利用CLARITY/CUBIC技术对小鼠脊髓中的5-羟色胺能纤维进行成像

摘要

上脊髓投射对痛觉感知及其他行为具有重要作用，其中5-羟色胺能纤维是这类纤维系统之一。本研究重点探讨将CLARITY/CUBIC联合技术应用于小鼠脊髓，以研究这些5-羟色胺能纤维的终止分布。

摘要

长距离下行纤维投射至脊髓，对运动、痛觉感知及其他行为至关重要。目前尚未在任何物种中全面研究大多数此类纤维系统的脊髓终末分布模式。投射至脊髓的5-羟色胺能纤维已在大鼠和负鼠中通过组织学切片进行研究，并基于其在脊髓内的纤维终末分布模式推断其功能意义。随着CLARITY和CUBIC技术的发展，现在有可能系统地研究该纤维系统及其在脊髓中的分布，这有望揭示5-羟色胺能上脊髓通路此前未知的特征。本文中，我们提供了一套详细的实验方案，结合使用CLARITY和CUBIC技术对小鼠脊髓中的5-羟色胺能纤维进行成像。该方法包括用羟乙基丙烯酸甲酯溶液灌注小鼠，并利用多种透明化试剂组合对组织进行透明处理。脊髓组织的透明化过程耗时略少于两周，随后针对5-羟色胺的免疫荧光染色在十天内完成。使用多光子荧光显微镜对组织进行扫描，并通过Osirix软件重建三维图像。

引言

上脊髓投射负责调控多种行为，例如痛觉感知。其中传递伤害性信息的投射包含源自后脑缝际核及其邻近网状核的5-羟色胺能纤维^1,2。生理学和药理学研究表明，电刺激后脑缝际核后，脊髓背角中5-羟色胺的释放增加^3-5。在大鼠和负鼠中，5-羟色胺能缝际脊髓纤维具有密集的终末，不仅分布于脊髓背角^6-8，还存在于中间带^7,9,10、腹角^7,11，甚至第10层^12,13。目前尚无类似的小鼠研究。本研究旨在利用近期发表的CLARITY¹⁴方法及其改良技术CUBIC¹⁵，绘制小鼠脊髓中源自后脑缝际核及其邻近网状核的5-羟色胺能纤维终止分布图谱。

传统的脊髓荧光或过氧化物酶免疫组织化学方法可清晰显示在30-40 µm厚的横切面上，脊髓灰质中5-羟色胺能纤维的分布情况。然而，该方法无法显示白质中5-羟色胺能纤维束的连续性及其在灰质中的侧支。尽管组织学切片的三维重建已推动了对纤维束的研究进展，但由于切片过程中组织产生的微小形变，组织学家和解剖学家仍难以追踪单根纤维束。为克服这一障碍，许多研究人员已开发出多种使整个组织结构透明化的方案，从而可在单个视频文件中获取未受扰动组织的完整图像^17-21。迄今为止，Deisseroth团队开发的清晰化、脂质交换、丙烯酰胺杂交刚性、适用于成像/免疫染色的组织水凝胶技术（CLARITY）^14,15，以及Susaki等人开发的CUBIC技术¹⁶，是最为成功的两种方法。自这些方案发表以来，众多研究人员已开始采用这些技术研究各种生物组织的多个方面，不仅包括脑组织^22-25，还包括心脏、肾脏、肠道和肺组织^26,27。

通过使用水凝胶溶液（CLARITY）固定小鼠脊髓，并利用CUBIC试剂进行透明化处理（该方法比原始CLARITY方案^14,15快得多），一段长2-3 mm的脊髓组织块在两周内完成透明化，且在八天内完成了5-羟色胺的免疫荧光染色。仅通过化学试剂的组合，即可利用常规免疫组织化学方法，在约一个月内获得单个纤维束的三维视频图像。

方案

伦理声明：所有涉及动物受试者的实验程序均遵循新南威尔士大学动物护理与伦理委员会（ACEC）的指导方针（批准的ACEC编号为14/94A）。

1. 透明化小鼠脊髓的制备

1. 冰上预冷水凝胶溶液的制备
   1. 16% 多聚甲醛溶液（PFA）的制备
      1. 将16 g多聚甲醛粉末加入70 ml预热的蒸馏水（50–55 °C）中，在加热磁力搅拌器上搅拌至多聚甲醛完全溶解。注意：溶液温度不得超过55 °C，且需注意多聚甲醛具有毒性。
      2. 将多聚甲醛溶液转移至量筒中，并用蒸馏水定容至100 ml。将溶液置于4 °C冰箱中冷却。
   2. 将125 mg VA-044引发剂溶于26.25 ml蒸馏水中，并将溶液置于4 °C冰箱中冷却。
   3. 将5 ml丙烯酰胺溶液（40%）、1.25 ml Bis溶液（2%）（注意：Bis和丙烯酰胺溶液具有毒性，可能引起遗传缺陷或致癌）、5 ml 10x PBS、12.5 ml 16% PFA溶液以及VA-044引发剂溶液置于冰上冷却。
   4. 在冰上混合上述溶液。
      注意：总体积为50 ml。
2. 小鼠脊髓的灌注与采集
   1. 通过腹腔注射给予小鼠氯胺酮（80 mg/kg）和赛拉嗪（5 mg/kg），用0.9%生理盐水稀释后注射。小鼠的剂量可低于大鼠。
   2. 在通风橱内的合适塑料表面上，当小鼠对足部皮肤夹捏无反应时，将其四肢固定于身体两侧（胶带固定效果良好）。
   3. 用剪刀剪开小鼠胸部皮肤，再剪开胸骨以暴露心脏。
   4. 使用蠕动泵，将连接在管路末端的25 G针头插入心脏左心室，剪开右心房以形成血液流出通道，随后以约10 ml/min的速度用40 ml 0.9%生理盐水进行灌注清洗。
   5. 清洗完成后，用35 ml冰上预冷的水凝胶溶液对小鼠进行灌注。
      注意：灌注速度应控制在10 ml/min，以避免神经组织肿胀。
   6. 用刀片切开背部皮肤，去除脊柱周围的肌肉组织。在一侧剪开椎弓并将其翻向另一侧，用精细剪刀取出脊髓。
3. 小鼠脊髓的透明化处理
   1. 将脊髓置于15 ml水凝胶溶液中，在4 °C条件下孵育过夜。
   2. 移除10 ml水凝胶溶液，将剩余溶液连同脊髓节段转移至5 ml离心管中，并加满水凝胶溶液至完全充满。
   3. 用一小片封口膜覆盖5 ml离心管管口，再用封口膜包裹管口颈部。注意：确保封口膜与水凝胶溶液接触，且水凝胶溶液与封口膜之间无气泡。
   4. 将5 ml离心管置于37 °C烘箱中过夜。观察水凝胶溶液直至其完全凝胶化。
   5. 从烘箱中取出5 ml离心管，用扳手（如铲形1 ml移液器吸头）将凝胶从管中取出。通过将粗糙组织粘附于凝胶上，再将组织移除，从而将凝胶从脊髓组织上剥离（凝胶会粘附于组织上，因此随组织一同被移除）。
   6. 将凝胶从脊髓组织上移除后，在摇床上用1x PBS（pH 7.4）清洗脊髓组织，每次24小时，共清洗4次。
   7. 通过将3.85 g尿素和3.85 g N,N,N',N'-四(2-羟丙基)乙二胺溶于5.38 ml蒸馏水中，配制CUBIC透明化溶液。
      注意：使用加热搅拌器。待溶液澄清并冷却至室温后，加入2.31 g聚乙二醇单对异辛基苯基醚/Triton X-100。
      注意：上述三种化学试剂每种10 g适用于一只小鼠。
   8. 用剃须刀片将小鼠脊髓冠状切成2–3 mm长的节段，放入5 ml上述CUBIC透明化溶液中。置于37 °C烘箱内的摇床上孵育3天。
   9. 3天后，更换为新鲜的透明化溶液。注意：上述溶液需在使用前新鲜配制。
   10. 更换CUBIC透明化溶液后2至3天，将组织置于8号字体的纸张前检查其透明度。若组织透明，可透过组织清晰看到纸上的文字。此时移除透明化溶液，加入4 ml PBST（0.1% Triton-X100），每天清洗4次（每6小时一次）。

2. 免疫荧光染色

1. 将脊髓节段放入一抗溶液（兔抗血清素抗体，用PBST按1:100稀释）中，在37 °C培养箱内的摇床上孵育3天。
2. 移除一抗溶液，加入4 ml PBST（含0.1% Triton-X100），在37 °C培养箱内的摇床上每天洗涤脊髓节段4次（每6小时一次）。
3. 移除PBST溶液，加入二抗溶液（594标记的山羊抗兔IgG，用PBST按1:100稀释），在37 °C培养箱内的摇床上孵育组织3天。
4. 移除二抗溶液，加入4 ml PBST，在37 °C培养箱内的摇床上每天洗涤脊髓节段4次（每6小时一次）。次日，组织即可用于成像。

3. 成像

1. 移除 PBST 溶液，并加入 4 ml 的 85% 甘油，以使组织的折射率均匀。
2. 检查组织的透明度。约 1 小时后当组织变得透明时，将其置于一块适合多光子荧光显微镜固定框的大而薄的玻璃载片上。
3. 在脊髓组织旁滴加数滴 85% 甘油，并用 22 × 50 mm² 的盖玻片封片。
   注意：脊髓的方向决定了图像的呈现方式。
4. 将载玻片放入多光子荧光显微镜的固定框中，并将组织移至光路中。
5. 选择氦氖激光器 594 nm 激光线，并通过观察实时图像中阳性信号的亮度，将激光强度调节至最佳水平。
6. 使用 20X 物镜（水镜，NA 0.7）选择脊髓组织的扫描区域，准备进行 z 轴层扫，每步深度设为 3 µm。
7. 先使用 20X 物镜，再使用 63X 物镜（油镜，NA 1.4）从 z 轴顶部到底部扫描组织（步长为 1 µm）。使用三维软件²⁸重建三维视频。

结果

本部分展示了利用CLARITY与CUBIC技术联合处理的透明化小鼠脊髓中5-羟色胺抗体染色的结果。结果显示，5-羟色胺能纤维存在于脊髓的各个板层中，且主要集中在前角的腹侧区域（图1，另见视频1）。对照组织中未见阳性纤维（结果未显示）。在前角中，5-羟色胺能纤维在腹内侧区域密集分布，并向腹侧角的外侧区域延伸（图2，另见视频2）。部分免疫阳性纤维还从前角延伸至后角或中央管。后角的所有板层中均可见免疫阳性纤维，但在板层2与板层4之间的阳性纤维存在微小间隙，尤其在后角的外侧部分更为明显。后角中的大多数5-羟色胺能纤维直径较小，仅少数为大直径纤维（视频1）。在水平切面上，观察到前角中密集排列的5-羟色胺能纤维沿脊髓长轴走行，并形成一条粗大的纤维束。最引人注目的发现是，该粗大纤维束沿长轴方向规律地发出分支，这些分支与主纤维束呈垂直走向。这些分支在通往前角外侧区域的路径上进一步产生侧支。与这些分支相比，伸向中线方向的分...

讨论

本方案介绍了如何结合CLARITY和CUBIC技术对小鼠脊髓中的5-羟色胺能纤维进行成像。与Cheung et al.¹⁴ 和Tomer et al.¹⁵开发的被动透明化方案相比，该方法具有更快的透明速度，并可在透明过程中利用水凝胶对脊髓组织提供良好的支撑。

根据 Cheung 等¹⁴ 以及 Tomer 等¹⁵ 的报道，固定小鼠脊髓过程中的一个重要步骤是将所有溶液置于冰上保持低温，以防止化学试剂发生聚合。另一个关键步骤是以缓慢的速度用水凝胶溶液灌注小鼠，以避免神经组织肿胀。为了使水凝胶溶液形成凝胶，通常需要进行脱气处理。作为替代方法，我们使用封口膜覆盖试管顶部，并确保水凝胶溶液与封口膜之间不留任何气泡。该方法效果良好，水凝胶溶液在数小时后即形成凝胶。尽管凝胶中仍发现少量气泡，但这些气泡并未干扰后续实验，这一点已通过脊髓组织中无气泡的现象得到证实。透明化是最关键的步骤，需要多种试剂联合使用。含有氨基醇的透明化溶液清除脊髓组织脂...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
光引发剂 VA044	Wako	va-044/225-02111	http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm
40% 丙烯酰胺溶液	Bio Rad	161-0140	http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0140-40-acrylamide-solution
2% 双丙烯酰胺溶液	Bio Rad	161-0142	http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0142-2-bis-solution?parentCategoryGUID=5e7a4f31- 879c-4d63-ba0b-82556a0ccf1d
多聚甲醛	Sigma	158127	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/158127?lang=en®ion=AU
尿素	Merck Millipore	66612	http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Urea---CAS-57-13-6---Calbiochem,EMD_BIO-66612
N,N,N’,N’-四(2-羟丙基)乙二胺	Merck Millipore	821940	http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetra-2-propanol,MDA_CHEM-821940
吐温 X-100	Merck Millipore	648462	http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/TRITON®-X-100-Detergent---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648462
蔗糖	Sigma	S0389	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s0389?lang=en®ion=AU
5-羟色胺抗体	Merck Millipore	AB938	http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Anti-Serotonin-Antibody,MM_NF-AB938
山羊抗兔 IgG (H+L) 二抗，Alexa Fluor® 594 标记	Life Technologies	A-11012	https://www.lifetechnologies.com/order/genome-database/antibody/Rabbit-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012
多光子显微镜	Leica	Leica TCS SP5 MP STED	http://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/details/product/leica-tcs-sp5-mp/