本文介绍了一种从冷冻的胃、小肠和结肠组织中分离并建立原代成纤维细胞/肌成纤维细胞（MF）培养物的方案，所获得的细胞具有MF表型。这些细胞表达CD90、α-SMA和波形蛋白（vimentin）。肌成纤维细胞可用于多种功能检测，包括酶活性和细胞因子产生等实验。
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摘要
摘要
成纤维细胞/肌成纤维细胞（MFs）因其在疾病发生中的作用以及在伤口愈合和肿瘤微环境形成中的贡献而日益受到关注。尽管目前已有多种从胃肠道（GI）组织中分离MFs的技术，本方案引入了一种从冷冻组织中分离这些间质细胞的新方法。冷冻胃肠道组织样本不仅使研究者能够从全球合作者、生物样本库和商业供应商处获取样本，还允许对新鲜样本进行延迟处理。该方案可稳定地获得具有典型纺锤形形态、表达CD90、α-SMA和波形蛋白（vimentin）等标志物的MF表型细胞。由于这些细胞来源于患者样本，使用原代细胞还能更真实地模拟疾病状态（特别是癌症和炎症性肠病）下的MF特性。该技术已在胃、小肠和结肠的原代MF培养中得到验证。原代MF培养物可在多次传代后用于多种实验，其纯度可通过免疫细胞化学和流式细胞术分析进行评估。
引言
肌成纤维细胞/成纤维细胞（MFs）是胃肠道（GI）黏膜中数量丰富的细胞群体。这些间质细胞位于上皮下方，于肠道黏膜固有层内形成相互连接的网络结构。MFs不仅负责细胞外基质的沉积，还可通过旁分泌调节影响邻近上皮的电解质转运、修复过程及屏障功能1, 2。此外，研究表明MFs在炎症反应和组织重塑过程中发挥关键作用3, 4。肌成纤维细胞是肿瘤微环境的重要组成部分，在肿瘤中也被称为癌症相关成纤维细胞，可促进肿瘤细胞生长，并为癌症干细胞提供生态位3。新兴证据提示，MFs还可能作为局部抗原呈递细胞发挥作用。此外，MFs是固有免疫和适应性免疫应答的重要调节者，能够产生多种细胞因子和生长因子5。
在健康个体中，肌成纤维细胞（MFs）被认为由间充质干细胞分化而来，并在其细胞表面表达间充质标志物CD903, 5。这些细胞波形蛋白（vimentin）呈阳性，而上皮细胞标志物EpCAM和造血细胞标志物CD45则分别为阴性。肌成纤维细胞被认为是成纤维细胞的活化形式，可通过表达α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）5 与非活化状态的成纤维细胞相区分。
在过去十年中，已有多项从人结肠黏膜中分离肌成纤维细胞的方法被发表——大多基于Mahida et al.最初描述的方法5-8。尽管个别研究报道了从不同肠道黏膜组织中分离细胞的操作流程，但目前尚未发表一种可通用的、用于从胃肠道多个部位（即胃、小肠和大肠黏膜）分离肌成纤维细胞（MFs）的标准化方案。本文所提出的方案已在上述三种组织类型中均经过测试并成功应用。此外，目前尚未见有关从冷冻保存的胃肠道黏膜组织中分离肌成纤维细胞的操作流程报道。
本文介绍了一种基于酶消化的优化方法，可同时从人肠道黏膜组织中分离出黏膜成纤维细胞（MF），用于培养以及新鲜消化后单细胞黏膜样本的流式细胞术分析。该技术能够稳定地获得具有成纤维细胞表型的原代培养细胞。此外，相同的方法也可用于从冷冻保存的胃和小肠组织样本中分离成纤维细胞 。既往已有从新鲜胃肠道组织中分离成纤维细胞的报道；然而，使用冷冻样本具有诸多优势。例如，研究人员可收集并储存来自全球各地合作者所提供的、可运输的冷冻组织样本。此外，研究人员可能会发现，从手术室和/或内镜检查室收集废弃组织并立即进行处理以分离细胞，与其当前的实验安排存在冲突。同时，由于手术时间具有不可预测性，组织获取可能发生在一天中的较晚时段，从而限制了后续组织处理的时间。将组织冷冻以备后续处理可有效缓解上述挑战。
最后，这些方法已成功应用于结直肠癌和炎症性肠病等疾病状态下结肠、胃和小肠肌成纤维细胞的分离。
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方案
获取手术患者废弃人体组织并建立原代培养物的方案已获得德克萨斯大学医学分部和新墨西哥大学机构审查委员会的批准。以下描述了获取人体组织样本的一般要求。请注意，由于成纤维细胞（MFs）可从冷冻组织中分离，因此生物样本库和商业供应商也是可行的选择。
1. 获取人体组织
- 向机构审查委员会提交获取人类结肠组织的方案以获得批准。
- 与普通外科医生和/或结直肠外科医生建立合作，以便获取用于研究的人体组织。还必须与病理科建立合作，因为他们将确定哪些组织无需用于诊断，可指定用于研究。
- 建议病理科提供肿瘤组织以及距离肿瘤至少5 cm的宏观正常黏膜组织。立即将样本置于冰冻洗涤培养基中，并放置在冰上。病理科将确定可安全用于研究的组织量。用于肌成纤维细胞（MF）分离的最小组织量为1.5 mm2。
- 获取的组织可立即用于建立原代培养，或冷冻后置于-80 °C保存以备后续分离。
- 若需冷冻以备后续分离，将组织切成约1 - 2 mm2大小的片段，放入含1 ml冻存培养基（见下文）的冻存管中，并储存在-80 °C。注意：采用本方案，已观察到从冷冻保存超过4年的组织中成功分离出肌成纤维细胞（MFs）。
2. 准备试剂
- 对于胶原酶溶液：在含 Ca2+/Mg2+ 的汉克斯平衡盐溶液（HBSS）中配制 100 U/ml 的胶原酶 I、II 和 IV（参见 材料表）。注意：不同供应商提供的胶原酶活性单位浓度和纯度可能存在差异，这可能会影响组织消化效率和/或黏膜细胞表面表位的保存。为避免这些潜在问题，应使用高纯度（≥95%）的胶原酶，并根据其活性单位浓度配制储备液。
- 配制水溶性 DNase 储备液，浓度为 10 mg/ml（3.55 UA/mg）。
- 配制洗涤培养基：MEM 89 ml，抗生素-抗真菌剂（100 倍浓缩液）1 ml，热灭活胎牛血清（FCS）10 ml。
- 配制成纤维细胞生长培养基：MEM 500 ml 瓶装；L-谷氨酰胺（200 mM）5 ml；MEM 非必需氨基酸（100 倍浓缩液）5 ml；盐酸环丙沙星（10 mg/ml）570 µl；抗生素-抗真菌剂（100 倍浓缩液）10 ml；丙酮酸钠（100 mM）5 ml；热灭活胎牛血清（FCS）50 ml。
- 配制冻存培养基：在成纤维细胞生长培养基（试剂 2.4）中加入 10% 二甲基亚砜（DMSO），然后用 0.22 µm 滤器过滤除菌。
3. 酶解消化人体组织
- 如果组织是用冷冻保存液冷冻的，将冻存管置于温水（约 37 °C）中，直至组织和保存液完全解冻。
- 取 4 - 5 块大小为 2 mm2 的组织，用不含 Ca2+/Mg2+ 的 HBSS 洗涤组织两次，每次 10 ml。
- 待组织自然沉降后，小心弃去上清液，无需离心样品。
- 向样品中加入 10 ml 胶原酶溶液，并将组织-溶液混合物转移至带有内置转子的无菌、无 DNase/RNase 的离心管中，用于组织解离。使用胶原酶解离围绕上皮细胞基底侧并构成黏膜固有层非细胞成分的细胞外基质。
- 将管子拧紧，并倒置固定在解离仪（例如，GentleMACs）的套筒上。若实验室无法使用上述设备，可延长每次消化步骤的时间以获得可比结果。
- 运行程序 h_tumor_01（仪器预设程序之一，总时长 36 秒，间歇性脉冲转速范围为 1,000 - 4,000 rpm，每轮运行 268 次）。
- 程序结束后，将离心管从解离仪上取下。
- 将样品在 37 °C 下以 140 rpm 持续振荡孵育 45 分钟。注意：对于不同量的组织样品，消化时间可相应缩短或延长（即，组织量较大时可能需要更长时间）。
- 再次将管子倒置固定在解离仪的套筒上。
- 选择并运行程序 h_tumor_02（总时长 37 秒，间歇性脉冲转速范围为 1,000 - 4,000 rpm，每轮运行 235 次）。
- 程序结束后，将离心管从解离仪上取下。
- 加入 50 µl DNase 储存液。使用 DNase 解离或去除导致细胞聚集的死亡细胞及细胞碎片中的 DNA 成分。
- 将样品在 37 °C 下以 60 rpm 持续振荡孵育 30 分钟。
- 再次将管子倒置固定在解离仪的套筒上 。
- 选择并运行程序 h_tumor_03（总时长 37 秒，间歇性脉冲转速范围为 1,000 - 4,000 rpm，每轮运行 168 次）。
注意：若组织未完全消化，可在 20 °C 下以 250 × g 离心 10 分钟，弃去上清液，用 2 ml 细胞解离液重悬，并在室温 下孵育 10 分钟。 - 将细胞悬液通过无菌 70 µm 细胞筛过滤。
- 在 20 °C 下以 250 × g 离心细胞悬液 10 分钟，彻底吸除上清液。
- 用不含 Ca2+/Mg2+ 的 HBSS 洗涤细胞沉淀两次，每次 25 ml，并弃去上清液。
- 在最后一次洗涤前，使用实验室现有的自动细胞计数系统或血细胞计数板手动计数细胞数量。若需建立 MF 原代培养，请进行步骤 3.19.1；若需通过流式细胞术分析或分选 MF，请进行步骤 3.19.2。
- 为分离和培养纯 MF 细胞（图 1），弃去最后一次离心后的上清液，将细胞沉淀重悬于适量成纤维细胞分离培养基中，以每孔 3 ml 培养基接种最多 4 × 106 个细胞至 6 孔细胞培养板中。继续进行步骤 3.20。
- 若需通过流式细胞术分析或分选 MF，将最多 2 × 106 个细胞置于 2 ml 成纤维细胞分离培养基中，加入 24 孔低吸附板，于 37 °C、5% CO2 条件下过夜 孵育。此步骤旨在恢复可能因酶处理而受影响的细胞表面表位。随后收集细胞悬液，计数回收的细胞，并进行免疫染色及流式细胞术分析8。
- 在 37 °C、5% CO2 条件下培养细胞，每 2 - 3 天更换一次培养基，直至形成约 80% 汇合的 MF 单层细胞（图 1D-E）。
- 将 6 孔板中的细胞按 1:1 比例传代至 T25 培养瓶中，在成纤维细胞生长培养基中培养约 10 - 14 天，以达到 80 - 100% 汇合度。
- 将细胞按 1:2 比例从 T25 培养瓶传代至 T75 培养瓶以扩增培养。当细胞达到汇合状态后，取一瓶用于通过流式细胞术分析分离的 MF 纯度（如前所述5）；另一瓶 T75 培养瓶中的 MF 培养物按 1:3 比例冻存或继续传代。
注意：通过流式细胞术分析时，预期来源于间充质的胃肠道黏膜间质成纤维细胞（MF）在体外培养中具有以下表型：EpCAM-、CD31-、CD45-、vimentin+、α-SMA+、CD90+。
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结果
采用此酶消化方案，我们 consistently 能够从胃肠道手术标本和活检组织中分离并培养出 MF 群体的肠道 CD90+ 黏膜间质细胞（图 1）。在将单个核细胞悬液接种至 6 孔板后的第 2 至 5 天，可观察到明显的 MF 克隆增殖（图 1A-B）。MF 原代培养物在第 7 至 11 天达到约 50 - 70% 的汇合度（图 1C-D）。
图 1. 从冷冻胃肠道组织中分离的原代肌成纤维细胞（MFs）。从人结肠黏膜冷冻标本中分...
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讨论
尽管本方案仅针对科研应用而开发，但鉴于基质细胞作为潜在癌症预后生物标志物及治疗靶点的重要性日益凸显，能够冻存"功能性"生物样本以供后续使用具有显著优势。这对于建立临床生物样本库具有独特意义，可作为推动个体化医学发展的重要工具10, 11。与既往报道的从冻存的脂肪基质血管组分中分离的间充质干细胞结果类似，我们未观察到从冻存黏膜样本中分离的成纤维细胞（MFs）在标志物表达、增殖/免疫/炎症反应及代谢活性方面存在显著变化12。然而，我们不能排除某些未检测的反应（如细胞外标志物沉积等）可能存在差异。因此，在研究未知或尚未报道的事件时，研究者可设计对照实验，将来自同一供体的冻存与新鲜组织中分离的成纤维细胞进行平行比较，以验证特定功能是否受到影响。
目前大多数肌成纤维细胞的分离技术主要基于对组织进行机械切割，并结合使用螯合剂［乙二胺四乙酸（EDTA）、DL-二硫苏糖醇（DTT）］或胶原酶和蛋白酶处理13-14。先前已有报道表明，采用Mahida et al首次描述的组织块贴壁法，通过机械切割并应...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（1R01DK103150-01A1、T32 DK007639、R01CA175803、K08CA125209）、德克萨斯大学医学分部转化科学研究所及临床与转化科学奖（8UL1TR000071）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| MEM，1x | Corning | MT-10-010-CV | |
| 汉克斯平衡盐溶液 | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| 丙酮酸钠 | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| 抗生素-抗真菌素，100x | Gibco | 15240-062 | |
| 盐酸环丙沙星 | Corning | 61-277-RF | |
| L-谷氨酰胺，100x | Corning | 25-005-CI | |
| MEM 非必需氨基酸 | Corning | 25-025-CI | |
| 二甲基亚砜（DMSO）Hybri-Max | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DL-二硫苏糖醇溶液（DTT） | Sigma-Aldrich | 646563 | |
| 0.5 M EDTA，pH 8.0 | Cellgro | 46-034-CI | |
| DNA酶 | Worthington | LS002139 | |
| 来自 Clostridium histolyticum 的胶原酶，I型 | Sigma-Aldrich | C1639 | |
| 来自 Clostridium histolyticum 的胶原酶，II型 | Sigma-Aldrich | C1764 | |
| 来自 Clostridium histolyticum 的胶原酶，IV型 | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Accumax 细胞解离溶液 | Sigma-Aldrich | A7089 | |
| gentleMACS C 管 | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACS 解离仪 | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Countess 自动细胞计数仪 | Invitrogen | C10227 | |
| 细胞筛（70 µm） | Corning | 352350 | |
| PE 小鼠抗人波形蛋白抗体 | BD Biosciences | 562337 | 克隆 RV202 |
| FITC 单克隆抗肌动蛋白抗体，α-平滑肌 | Sigma-Aldrich | F3777 | 克隆 1A4 |
| APC 小鼠抗人 CD90 抗体 | BD Biosciences | 559869 | 克隆 5E10 |
参考文献
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