我们提出一种简便的方法，用于制备一种可生物降解、基于明胶且具有磁热响应性的药物释放平台。该平台通过将超顺磁性氧化铁纳米颗粒和聚（N-异丙基丙烯酰胺-共-丙烯酰胺）引入由京尼平交联的球形明胶微网络中，并结合交变磁场应用系统而实现。
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摘要
摘要
可实现精确控制、按需释放药物的磁响应型纳米/微米级工程化生物材料已被开发为用于生物医学应用的新型智能软体器件。尽管已有多种磁响应型药物递送系统通过不同方式展示了其有效性，但 体外 概念验证研究或 体内 临床前应用中，其在临床环境中的使用仍受限于生物相容性或生物可降解性不足。此外，许多现有平台依赖复杂的制备技术。我们近期展示了通过物理包埋聚（N-异丙基丙烯酰胺-co在本研究中，我们展示了一种简便的方法，用于制备一种可生物降解的药物释放平台，该平台能够实现磁热触发的药物释放。该方法通过在明胶基胶体微凝胶中引入超顺磁性氧化铁纳米颗粒和热响应性聚合物，并结合交变磁场施加系统而实现。其中，聚（N-异丙基丙烯酰胺）链作为次要组分存在于三维明胶网络中。
引言
能够响应内源性或外源性刺激（例如，温度或pH）并实现精确控制药物释放的刺激响应型药物递送系统，已被广泛研究作为新型智能软体药物递送装置。微尺度水凝胶因其可调控且可持续的药物释放特性，以及可调节的化学和力学性能，已被广泛用作药物递送平台1-3。特别是，胶体微凝胶作为药物递送载体具有诸多优势，包括对外部刺激的快速响应性，以及以微创方式向局部组织注射的适宜性4。聚（N-异丙基丙烯酰胺）（pNIPAM）或其共聚物已被广泛用于合成温敏型微凝胶，通常通过将pNIPAM接枝到可生物降解/生物相容性聚合物（如明胶、壳聚糖、海藻酸或透明质酸）上实现5,6，其中pNIPAM在其低临界溶解温度（LCST）下的相变特性可作为药物释放的触发机制7。我们近期报道了一种可生物降解的、基于明胶的温敏型微凝胶的制备方法，即在三维明胶网络中引入聚（N-异丙基丙烯酰胺-共-丙烯酰胺）[p(NIPAM-共-AAm)]链作为次要组分8。该明胶/p(NIPAM-共-AAm)微凝胶表现出对温度升高的可调控去溶胀行为，并与牛血清白蛋白（BSA）的释放呈正相关。
近年来，人们 increasingly 致力于开发一种磁响应性药物递送平台，该平台能够按需触发药物释放9,10磁响应性药物递送平台的合成基本原理是利用超顺磁性纳米颗粒（MNPs）在接收高频交变磁场（AMF）时产生热量的特性，从而触发温度敏感性药物释放。该系统有望应用于未来的临床实践，因其可实现深层组织靶向、无创且可远程控制的药物释放，并可与热疗及磁共振成像系统相结合。10-12此类平台包括：（1）MNPs/pNIPAM杂合微凝胶颗粒 13-15 以及（2）含有固定化磁性纳米颗粒（MNPs）的宏观水凝胶支架16-18基于 pNIPAM 的微凝胶平台表现出对磁热刺激精细可调的体积相变响应性。然而，其制备仍依赖复杂且精密的技术，且高含量的 pNIPAM 聚合物可能对细胞具有潜在的细胞毒性19，这可能会限制它们的 体内 应用方面，与胶体微凝胶相比，宏观支架对外部刺激的响应较慢，且需要通过侵入性外科手术进行移植。
水包油乳化法一直是制备亚毫米级或微米级凝胶颗粒的标准方法20。在乳液的水-油界面处，由于在机械剪切力作用下水相液滴的表面能最小化，微凝胶颗粒形成球形结构。该方法可通过简单的制备工艺大量生产水性球形凝胶液滴，已被成功应用于制备用于药物递送的明胶基微凝胶21-23。
在此，我们介绍一种简便的方法，通过水包油乳化法合成具有磁热响应性的明胶基微凝胶，用于药物递送。该方法通过物理包埋氧化铁磁性纳米粒子和p(NIPAM-co-AAm）链作为球形微米级明胶网络中的次要组分，该网络通过天然来源的交联剂京尼平进行共价交联，并结合高频交变磁场（AMF）施加系统。
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方案
注意：明胶磁响应微凝胶的制备整体流程如图1A所示。
1. 溶液和悬液的制备
- 通过将 20 mg 的交联剂京尼平（genipin）溶解于 2 ml 磷酸盐缓冲液（1× PBS；pH 7.4）中，配制 1%（w/v）的京尼平溶液。涡旋混合溶液，并置于 50 oC 水浴中 2 小时，以确保完全溶解。
- 通过将 20 mg 聚（乙二醇）-聚（丙二醇）-聚（乙二醇）（Mw = 2,900 Da；简称 L64）溶解于 200 ml PBS 中，配制浓度为 100 ppm 的表面活性剂溶液。
- 通过将 64.5 mg 明胶溶解于 0.43 ml PBS 中，配制 15%（w/v）的明胶溶液。涡旋混合溶液，并将其置于 37 oC 水浴中，直至溶液达到溶胶相（即溶液变为流动状态）。随后，涡旋混合明胶溶液 2 至 3 次，以确保样品均匀。
- p(NIPAM-co-AAm)/MNPs 溶液与模型药物（BSA）的制备：
- 将 10.75 mg 亲水性磁性纳米颗粒（MNPs）分散于 0.43 ml PBS 中，然后将 12.9 mg p(NIPAM-co-AAm) 溶解于该 MNP 悬液中，使终浓度为 3%（w/v）。提高 p(NIPAM-co-AAm) 的浓度可增强微凝胶的去溶胀行为。
- 使用德克萨斯红标记的牛血清白蛋白（TR-BSA；Mw ~66 kDa）作为模型药物。将 0.5 mg TR-BSA 溶解于 p(NIPAM-co-AAm)/MNPs 混合物中。
- 将 p(NIPAM-co-AAm)/MNPs 混合物（0.43 ml）加入明胶溶液（0.43 ml）中，制备明胶/p(NIPAM-co-AAm)/MNPs/BSA 混合溶液（总体积 0.86 ml），并充分涡旋混合，以获得均匀溶液。因此，聚合物和 MNPs 在最终混合物中的浓度为初始浓度的一半。
2. 乳化
- 将15 ml硅油[聚二甲基硅氧烷（黏度350 cSt）]倒入洁净无菌的烧杯中。
- 立即加入预先配制的明胶/p(NIPAM-co-AAm)/磁性纳米颗粒/牛血清白蛋白水溶液（0.86 ml），倒入硅油中，并在30 oC下以900 rpm的转速用磁力搅拌子搅拌30分钟，使水相混合物在油相中乳化。
3. 微液滴的凝胶化及其向水溶液的转移
- 将乳液（约16 ml）从烧杯转移至50 ml离心管中。
- 在4 °C下冷却离心管10分钟，使油相中的微滴发生凝胶化。
- 用预冷至4 oC的L64溶液将离心管加满至50 ml，并剧烈振荡离心管。部分L64表面活性剂可能进入微凝胶内部。
- 在4 oC条件下，以2,300 × g离心20分钟。
- 定期检查离心管壁是否有凝胶颗粒沉淀形成。若未观察到颗粒沉淀，需在 相同转速和温度下继续离心20分钟。随后小心移除上清液，避免扰动管内壁形成的沉淀。
- 重复步骤（3.3）至（3.5）一次。每次操作均应将样品转移至新的离心管中，以避免微凝胶悬浮液中混入油滴。此步骤完成后，应确保样品悬浮液中无表面活性剂或油滴残留。然而，重复的分离步骤可能导致初始材料的损失。
4. 微凝胶的共价交联
- 向凝胶颗粒沉淀中加入 2 ml 京尼平溶液（按第 1 节制备），并通过涡旋振荡充分混匀。
- 迅速将悬浮液转移至 23 oC 水浴中，以启动共价交联反应，并在所需的交联时间（例如，5 - 120 分钟）内完成反应。
- 交联完成后，立即弃去多余的交联剂：移除京尼平溶液，用 PBS 重悬微凝胶，然后在 4 oC 条件下以 2,300 × g 离心 20 分钟。如有需要，可用移液器吸头小心打碎形成的沉淀。若溶液中仍有残留的京尼平，此洗涤步骤可重复最多 3 次。
- 弃去上清液，并通过血细胞计数板计数后，用 PBS 将微凝胶重悬至所需浓度（例如，5 × 106 个微凝胶/ml）。
- 进行显微观察时，将微凝胶悬浮液加样至载玻片与盖玻片之间的空间，并用环氧树脂密封盖玻片边缘。
5. 应用交变磁场触发药物释放
- 将含有所需浓度微凝胶的试管放入磁线圈腔室中。如有必要，将光纤温度探头插入试管，以监测施加交变磁场（AMF）过程中介质的温度变化。
- 施加高频（>100 kHz）交变磁场，设定特定场强（>5 kA/m）并持续一定时间。施加AMF后，将样品管在2,273 × g离心20分钟（4 oC），收集上清液，通过分光光度法测定从微凝胶释放到周围介质中的TR-BSA含量。德克萨斯红的激发波长和发射波长分别为584 nm和612 nm。
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结果
当正确执行该方案时，所制备的微凝胶应表现出明确的球形形貌和胶体分散性，直径范围在 5 μm 至 20 μm 之间（图 1B 和 C）。可使用荧光标记的磁性纳米颗粒（MNPs）或荧光标记的牛血清白蛋白（BSA），以确认 MNPs 或药物（本研究中为 BSA）是否成功包封于微凝胶内部（图 1D）。所制备的微凝胶在无酶降解剂（如胶原酶）存在的条件下，可在 4 oC 稳定保存长达 4 周。在明胶微凝胶中引入 p(NIPAM-co-AAm) 可使其表现出温度依赖性的体积变化（图 2A），当介质温度从 22 oC 升高至 42 oC 时，含 p(NIPAM-co-AAm) 的明胶微凝胶体积收缩约 40%，而未含 p(NIPAM-co-AAm) 的明胶微凝胶体积变化仅约 10%（图 2B）。明胶/p(NIPAM-co...
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讨论
本文所述技术展示了利用纳米颗粒-微凝胶杂化材料实现磁热触发药物释放的概念验证。该目标通过将MNPs和p(NIPAM-co在由京尼平交联的微米级三维明胶网络中，-AAm）链能够响应远程施加的交变磁场（AMF），使磁响应平台在微凝胶内产生热量，进而触发模型药物牛血清白蛋白（BSA）的释放。
将磁性纳米颗粒（MNPs）和 p(NIPAM-co-AAm) 同时包埋的策略对于实现明胶微凝胶中理想的药物释放至关重要，因为在未引入 p(NIPAM-co-AAm) 的情况下，明胶/MNPs 微凝胶中牛血清白蛋白（BSA）的释放程度显著低于含有 p(NIPAM-co-AAm) 的微凝胶，尽管两种微凝胶在交变磁场（AMF）作用下的升温幅度相似（图 2C 和 2D）。我们证明，明胶/p(NIPAM-co-AAm) 微凝胶的去溶胀行为是由 p(NIPAM-co-AAm) 聚合物链在温度升高时发生收缩所引发的；此外，该去溶胀行为与微凝胶中药物释放的程度呈正相关
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披露
作者无任何利益冲突披露。
致谢
本研究由Farris Family Innovation Award和美国国立卫生研究院（NIH）1R01NR015674-01项目资助，授予MK。作者感谢Josep Nayfach（Qteris, Inc）提供电磁发生器系统及其技术咨询。作者还感谢Huan Yan（LCI & 化学物理交叉学科项目，肯特州立大学）提供技术支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 明胶 | Sigma-Aldrich, MO, USA | G2500 | A型明胶，猪皮来源 |
| 聚(N-异丙基丙烯酰胺-co-丙烯酰胺) | Sigma-Aldrich, MO, USA | 738727 | 分子量 = 20,000，低临界溶解温度 = 34 - 38 °C |
| 硅油 | Sigma-Aldrich, MO, USA | 378372 | 黏度 350 cSt |
| 泊洛沙姆 L64 | Sigma-Aldrich, MO, USA | 435449 | 聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇) |
| 京尼平 | TimTec LLC, DE, USA | ST080860 | 分子量 = 226.23 |
| 磁性纳米颗粒 (MNPs) | Micromod Inc, Germany | 79-00-102 | nanomag-D-spio，100 nm |
| TR-BSA | Life Technologies, NY USA | A23017 | 牛血清白蛋白 (BSA)，德克萨斯红偶联物 |
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