启动永生化多能耳源性祖细胞的分化

摘要

本文描述了永生化多能耳源性前体细胞（iMOP）的培养维持及耳源性分化现有方案。重点介绍了可指示向感觉上皮和螺旋神经节神经元（SGN）分化的培养条件与分子标志物。

摘要

利用人诱导多能干细胞（iPSC）或胚胎干细胞（ESC）进行细胞替代治疗具有广阔前景。然而，分化细胞产量低以及细胞群体异质性等若干限制因素阻碍了干细胞治疗的发展。为此，研究人员建立了命运受限的永生化多能耳源性祖细胞（iMOP）细胞系，以促进大量功能性毛细胞和螺旋神经节神经元（SGN）的高效分化，用于内耳细胞替代治疗。本研究从单个iMOP细胞的解离培养出发，描述了通过撤除碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）以诱导细胞周期退出和分化的实验方案。通过EdU细胞增殖检测证实，撤除bFGF后增殖细胞数量显著减少。在增殖减少的同时，细胞成功分化，表现为分子标志物的表达及形态学改变。对iMOP来源的耳球体进行Cdkn1b（p27^KIP）和Cdh1（E-钙黏蛋白）的免疫染色，可作为其向内耳感觉上皮分化的指标；而Cdkn1b与Tubb3（神经元β-微管蛋白）的免疫染色则用于鉴定iMOP来源的神经元。iMOP细胞的应用为理解内耳神经感觉祖细胞的命运决定提供了重要工具，并有助于开发高效生成大量iPSC或ESC来源毛细胞和SGN的实验方案。这些方法将加速用于替代治疗的耳源性细胞的制备进程。

引言

内耳器官包括耳蜗、椭圆囊、球囊和三个半规管，负责听觉和平衡功能。在耳蜗内，毛细胞将声音转化为电信号，并传递给螺旋神经节神经元（SGN）。SGN通过产生动作电位，将神经信号沿听觉通路传导。基因突变、耳毒性药物以及暴露于强噪声环境等因素均可导致毛细胞和SGN死亡，进而引起听力损失^1-4一旦丢失，这些细胞无法再生。利用诱导多能干细胞（iPSC）和胚胎干细胞（ESC）生成新生毛细胞或螺旋神经节神经元（SGNs）在内耳细胞替代治疗中具有广阔前景。^5-8近年来，大量研究进展表明，多能干细胞和内耳来源的前体细胞可在不同成熟阶段分化为毛细胞和螺旋神经节神经元（SGNs）。哺乳动物的胚胎干细胞（ESC）和诱导性多能干细胞（iPSC）均可用于生成具有功能的毛细胞和SGNs。^9-11. 已发现源自哺乳动物内耳的干细胞和前体细胞能够形成具有其特性的毛细胞和神经元 体内 细胞对应物^12-16.

利用诱导多能干细胞（iPSC）或胚胎干细胞（ESC）来源的耳部前体细胞替代丢失的毛细胞和螺旋神经节神经元（SGN），需要高效的分化过程。移植后的干细胞来源前体细胞若发生分化异常或持续增殖，可能加剧内耳功能障碍，并带来致瘤风险，例如在内耳形成畸胎瘤¹⁷。因此，迫切需要建立合适的培养条件，并深入理解耳部前体细胞的分化机制。开发此类方法的一个策略是模拟内耳发育过程中神经感觉前体细胞所经历的细胞命运决定过程。能够抑制增殖并引导耳部前体细胞定向分化为毛细胞或螺旋神经节神经元的实验方案，将有助于提高细胞替代疗法的安全性和有效性。

在发育过程中，内耳起源于菱脑节5和6之间特定区域的表面外胚层增厚，形成耳囊原基。随着耳囊原基内陷形成耳杯结构，耳杯前部的一群细胞发育为具有神经-感觉潜能的区域（NSD），该区域包含内耳毛细胞和神经元的前体细胞¹⁸。来自小鼠、鸡和斑马鱼内耳发育过程中的命运图谱研究表明，存在多种神经感觉前体细胞群体，它们分别分化为感觉毛细胞、周围的支持细胞以及耳囊神经元^19-22。高迁移率族转录因子Sox2已被证实参与感觉细胞的特化过程，并被用作内耳前体细胞的标记物^23,24。在内耳中Sox2表达水平降低的低效等位基因突变会导致耳蜗中毛细胞、支持细胞以及螺旋神经节神经元（SGNs）的缺失^25,26。

为研究耳源性前体细胞在细胞命运决定过程中的行为，此前已建立了一种命运受限的永生化多能耳源性前体（iMOP）细胞系，该细胞系源自表达Sox2的耳蜗前体细胞。iMOP细胞最初取自胚胎期E12.5至E13.5阶段的耳蜗组织，并通过c-Myc逆转录病毒感染获得永生化²⁷iMOP细胞能够持续增殖，形成称为耳球的克隆集落，并具有分化为毛细胞、支持细胞和螺旋神经节神经元（SGNs）的能力。²⁷了解iMOP细胞分化为不同耳源性谱系的能力，有助于将这些发现应用于高效生成由iPSC或ESC衍生的毛细胞和螺旋神经节神经元（SGNs）。高效的分化方案将为常规治疗难以治愈的内耳疾病开辟细胞替代疗法的新途径。通过iPSC或ESC生成耳源性细胞的一个关键问题在于 体外 细胞培养中，分化标志物有助于判断细胞是否正在经历分化过程。Cdkn1b（p27）^KIP) 已被广泛用作发育中内耳分化的早期标志物，但 Cdkn1b 在 iMOP 细胞中的表达及其与分化的关系尚未被研究。本研究描述了现有的培养条件以及 Cdkn1b 表达与其他 iMOP 细胞分化标志物之间的相关性。

方案

1. 维持 IMOP 细胞的自我更新

1. 配制 iMOP 培养基：DMEM/F12、1× B27 添加剂、25 µg/ml 羧苄青霉素和 20 ng/ml bFGF。使用无菌试剂配制 50 ml iMOP 培养基。将 49 ml DMEM/F12 加入 50 ml 锥形管中，并在 37 °C 水浴中预热。
   1. 在 37 °C 水浴中解冻 50× B27 添加剂和经滤膜除菌的 100 mg/ml 羧苄青霉素分装液，持续约 5 分钟。在室温下解冻 100 µg/ml bFGF 分装液。向 DMEM/F12 中加入 1 ml 50× B27、10 µl 100 µg/ml bFGF 和 12.5 µl 100 mg/ml 羧苄青霉素。
2. 在 60 mm 组织培养皿中使用 3 ml 培养基培养 iMOP 细胞。每隔一天通过加倍培养基体积的方式更换新鲜培养基。确保 bFGF 浓度不低于 5 ng/ml。
   1. 将 iMOP 细胞在 37 °C、5% CO₂ 条件下培养。培养 5–7 天后按以下步骤进行传代。使用 10 ml 移液枪头将培养物转移至 15 ml 锥形管中。
3. 通过将 0.1 ml 0.5 M EDTA（pH 8.0）稀释至 50 ml HBSS 中，配制 1 mM EDTA 的 HBSS 溶液。将配制好的 1 mM EDTA HBSS 溶液在 37 °C 水浴中预热。
4. 通过重力沉降法或在室温下以 200 × g 离心 5 分钟收集细胞。对于重力沉降法，将含有培养物的 15 ml 锥形管置于 37 °C 培养箱中 5–10 分钟。之后观察耳球体是否已沉降至 15 ml 锥形管底部。
   注意：过高的离心力可能导致细胞损伤。
5. 使用 2 ml 吸液枪头小心吸除废弃培养基，避免扰动细胞沉淀。向细胞沉淀中加入 0.5 ml 预热的 1 mM EDTA HBSS 溶液。使用 P1000 移液器轻轻吹打 2–3 次。将锥形管置于 37 °C 条件下孵育 <5 分钟，以促进细胞解离为单细胞悬液。
6. 轻轻摇动细胞悬液，判断耳球体是否已完全解离。若无耳球体沉降至锥形管底部，则表明细胞已解离。孵育时间可能因情况而异。
   注意：EDTA 处理时间过长会导致细胞死亡率显著升高。
7. 将细胞从 37 °C 取出，加入 2 ml 培养基以中和并稀释 EDTA。在室温下以 200 × g 离心 5 分钟收集细胞。使用 2 ml 吸液枪头吸除稀释后的 EDTA 溶液，并加入 5 ml 1× PBS 洗涤细胞。
8. 在室温下以 200 × g 离心 5 分钟，使用 2 ml 吸液枪头吸除 1× PBS。使用 P1000 移液器将细胞沉淀重悬于 0.5 ml iMOP 培养基中，轻轻吹打 2–3 次。
9. 使用配备适当微流控计数板的微流控颗粒计数仪进行细胞计数²⁸。一个汇合的 iMOP 细胞培养皿约含有 ~6 × 10⁶ 个细胞。将细胞悬液用培养基按 1:100 稀释，取 75 µl 加入计数板中进行计数。将 1 × 10⁶ 个细胞接种至 6 cm 培养皿中（iMOP 培养基中约 1:10 稀释）。每 5–7 天传代一次 iMOP 细胞。
   注意：形成较大耳球体或贴附于组织培养皿底部的细胞会发生分化。若培养物过度汇合，细胞也会发生死亡。

2. IMOP 细胞的冻存与复苏

1. 在冻存细胞前，将合成冻存液解冻并平衡至 4 °C，以制备合成冻存液。
2. 从一个汇合的 6 cm 培养皿中收集 iMOP 细胞。使用 10 ml 移液器将细胞（约 6 - 8 × 10⁶ 个细胞）转移至 15 ml 锥形离心管中。
3. 通过重力沉降或在室温下以 200 × g 离心 5 分钟收集细胞。如果耳球体较小，细胞将无法通过重力沉降沉淀。可选：使用步骤 1.9 计数细胞，以确定总细胞数量。
4. 使用 2 ml 吸液移液器吸除废弃培养基，同时保留松散的细胞沉淀。
5. 加入 0.25 ml 合成冻存液，将细胞重悬至密度约为 5 × 10⁵ 至 3 × 10⁶ 个细胞/ml。使用 P1000 移液器轻轻吹打混匀。使用带 1 ml 滤芯吸头的 P1000 移液器将细胞悬液转移至冻存管中。
6. 将冻存管放入无酒精的冻存盒中，并将冻存盒置于 -80 °C 环境中，使温度以每分钟 1 °C 的速率下降，直至达到 -80 °C。
7. 如需长期保存细胞，应将冻存管转移至液氮储存罐的气相中。复苏细胞时，先将含有冻存细胞的冻存管在 -80 °C 下平衡。
8. 将 iMOP 培养基在 37 °C 水浴中预热。
9. 将冻存管在 37 °C 水浴中轻轻旋转管底，快速解冻。当最后一块冰晶消失后，立即向解冻的细胞中加入 1 ml 预热的 iMOP 培养基。将细胞转移至 15 ml 锥形离心管中，并额外加入 4 ml iMOP 培养基。
10. 在 200 × g 条件下离心 15 ml 锥形管 5 分钟，吸除上清培养基。用 2 ml iMOP 培养基重悬细胞，并将细胞接种至 6 cm 培养皿中。将培养物置于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育以进行扩增。

3. 将 IMOP 细胞分化为感觉上皮

1. 制备50 ml iMOP感觉上皮分化培养基：DMEM/F12，1X B27补充剂，25 µg/ml羧苄西林。在50 ml锥形管中将49 ml DMEM/F12置于37 °C水浴中预热。在37 °C水浴中解冻50X B27补充剂和100 mg/ml羧苄西林分装液5分钟。向DMEM/F12中加入1 ml 50X B27和12.5 µl 100 mg/ml羧苄西林，配制成50 ml iMOP感觉上皮分化培养基。
2. 收获、解离、重悬并计数细胞，请重复步骤1.4–1.9。
3. 在第-3天，使用iMOP培养基将1 × 10⁶个细胞接种至6 cm培养皿中。在第0天，用10 ml移液器将培养物转移至15 ml锥形管中。按照步骤1.6所述方法，通过重力沉降收集耳球体。使用2 ml吸液移液器吸除废弃培养基，保留耳球体在锥形管底部。
4. 轻柔加入2 ml感觉上皮分化培养基。使用大孔径10 ml移液器将耳球体转移至6 cm培养皿。
   注意：剧烈吹打可能因机械剪切作用导致耳球体细胞解离。
5. 每隔一天向培养物中添加2 ml新鲜的感觉上皮分化培养基。如有需要，可通过重力沉降收集细胞，并更换培养基。
6. 在第10天，将培养物转移至15 ml锥形管，按照步骤1.6所述让耳球体沉降，收集耳球体。使用2 ml吸液移液器吸除废弃培养基，保持耳球体不受扰动。
7. 在室温下用含4%多聚甲醛的1X PBS固定耳球体15分钟。移除多聚甲醛溶液，用洗涤缓冲液（含0.1% Triton X-100的1X PBS）洗涤耳球体，随后在封闭缓冲液（含10%正常山羊血清和0.1% Triton X-100的1X PBS）中孵育1小时。
   1. 更换缓冲液，加入稀释的一抗，在4 °C孵育。用含0.1% Triton X-100的1X PBS洗涤样本，对耳球体进行免疫染色²⁷。将耳球体转移至1X PBS中，使用P1000移液器将其置于载玻片的封片剂中，盖上盖玻片，并在4 °C下让封片剂干燥。
8. 使用配备16位CCD相机以及20X 0.75空气物镜或40X 1.3 NA油浸物镜的倒置显微镜系统采集落射荧光图像。使用以下波长（激发和发射）采集不同荧光通道的信号：蓝色（377 ± 25 nm / 447 ± 30 nm），绿色（475 ± 25 nm / 540 ± 25 nm），红色（562 ± 20 nm / 625 ± 20 nm）和红外（628 ± 20 nm / 692 ± 20 nm）。

4. EdU 掺入检测

1. 在第 -3 天，将 1 × 10⁶ 个 iMOP 细胞接种于一个 6 cm 培养皿中。三天后的第 0 天，收获细胞，消化解离，重悬并计数，重复步骤 1.4–1.9。
2. 将 2.5 × 10⁵ 个细胞接种于 iMOP 培养基中，另将 5 × 10⁵ 个细胞接种于感觉上皮分化培养基中，分别置于 6 孔板的不同孔中。
3. 在第 3 天通过 EdU 掺入实验测定处于 S 期的细胞百分比
   1. 将 EdU 储存液直接加入 iMOP 培养物中，使培养基中 EdU 的终浓度为 1 µM。
   2. 在 37 °C、5% CO₂ 条件下，将 EdU 与 iMOP 培养物共同孵育 2 小时 。收获细胞，消化解离并收集细胞，重复步骤 1.4–1.9。加入含 4% 多聚甲醛的 1× PBS，室温固定 15 分钟。在室温下以 200 × g 离心 5 分钟收集细胞。移除多聚甲醛溶液并妥善处理。
   3. 根据制造商说明书，使用 Hoechst 对细胞核进行染色，并使用绿色荧光染料-叠氮化物标记掺入的 EdU。
      注意：所有洗涤步骤均使用含 1× PBS、3% BSA 和 0.1% Tween 20 的溶液进行，用 1× PBS 洗涤细胞两次。
   4. 使用抗荧光淬灭剂将细胞封片，盖上 1.5 盖玻片。采用落射荧光显微镜获取标记细胞的荧光图像。

5. 分化IMOP来源的神经元

1. 配制50 ml神经元分化培养基：Neurobasal培养基、1X B27添加剂、2 mM L-谷氨酰胺。将50X B27添加剂和200 mM L-谷氨酰胺溶液在37 °C水浴中解冻5分钟。向48.5 ml Neurobasal培养基中加入1 ml 50X B27添加剂和0.5 ml 200 mM L-谷氨酰胺。
2. 将12 mm圆形1.5级玻璃盖玻片放入无菌10 cm培养皿中，并向皿内加入70%乙醇，以对盖玻片进行灭菌和清洁。
3. 轻轻振荡盖玻片，确保其完全被乙醇覆盖，在室温下静置10分钟。用无菌1X PBS清洗盖玻片3次，以去除残留乙醇。再用无菌H₂O清洗盖玻片1次，以去除残留的1X PBS。
4. 使用2 ml移液器吸除H₂O，让盖玻片自然干燥。将盖玻片置于生物安全柜中用紫外光照射15分钟。若不立即使用，应将盖玻片保存在无菌环境中。
5. 将一片12 mm圆形盖玻片放入24孔板的每一孔中。轻轻摇动培养板，确保盖玻片平整地贴附于孔底。
6. 在室温下解冻2 mg/ml聚-D-赖氨酸储备液，并用1X PBS稀释至10 µg/ml的工作浓度。向每孔中加入0.25 ml 10 µg/ml聚-D-赖氨酸溶液。将培养板置于37 °C培养箱中孵育1小时。
7. 用无菌1X PBS清洗各孔3次。在室温下解冻10 mg/ml层粘连蛋白储备液，并用1X PBS稀释至10 µg/ml。向24孔板的单个孔中加入0.25 ml 10 µg/ml层粘连蛋白工作液。将培养板置于37 °C培养箱中孵育。使用2 ml移液器吸除层粘连蛋白溶液。
8. 使用P1000移液器向每孔加入1 ml 1X PBS，再用2 ml移液器吸除，重复此洗涤步骤共3次。最后一次洗涤后保留1X PBS于孔中，直至细胞准备接种。通过执行步骤1.4–1.9进行细胞收获、解离和计数，启动神经元分化。在第-3天，将1 × 10⁶个细胞接种至6 cm培养皿中。
9. 在第0天，重复步骤1.4–1.9进行细胞收获、解离和计数。将1 × 10⁵ 至 1.5 × 10⁵个iMOP细胞接种至24孔板的每孔中，每孔加入0.5 ml预热的神经元分化培养基。每隔一天吸除旧培养基并更换为预热的神经元分化培养基。
10. 在第7天，用4%多聚甲醛在室温下固定iMOP来源的神经元15分钟。吸除多聚甲醛溶液，用洗涤缓冲液（含0.1% Triton X-100的1X PBS）清洗iMOP来源的神经元，然后在封闭缓冲液（含10%正常山羊血清和0.1% Triton X-100的1X PBS）中于室温孵育1小时。
    1. 更换缓冲液，将样品在含稀释抗体的封闭缓冲液中孵育，4 °C孵育过夜。使用含0.1% Triton X-100的1X PBS清洗样品，进行免疫染色²⁷。在将盖玻片置于封片剂上之前，先用1X PBS清洗。将封片后的样品在4 °C下干燥，然后按照步骤3.8所述条件采集落射荧光图像。

结果

bFGF 撤除降低 IMOP 细胞的增殖

为了降低iMOP细胞的增殖能力并启动其分化，从培养体系中撤除bFGF。为证实生长因子的撤除可降低细胞增殖，采用EdU掺入法作为增殖检测手段。比较了在iMOP培养基（含bFGF）中培养的听球体与在感觉上皮培养基（不含bFGF）中培养的听球体中掺入EdU的细胞百分比。听球体培养物经核苷酸类似物EdU脉冲标记后收集并固定，通过点击化学反应使用Alexafluor 488叠氮化物对掺入的EdU核苷酸进行荧光标记。结果显示，在缺乏bFGF条件下培养的听球体细胞中，EdU掺入率显著低于含bFGF培养条件下的细胞（图1A-F）。随着听球体体积增大，使用落射荧光显微镜观察整个听球体中所有细胞变得愈发困难。为解决这一问题，将细胞解离后制片，以便对细胞进行清晰的大规模观察（en mass）。然而，即使在解离和固定后，细胞仍倾向于重新聚集。为维持细...

讨论

监测 IMOP 培养物

本文描述了一种用于维持新型iMOP细胞系自我更新能力并促进其分化的实验方案，并提供了额外的铺板格式（表1）。文中指出了若干有助于iMOP细胞常规扩增与分化操作的关键步骤。与多能干细胞培养类似，iMOP细胞在理论上具有无限的生命周期。为确保细胞系得到妥善维持，需常规监测iMOP细胞的存活率、自我更新能力及分化潜能。在细胞解离后，通过台盼蓝染色法测定细胞存活率。通常情况下，解离后的细胞存活率超过70%。为监测iMOP细胞的自我更新能力，可使用c-Myc和Sox2抗体进行免疫染色。在增殖性培养条件下，iMOP细胞的倍增时间约为18小时。自我更新标志物表达水平或倍增时间的改变可能提示自我更新能力发生变化。为评估iMOP细胞的分化潜能，可通过检测细胞周期退出情况以及感觉上皮或神经元早期标志物的表达来判断其分化能力。若iMOP细胞未能通过上述任一标准检测，则建议终止该细胞培养。

影响 IMOP 培养的因素

...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
无酒精细胞冷冻容器 CoolCell LX	BioCision	BCS-405
冻存管（2 ml）	Corning	430654
1.5 厚度玻璃盖玻片（圆形，直径 12 mm）	Electron Microscopy Sciences	72230-01
DMEM/F12	Life Technologies	11320-082
Neurobasal 培养基	Life Technologies	21103
磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4	Life Technologies	10010-023
Hank's 平衡盐溶液（HBSS）	Life Technologies	14025-092
B27 添加剂（50X），无血清	Life Technologies	17504-044	以 1 ml 分装保存
L-谷氨酰胺（200 mM）	Life Technologies	25030-081	以 5 ml 分装保存
天然小鼠层粘连蛋白	Life Technologies	23017-015	以 1 mg/ml 分装保存
Click-iT EdU Alexa Fluor 488	Life Technologies	C10337
Synth-A-Freeze 冷冻保存培养基	Life Technologies	A12542-01
Prolong Gold 抗荧光淬灭封片剂	Life Technologies	47743-736	以 10 mg/ml 的 100 µl 分装保存
Moxi Z Mini 自动细胞计数仪	Orflo	MXZ001
Moxi Z S 型计数卡盒	Orflo	MXC002
重组小鼠碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）	Peprotech	450-33	用含 0.1% BSA 的 H2O 重悬，并以 20 mg/ml 分装保存
多聚-D-赖氨酸	Sigma	P7886	用 1× PBS 重悬，并以 10 mg/ml 的 100 µl 分装保存
羧苄青霉素二钠盐	Thermo Fisher Scientific	BP2648-1	用 10 mM Hepes（pH 7.4）重悬，并以 100 mg/ml 分装保存
5 ml 移液管，单支纸包（每箱 200 支）	Thermo Fisher Scientific	1367811D
10 ml 移液管，单支纸包（每箱 200 支）	Thermo Fisher Scientific	1367811E
组织培养处理 Biolite 24 孔板	Thermo Fisher Scientific	130188
组织培养处理 Biolite 6 孔板	Thermo Fisher Scientific	130184
组织培养处理 6 cm 培养皿	Thermo Fisher Scientific	130181
EMD Millipore Millex 无菌 PVDF 针式滤器，孔径：0.22 μm	Thermo Fisher Scientific	SLGV033RS
TipOne 滤芯吸头，0.1 - 10 μl，加长滤芯吸头	USA Scientific	1120-3810
TipOne 滤芯吸头，1 - 20 μl，滤芯吸头	USA Scientific	1120-1810
TipOne 滤芯吸头，1 - 200 μl ，滤芯吸头	USA Scientific	1120-8810
TipOne 滤芯吸头，101 - 1000 μl，滤芯吸头	USA Scientific	1126-7810
15 ml 无菌锥形离心管，20 袋，每袋 25 支（共 500 支）	USA Scientific	1475-0511
50 ml 无菌锥形离心管，20 袋，每袋 25 支（共 500 支）	USA Scientific	1500-1211