适用于生物医学应用的无镉InP/ZnS量子点的合成

摘要

本方案详细介绍了无镉InP/ZnS量子点（QDs）的合成方法。由于基于Cd²⁺的纳米颗粒在降解过程中可能释放有毒离子，InP基量子点因此受到越来越多关注。合成后，采用两亲性聚合物将量子点溶解于水中，以便用于生物医学应用。

摘要

荧光纳米晶体，特别是量子点，已成为多种生物医学应用中的有用工具。为了在生物系统中成功应用，量子点应具有高荧光性，并且尺寸小且单分散。尽管常用的镉基量子点具备这些特性，但由于纳米颗粒降解过程中可能释放 Cd²⁺ 离子，因而具有潜在毒性。基于铟的量子点，特别是 InP/ZnS，因其荧光特性和尺寸与镉基量子点相对相似，近年来被探索作为镉基量子点的可行替代品。本文所介绍的合成方法采用标准的热注入技术以实现有效的纳米颗粒生长；然而，纳米颗粒的性质（如尺寸、发射波长和发射强度）可能因反应条件的微小变化而发生显著改变。因此，必须精确控制温度、反应时间及前驱体浓度等反应条件，以获得可重复的产品。由于量子点本身不溶于水溶液，还必须对其进行表面修饰以赋予其在水中的溶解性。在本方案中，采用一种两亲性聚合物来同时与量子点表面的疏水配体及体相溶剂水分子相互作用。本文提供了一种详细的合成高荧光 InP/ZnS 量子点的实验方案，适用于生物医学应用。

引言

量子点（QDs）是一类半导体纳米晶体，在光照下会表现出荧光特性¹。由于其尺寸较小（2–5 nm），与许多较大的生物大分子相近，且易于进行生物功能化修饰，因此量子点在生物医学应用中具有极高的吸引力。它们已被广泛应用于生物标记、单分子活细胞成像、药物递送、体内成像、病原体检测以及细胞示踪等多种领域^2–8。

基于镉的量子点（Cd-based QDs）由于其强烈的荧光和较窄的发射峰宽度，已被广泛应用于生物医学领域⁹。然而，由于纳米颗粒降解后可能释放出Cd²⁺离子，存在潜在毒性问题，已引起关注¹⁰。近年来，基于磷化铟（InP-based QDs）的量子点被探索作为基于镉的量子点的替代品，因其保持了基于镉量子点的许多荧光特性，并可能具有更好的生物相容性¹¹。在体外（in vitro）实验中，浓度低至10 pM、仅作用48小时后，基于镉的量子点已被发现比基于磷化铟的量子点具有显著更高的毒性¹¹。

量子点（QDs）的荧光发射颜色具有尺寸可调性¹。也就是说，随着量子点尺寸的增大，其荧光发射波长发生红移。通过改变反应过程中的温度、反应时间或前驱体浓度条件，可以调控所制备量子点的尺寸及其尺寸分布¹²。尽管InP量子点的发射峰通常比镉基量子点更宽且强度较低，但InP量子点可制备出多种颜色，设计上可避免光谱重叠，并且其发光强度足以满足大多数生物医学应用的需求¹²。本实验方案中详述的合成方法所得到的量子点，其红色发射峰中心位于600 nm。

量子点核合成后需采取多个步骤，以保持其光学完整性并使其适用于生物应用。必须保护量子点核的表面，防止发生氧化或产生可能导致荧光淬灭的表面缺陷；因此，需在核外包裹一层ZnS壳层，形成InP/ZnS（核/壳）量子点¹³。研究表明，该包覆层可有效保护量子点产物的光致发光性能。在InP量子点合成过程中引入锌离子已被证明可减少表面缺陷，并降低粒径分布的多分散性¹²。即使反应体系中存在Zn²⁺，生成InZnP的可能性仍然极低¹²。包覆完成后，所得InP/ZnS量子点表面通常结合有三辛基氧化膦（TOPO）或油胺等疏水性配体^12,14。两亲性聚合物可与量子点表面的疏水性配体相互作用，同时与大量水分子作用，从而赋予量子点水溶性¹⁵。带有羧酸根化学基团的两亲性聚合物可用作"化学手柄"，以进一步对量子点进行功能化修饰。

本方案详细介绍了水溶性 InP/ZnS 量子点的合成与功能化方法，所制备的量子点具有极强的荧光发射和相对较小的尺寸分散性。这些量子点的潜在毒性低于常用的 CdSe/ZnS 量子点。本文所述的 InP/ZnS 量子点合成方法为基于镉的量子点在生物医学应用中提供了实用的替代方案。

方案

1. 磷化铟/硫化锌（InP/ZnS）量子点的合成

1. 磷化铟（InP）量子点核的合成
   1. 将100 ml圆底三颈烧瓶配装12英寸冷凝管。加入30 ml油胺（OLA）和0.398 g氯化铟（III）（InCl₃）₃)，0.245 g 氯化锌（ZnCl₂₂）并在室温下用真空泵抽真空搅拌1小时。溶液应呈无色，并伴有白色沉淀。
   2. 使用带有热电偶和比例-积分-微分（PID）温度控制器的加热套，将溶液温度升至120 °C。在真空条件下对溶液抽气20分钟，以去除可能影响核生长的低沸点杂质。
      注意：虽然可以使用沙浴和温度计，但使用加热套和PID控制器可提高反应产物的均匀性和可重复性。
   3. 在惰性气体条件下（例如， N₂），回流溶液并将温度升至220 °C，持续15分钟。InCl₃ 和 ZnCl₂ 完全溶解，形成淡黄色溶液。静置10分钟使温度稳定。
   4. 用氮气吹扫一次性3 ml塑料注射器和4英寸、22 G针头。使用该注射器迅速将0.5 ml三(二甲氨基)膦（TDMAP）加入InCl₃ 溶液温度略有下降，随后回升至220 °C。溶液由透明淡黄色变为不透明黑色。
   5. 9.5 分钟后，将反应烧瓶从加热套中取出，直至温度降至 200 °C 以下。为保护 InP 核的完整性，请直接进入步骤 1.2.1 进行 ZnS 包覆。
2. 硫化锌（ZnS）量子点壳层的合成
   1. 将1.1.5步骤中的反应烧瓶置于加热套上，将温度稳定在200 °C。在15秒内缓慢向含InP量子点的溶液中加入3.58 g十二烷基硫醇（DDT）。使溶液反应1小时。
      注意：通过增加或减少步骤1.2.4中添加的硬脂酸锌的量，可调节ZnS壳层的厚度。改变ZnCl₂的用量₂ 在步骤1.1.1和1.2.1中使用十二烷硫醇可能通过改变反应动力学显著影响量子点的质量。
      1. 随后，将反应烧瓶从加热套中取出，使溶液冷却至约 60 °C。
   2. 当 InP/ZnS 溶液温度降至约 60 °C 时，加入 10 ml 己烷，并将总体积约为 45 ml 的溶液全部转移至 50 ml 聚丙烯离心管中。离心样品（3,000 × g，10 分钟），以去除未反应的固体前驱物。
   3. 小心将上清液转移至一个250 ml的聚丙烯离心管中，加入200 ml丙酮，离心（3,000 × g，10 min）以沉淀InP/ZnS量子点。若无配备合适转子/配件的离心机，也可将此体积均分为四份，分别装入四个50 ml离心管中进行离心。倾去上清液，用氮气彻底吹干量子点沉淀，以去除丙酮。
   4. 将量子点用20 ml OLA通过超声重悬，转移至含有0.474 g硬脂酸锌的50 ml圆底三颈烧瓶中，搅拌。在室温下抽真空20 min。
   5. 在氮气氛围下，将温度升至 180 °C，反应持续 3 小时。尽管反应过程中反应溶液无明显视觉变化，但添加硬脂酸锌可增加 ZnS 壳层厚度，从而通过改善量子点的表面钝化提高量子产率。^12.反应完成后，将烧瓶从加热套上取下，使溶液冷却至约 60 °C。
   6. 当 InP/ZnS 溶液温度降至约 60 °C 时，加入 20 ml 己烷，并转移至 50 ml 聚丙烯离心管中。将样品在 3,000 × g 条件下离心 10 分钟，以去除未反应的硬脂酸锌。
   7. 小心地将上清液转移至一个250 ml聚丙烯离心管中，加入200 ml丙酮，混匀后离心（3,000 × g，10 min）以沉淀InP/ZnS量子点。小心倾去上清液，并用氮气充分吹干以去除丙酮。
   8. 将InP/ZnS量子点颗粒溶解于30 ml己烷中。涡旋并短暂超声处理溶液，以确保完全分散。
   9. 重复步骤 1.2.6–1.2.8 两次，以确保充分去除过量的有机配体。在步骤 1.2 中，过量配体的存在可能影响两亲性聚合物与量子点（QD）之间的相互作用。
   10. 根据 Xie 详述的计算方法， 等¹⁶采用紫外-可见分光光度法测定所合成的InP/ZnS量子点的尺寸和浓度。
       注意：本分析的重要光谱特征是吸收峰的肩峰。该肩峰的最大值所对应的波长和吸光度值分别用于计算量子点的尺寸和浓度。该反应通常可生成约5 μmol的量子点，其发射峰位于600 nm。若要合成不同颜色的量子点，可改变反应时间或反应温度。延长反应时间或提高溶液温度会导致发射峰发生红移。例如，将反应温度升至240 °C并保持反应时间为10 min，可获得最大发射峰为680 nm的量子点。同样，将反应时间缩短至2 min并使氯化锌用量加倍，可获得最大发射峰为470 nm的量子点。这些InP/ZnS量子点在惰性气体保护、避光及4 °C条件下至少可稳定保存一个月。

2. 使用两亲性聚合物实现InP/ZnS量子点的水溶化

1. 水相增溶化
   1. 使用步骤1.2.10中获得的InP/ZnS量子点，取部分量子点用正己烷稀释，得到1 ml浓度为1 μM的量子点溶液。
      1. 在离心管中，每管加入0.25 ml InP/ZnS量子点。向离心管中加入1 ml丙酮或甲醇，混匀后离心（3,000 × g，10分钟）。小心移除上清液，并将每份沉淀溶解于1 ml四氢呋喃（THF）中。
      2. 将溶于THF的InP/ZnS量子点转移至100 ml圆底烧瓶中，并用16 ml THF稀释。为减少溶液中的聚集体，对量子点进行超声处理5–10分钟。
   2. 将30 mg聚（马来酸酐-alt-1-十八烯）-3-(二甲氨基)-1-丙胺（PMAL-d）溶解于10 ml分子级水中。通过水浴超声或轻柔搅拌至溶液呈半透明状态，即可完全溶解该聚合物。避免使用涡旋振荡或剧烈搅拌，以免产生大量气泡，从而阻碍聚合物与量子点的相互作用。将10 ml聚合物溶液加入含有溶于THF的InP/ZnS量子点的100 ml圆底烧瓶中。
   3. 使用旋转蒸发仪从量子点/聚合物溶液中除去THF。蒸发过程中将烧瓶置于冰浴中，以促进聚合物与量子点之间的相互作用。根据真空强度的不同，大部分THF在10分钟内被蒸发，溶液逐渐变浑浊。
      1. 当溶液体积蒸发至10 ml时，将烧瓶从旋转蒸发仪中取出，加入30 ml分子级水。再将烧瓶放回旋转蒸发仪，继续蒸发至2 ml。此最终蒸发步骤可能需要数小时，请确保持续维持冰浴条件。
   4. 用移液器将水溶性InP/ZnS量子点从圆底烧瓶中转移出来。使用连接有0.1 μm尼龙注射式滤器的3 ml塑料注射器过滤量子点溶液，收集至5 ml离心管中。
   5. 将量子点置于20,000 MWCO透析膜透析装置中，对0.05 M硼酸盐缓冲液（pH 8.5）进行透析，以去除过量聚合物。（配制该硼酸盐缓冲液时，将0.05 M十水合四硼酸钠缓慢加入0.05 M硼酸溶液中，边加边剧烈搅拌，直至pH达到8.5。）使用真空浓缩仪将硼酸盐缓冲液中的量子点浓缩至1 ml。
   6. 储存时，先用氮气吹扫溶液，再用Parafilm密封。水溶性InP/ZnS量子点在4 °C避光条件下至少可稳定保存4个月。

结果

未包覆的InP核通过肉眼观察未显示出明显的可见荧光。然而，InP/ZnS（核/壳）量子点在紫外照射下肉眼可见明显荧光。采用荧光光谱法对InP/ZnS量子点的荧光特性进行了表征。在己烷中的量子点荧光光谱（图1在533 nm激发下，表现出一个中心位于600 nm的主要发射峰，半高全宽（FWHM）为73 nm。尽管吸光度存在（0.2）偏移 图1 可能表明量子点散射光，从而存在聚集的量子点，因此需进行闪烁分析（见下文) 表明大多数量子点为单个或极小的量子点聚集体。在使用两亲性聚合物PMAL-d包覆后，通过将InP/ZnS量子点的荧光强度积分值与标准物质罗丹明B进行比较，测定了其量子产率。¹⁷在己烷中，量子点的量子产率平均为7.96%（2次测量结果分别为7.69%和8.22%），在水中平均为6.03%（2次测量结果分别为5.98%和6.08%）。

采用透射...

讨论

本方案详细描述了可用于多种生物系统的高荧光性InP/ZnS量子点的合成方法。所合成的量子点产物表现出单一的荧光发射峰，中心波长为600 nm，半高宽（FWHM）为73 nm（图1），与其他已有报道的合成方法相当¹²。反应时间和反应温度是极为关键的步骤，因其对量子点合成的质量和可重复性具有显著影响。在水中溶解后，测得量子点的量子产率约为6%。通过调节反应时间、温度或前驱体浓度，可调控量子点的尺寸和发射波长，从而适用于多光谱应用。

在生物系统中使用纳米颗粒时，尺寸和表面电荷是需要考虑的两个极为重要的因素。为了尽量减少对目标生物分子的干扰，量子点应保持较小且单分散的尺寸。此外，还可以通过调节量子点在溶液中的表面电荷，以降低其与非目标物质之间的非特异性结合。本研究中所制备的量子点，透射电镜（TEM）测得其直径为 2.74 ± 0.72 nm（仅可见核壳结构）（图 2A 和 2B）。水溶性量子点的有效水动力学直径为 14.8 ± 6.0 nm，与目前用于生物学研究的镉基量子点相当²²

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
油胺	Acros	129540010
氯化锌(II)	Sigma	030-003-00-2
氯化铟(III)	Chem-Impex	24560
三(二甲氨基)膦	Encompass	50-901-10500
1-十二烷硫醇	Acros	117625000
己烷	Fisher Sci	H292-4
丙酮	TransChemical	UN 1090
硬脂酸锌	Aldrich Chem	307564-1KG
四氢呋喃	Acros	34845-0010
分子水	Fisher Sci	BP2470-1
聚(马来酸酐-alt-1-十四碳烯)，3-(二甲氨基)-1-丙胺衍生物	Sigma	90771-1G
硼酸	Fisher Sci	BP168-500
十水合四硼酸钠	Fisher Sci	BP175-500
罗丹明B	Aldrich Chem	R95-3
氮气	Airgas	UN1066
台盼蓝	Thermo Sci	SV30084.01
3 ml 塑料鲁尔锁扣注射器	BD	309657
鲁尔锁扣针头	Air-Tite	8300014471	4 英寸，22 号
50 ml 聚丙烯离心管	Falcon	352098
250 ml 离心瓶	Thermo Sci	05-562-23	Nalgene PPCO
5 ml 离心管	Argos-Tech	T2076
1.5 ml 微量离心管	Bio Plas	4150
0.1 μm 注射器滤器	Whatman	6786-1301	Puradisc 13 mm 尼龙滤膜
Slide-A-Lyzer MINI 透析装置	Thermo Sci	69590	20,000 MWCO
旋转蒸发仪	Heidolph
Centrifuge 5072	Eppendorf		带 50 ml 管适配器的摆桶转子
Lambda 650 紫外/可见光光谱仪	Perkin Elmer		紫外-可见分光光度计
LS 55 荧光光谱仪	Perkin Elmer		荧光计
Axio Observer.A1	Zeiss		倒置荧光显微镜
AxioCam MRm	Zeiss		CCD 相机
Tecnai TF20 透射电子显微镜	FEI		透射电子显微镜
TEM Eagle CCD	FEI		透射电镜 CCD 相机
NanoBrook Omni DLS	Brookhaven		动态光散射仪