGACCAGGTCCAGGAGCATAT ACTCTGCCCCCATTAGAATGCTCTACCCCGG GGTGGAGAGGGCGGCCCAGGAGCCGGGCG CGCACCCGGTGTCAGAAGACCAAATCAGGA ACATCCTGATGGGAATGCACCAATTTCAG | 2081-2381 | |||||||
表1：本实验方案中使用的引物、探针及阳性合成DNA对照的序列。 质粒（阳性合成DNA）的序列对应于EHV2gB序列（HQ247755.1）的第2081-2381位核苷酸。本方案中所用引物和探针的设计通过特定软件完成。
| 病原体 | 参考株（来源） | 菌株数量 | 结果 |
| EHV-2 | |||
| EHV-2 | VR701 (ATCC) | 20 | 阳性 |
| 20 个样本（FDL 收藏） | |||
| EHV-5 | KD05 (GERC) | 20 | 阴性 |
| 20 个样本（FDL 收藏） | |||
| EHV-3 | VR352 (ATCC) | 2 | 阴性 |
| T934 WSV (GERC) | |||
| EHV-1 | Kentucky 株 Ky A (ATCC) | 3 | 阴性 |
| 2 个样本（FDL 收藏） | |||
| EHV-4 | VR2230 (ATCC) | 1 | 阴性 |
| 驴疱疹病毒 AHV5 | FDL 收藏 | 1 | 阴性 |
| 马流感病毒 | A/马/Jouars/4/2006 (H3N8) | 1 | 阴性 |
| (登录号 JX091752) | |||
| 马动脉炎病毒 | VR796 (ATCC) | 2 | 阴性 |
| Rhodococcus equi | FDL 收藏 | 1 | 阴性 |
| Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus | FDL 收藏 | 1 | 阴性 |
| Streptococcus equi subsp. equi | FDL 收藏 | 1 | 阴性 |
| Coxiella burnetii | ADI-142-100 (Adiagene) | 1 | 阴性 |
| Chlamydophila abortus | ADI-211-50 (Adiagene) | 1 | 阴性 |
| Klebsiella pneumoniae | FDL 收藏 | 1 | 阴性 |
表2：EHV-2 qRT-PCR检测的分析特异性。
表3：偏倚和线性不确定度的计算（改编自NF U47-600-2）12)每次试验中，线性回归的性能（y = ax+b) 使用下表进行验证 y 获得循环阈值； a 为所得斜率； x 质粒水平和 b 是截距。 i 质粒水平（i 从1到 k 水平）； k 所使用的质粒水平数（例如, k = 6 在本表中） j 是该试验（j 从1到 I 试验）； I 是试验次数，介于3到6次之间（例如 I = 4 在本表中。 xi 每个质粒的估计数量 i 质粒水平 x'i 是通过方程计算得到的理论质粒数量 x'i = log10(xi) 每个 i 质粒水平。在每次 j 试验中，每个循环阈值的获得 i 质粒水平通过线性回归计算 yi,j = ajxi,j + bj. 
试验过程中测得的质粒数量 j. 偏差i 是每次试验和每个质粒水平下测得的质粒数量与理论质粒数量之间的差异。 
是……的平均值 
由每一个 i 质粒水平 SD'i 是测量量的标准偏差 
每个 i 质粒水平 平均偏差 是……的平均值 偏差i; ULINi 每次测定的线性不确定度 i 质粒水平根据以下计算得出 SD'i 和 平均偏差. 请点击此处以查看此图的放大版本。
| 样本真实状态 | |||
| 阳性 | 阴性 | ||
| 完整方法检测结果 | 阳性 | RP（真实阳性） | FP（假阳性） |
| 阴性 | FN（假阴性） | RN（真实阴性） | |
| 总计 | RP+FN | FP+RN | |
| Se = RP/(RP+FN) | Sp = RN/(RN+FP) | ||
表4：整个方法的诊断灵敏度（Se）和特异性（Sp）的计算。 采用Schwartz表，按照NF U47-600-2标准中的描述，计算整个方法的灵敏度和特异性的95%置信区间。
讨论
自2000年代以来，实时PCR技术正在越来越多的实验室中取代传统的金标准技术（如细胞培养和细菌培养方法）。该技术的实施相对简便，但为确保病原体分子检测与定量结果的准确性、可重复性和可靠性，实验室方法的验证至关重要。
由于提取步骤是生物材料损失的主要来源，因此可被视为不同实验方案之间定量误差的主要来源。因此，在qRT-PCR过程中构建DNA质粒标准曲线（文献中主要报道的方法）仅能反映病毒基因组载量，但未考虑提取步骤的影响。
在 AFNOR 标准 NF U47-600-2 中描述一种针对完整方法验证过程的de novo策略，代表了该领域的重要进展。正如本文中对马疱疹病毒2型（EHV-2）的研究，或他人在蜜蜂中的研究21所示，该策略要求明确区分方法开发阶段与验证阶段，并分别对PCR本身以及整个检测方法进行表征。这一有趣方法的一个局限性在于，任何对实验方案的修改都将导致必须重新验证整个流程，这可能带来高昂的成本。这一局限性还体现在定量限（LOQ）依赖于病毒提取来源（例如，呼吸道分泌物、器官、血液或尿液）的事实。实际上，每种基质在其理化特性方面均具有不同的特异性，因此有必要针对每种用于通过qRT-PCR进行病毒检测和定量的不同基质独立加以定义。这样，可从核酸提取阶段更精确地定量每个生物样本中的病毒基因组载量。此外，方法表征还需考虑所用热循环仪的型号；当在原实验室或其他实验室中，使用先前已充分表征的方法（例如，本文所述的EHV-2 qPCR方法）而需更换新型仪器时，必须确认该仪器的性能。qPCR检测性能的确认是所有检测引入实验室前的先决条件。通常通过分析具有已知特性的参考样本实现。此类核查是必要前提，也是AFNOR标准NF 47-600-1所要求的强制性步骤，以验证qPCR的性能指标（如检出限LOD、定量限LOQ、扩增效率）以及整个方法的稳健性（LOD、LOQ）。不仅在方法开发与表征阶段，而且在科研或诊断应用过程中，均应识别并有效控制潜在风险因素，以确保实验方案的标准化。尤其需要注意的是人员的充分培训、高资质技术人员的配备、耗材的质量控制及其储存条件、实验环境条件的监控，以及对可能影响检测所用科学仪器性能的计量学条件的认知。使用参考样本进行实验室间比对也有助于控制不确定性。通过这种方式，可促进不同实验室间数据的可比性。事实上，实验室间能力验证测试对于评估并确认方法的可重复性至关重要。
以国际单位（IU）表示的病毒基因组载量结果（IU：液体样本为拷贝数/mL，组织样本为拷贝数/g）更便于在不同实验室之间进行结果比较。所有高于定量下限（LOQ）的结果均以拷贝数/mL 表示，而介于检测下限（LOD）与定量下限（LOQ）之间的结果则视为不可定量的阳性结果。以这种方式呈现基因组的定量数据，更准确地反映了分析过程（基因组扩增）。事实上，在细胞培养实验中，通过 TCID50 （半数组织培养感染剂量） 表示病毒载量的方法依赖于细胞类型和病毒毒株的特性。每种毒株具有其独特的感染动力学，某些病毒（如 EHV-2）可能需要数天时间才会出现首次可观察到的细胞病变效应。
总之，这种qRT-PCR表征的新方法将有助于实现实验室之间数据呈现和解释的标准化。这对于qRT-PCR未来潜在的新应用将非常有用，例如建立用于判定疾病状态的阈值，而不仅仅是判断病原体的存在与否。
披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
作者感谢 Sophie Castagnet 和 Nadia Doubli-Bounoua 提供的技术支持。本工作获得了卡尔瓦多斯省议会以及下诺曼底大区与法国政府（CPER 2007-2013；项目 R25 p3）的财政支持。作者感谢法国标准化协会（AFNOR）专家组成员，特别是 Jean-Philippe Buffereau 和 Eric Dubois。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| AB-1900 天然色 ABgene 96 孔板 | Dutsher | 16924 | |
| qPCR 绝对粘性封板膜 | Dutsher | 16629 | 用于在 qRT-PCR 运行前密封反应板的粘性封膜 |
| 0.5 ml 带裙边微量离心管及管盖 | Dutsher | 039258 | |
| 98% 乙醇 | Sodipro | SAF322941000 | |
| 引物 | Eurofins | 定制订单 | |
| 探针 | Life Technologies | 定制订单 | |
| 质粒 | Eurofins | 定制订单 | |
| QIAamp 病毒RNA小量提取试剂盒 （包含：QIAamp 离心柱、AVL 缓冲液、 AW1 缓冲液、AW2 缓冲液、AVE 缓冲液、收集管） | Qiagen | 52906 | AVL 缓冲液：在 72 °C 预热 5 分钟 |
| Sanger 法测序 | Eurofins | 定制订单 | |
| TaqMan 通用 PCR 主混合液 | Life Technologies | 4364340 | |
| Tris-EDTA 缓冲液 | Santa Cruz | sc-296653A | |
| NanoDrop 2000c 分光光度计 | Thermoscientific | ND-2000C | |
| StepOnePlus 实时荧光定量 PCR 系统 | Life Technologies | 4376600 | 预热 15 分钟 |
参考文献
- Brault, S. A., et al. The immune response of foals to natural infection with equid herpesvirus-2 and its association with febrile illness. Vet.Immunol.Immunopathol. 137 (1-2), 136-141 (2010).
- Fortier, G., Van Erck, E., Pronost, S., Lekeux, P., Thiry, E. Equine gammaherpesviruses: pathogenesis, epidemiology and diagnosis. Vet.J. 186 (2), 148-156 (2010).
- Hue, E. S., et al. Detection and quantitation of equid gammaherpesviruses (EHV-2, EHV-5) in nasal swabs using an accredited standardised quantitative PCR method. J Virol.Methods. 198 (1), 18-25 (2014).
- Diallo, I. S., et al. Multiplex real-time PCR for the detection and differentiation of equid herpesvirus 1 (EHV-1) and equid herpesvirus 4 (EHV-4). Vet.Microbiol. 4 (1-3), 93-103 (2007).
- Williams, K. J., et al. Equine multinodular pulmonary fibrosis: a newly recognized herpesvirus-associated fibrotic lung disease. Vet.Pathol. 44 (6), 849-862 (2007).
- Mullis, K., et al. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol. 51 (1), 263-273 (1986).
- EPA Office of Water (4607). EPA-815-B-04-001. Quality Assurance/Quality Control Guidance for Laboratories Performing PCR Analyses on Environmental Samples. , (2004).
- Telford, E. A., et al. Equine herpesviruses 2 and 5 are gamma-herpesviruses. Virology. 195 (2), 492-499 (1993).
- Fortier, G., et al. Identification of equid herpesvirus-5 in respiratory liquids: A retrospective study of 785 samples taken in 2006-2007. Vet.J. 182 (2), 346-348 (2009).
- Brault, S. A., Bird, B. H., Balasuriya, U. B., MacLachlan, N. J. Genetic heterogeneity and variation in viral load during equid herpesvirus-2 infection of foals. Vet.Microbiol. 147 (3-4), 253-261 (2011).
- Association Francaise de Normalisation. NFU 47-600-1. Animal health analysis methods-PCR-Part 1: Requirements and recommandations for the implementation of veterinary PCR. , (2015).
- Association Francaise de Normalisation. NFU 47-600-2. Animal health analysis methods-PCR-Part 2: Requirements and recommendations for the development and the validation of veterinary PCR. , (2015).
- ISO. EN ISO-CEI 17025. General requirements for the competence of testing and calibration laboratories. , (2005).
- Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2010. Chapter1.1.1.4/ 5. Principles and Methods of Validation of Diagnostic Assay for Infectious Diseases. , This thoroughly revised chapter replaces Chapter 1.1.4 Principles of validation of diagnostic assays for infectious diseases and Chapter 1.1.5 Validation and quality control of polymerase chain reaction methods used for the diagnosis of infectious diseases from the sixth edition of the OIE Terrestrial Manual (2009).
- Apaza, S., et al. Detection and genogrouping of noroviruses from children's stools by Taqman One-step RT-PCR. J Vis.Exp. (65), e3232(2012).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis.Exp. (63), e3998(2012).
- Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol.Biol. 94 (3), 441-448 (1975).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- NCBI. BLAST Homepage and Selected Search Pages. Introducing the BLAST homepage and form elements/functions of selected search pages. , (2015).
- Greiner, M., Gardner, I. A. Application of diagnostic tests in veterinary epidemiologic studies. Prev.Vet Med. 45 (1-2), 43-59 (2000).
- Blanchard, P., Regnault, J., Schurr, F., Dubois, E., Ribiere, M. Intra-laboratory validation of chronic bee paralysis virus quantitation using an accredited standardised real-time quantitative RT-PCR method. J Virol.Methods. 180 (1-2), 26-31 (2012).
重印与许可
