方法文章

启动永生化多能耳源性祖细胞的分化

DOI：

10.3791/53692

⸱

2016年1月2日

 ,  ,  ,  , 
1Cell Biology & Neuroscience, Rutgers University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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本文描述了永生化多能耳源性前体细胞（iMOP）的培养维持及耳源性分化现有方案。重点介绍了可指示向感觉上皮和螺旋神经节神经元（SGN）分化的培养条件与分子标志物。

摘要

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利用人诱导多能干细胞（iPSC）或胚胎干细胞（ESC）进行细胞替代治疗具有广阔前景。然而，分化细胞产量低以及细胞群体异质性等若干限制因素阻碍了干细胞治疗的发展。为此，研究人员建立了命运受限的永生化多能耳源性祖细胞（iMOP）细胞系，以促进大量功能性毛细胞和螺旋神经节神经元（SGN）的高效分化，用于内耳细胞替代治疗。本研究从单个iMOP细胞的解离培养出发，描述了通过撤除碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）以诱导细胞周期退出和分化的实验方案。通过EdU细胞增殖检测证实，撤除bFGF后增殖细胞数量显著减少。在增殖减少的同时，细胞成功分化，表现为分子标志物的表达及形态学改变。对iMOP来源的耳球体进行Cdkn1b（p27KIP）和Cdh1（E-钙黏蛋白）的免疫染色，可作为其向内耳感觉上皮分化的指标；而Cdkn1b与Tubb3（神经元β-微管蛋白）的免疫染色则用于鉴定iMOP来源的神经元。iMOP细胞的应用为理解内耳神经感觉祖细胞的命运决定提供了重要工具，并有助于开发高效生成大量iPSC或ESC来源毛细胞和SGN的实验方案。这些方法将加速用于替代治疗的耳源性细胞的制备进程。

引言

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内耳器官包括耳蜗、椭圆囊、球囊和三个半规管，负责听觉和平衡功能。在耳蜗内，毛细胞将声音转化为电信号，并传递给螺旋神经节神经元（SGN）。SGN通过产生动作电位，将神经信号沿听觉通路传导。基因突变、耳毒性药物以及暴露于强噪声环境等因素均可导致毛细胞和SGN死亡，进而引起听力损失1-4一旦丢失，这些细胞无法再生。利用诱导多能干细胞（iPSC）和胚胎干细胞（ESC）生成新生毛细胞或螺旋神经节神经元（SGNs）在内耳细胞替代治疗中具有广阔前景。5-8近年来，大量研究进展表明，多能干细胞和内耳来源的前体细胞可在不同成熟阶段分化为毛细胞和螺旋神经节神经元（SGNs）。哺乳动物的胚胎干细胞（ESC）和诱导性多能干细胞（iPSC）均可用于生成具有功能的毛细胞和SGNs。9-11. 已发现源自哺乳动物内耳的干细胞和前体细胞能够形成具有其特性的毛细胞和神经元 体内 细胞对应物12-16.

利用诱导多能干细胞（iPSC）或胚胎干细胞（ESC）来源的耳部前体细胞替代丢失的毛细胞和螺旋神经节神经元（SGN），需要高效的分化过程。移植后的干细胞来源前体细胞若发生分化异常或持续增殖，可能加剧内耳功能障碍，并带来致瘤风险，例如在内耳形成畸胎瘤17。因此，迫切需要建立合适的培养条件，并深入理解耳部前体细胞的分化机制。开发此类方法的一个策略是模拟内耳发育过程中神经感觉前体细胞所经....

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方案

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1. 维持 IMOP 细胞的自我更新

  1. 配制 iMOP 培养基：DMEM/F12、1× B27 添加剂、25 µg/ml 羧苄青霉素和 20 ng/ml bFGF。使用无菌试剂配制 50 ml iMOP 培养基。将 49 ml DMEM/F12 加入 50 ml 锥形管中，并在 37 °C 水浴中预热。
    1. 在 37 °C 水浴中解冻 50× B27 添加剂和经滤膜除菌的 100 mg/ml 羧苄青霉素分装液，持续约 5 分钟。在室温下解冻 100 µg/ml bFGF 分装液。向 DMEM/F12 中加入 1 ml 50× B27、10 µl 100 µg/ml bFGF 和 12.5 µl 100 mg/ml 羧苄青霉素。
  2. 在 60 mm 组织培养皿中使用 3 ml 培养基培养 iMOP 细胞。每隔一天通过加倍培养基体积的方式更换新鲜培养基。确保 bFGF 浓度不低于 5 ng/ml。
    1. 将 iMOP 细胞在 37 °C、5% CO2 条件下培养。培养 5–7 天后按以下步骤进行传代。使用 10 ml 移液枪头将培养物转移至 15 ml 锥形管中。
  3. 通过将 0.1 ml 0.5 M EDTA（pH 8.0）稀释至 50 ml HBSS 中，配制 1 mM EDTA 的 HBSS 溶液。将配制好的 1 mM EDTA HBSS 溶液在 37 °C 水....

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结果

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bFGF 撤除降低 IMOP 细胞的增殖

为了降低iMOP细胞的增殖能力并启动其分化，从培养体系中撤除bFGF。为证实生长因子的撤除可降低细胞增殖，采用EdU掺入法作为增殖检测手段。比较了在iMOP培养基（含bFGF）中培养的听球体与在感觉上皮培养基（不含bFGF）中培养的听球体中掺入EdU的细胞百分比。听球体培养物经核苷酸类似物EdU脉冲标记后收集并固定，通过点击化学反应使用Alexafluor 488叠氮化物对掺入的EdU核苷酸进行荧光标记。结果显示，在缺乏bFGF条件下培养的听球体细胞中，EdU掺入率显著低于含bFGF培养条件下的细胞（图1A-F）。随着听球体体积增大，使用落射荧光显微镜观察整个听球体中所有细胞变得愈发困难。为解决这一问题，将细胞解离后制片，以便对细胞进行清晰的大规模观察（en mass）。然而，即使在解离和固定后，细胞仍倾向于重新聚集。为维持细.......

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讨论

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监测 IMOP 培养物

本文描述了一种用于维持新型iMOP细胞系自我更新能力并促进其分化的实验方案，并提供了额外的铺板格式（表1）。文中指出了若干有助于iMOP细胞常规扩增与分化操作的关键步骤。与多能干细胞培养类似，iMOP细胞在理论上具有无限的生命周期。为确保细胞系得到妥善维持，需常规监测iMOP细胞的存活率、自我更新能力及分化潜能。在细胞解离后，通过台盼蓝染色法测定细胞存活率。通常情况下，解离后的细胞存活率超过70%。为监测iMOP细胞的自我更新能力，可使用c-Myc和Sox2抗体进行免疫染色。在增殖性培养条件下，iMOP细胞的倍增时间约为18小时。自我更新标志物表达水平或倍增时间的改变可能提示自我更新能力发生变化。为评估iMOP细胞的分化潜能，可通过检测细胞周期退出情况以及感觉上皮或神经元早期标志物的表达来判断其分化能力。若iMOP细胞未能通过上述任一标准检测，则建议终止该细胞培养。

影响 IMOP 培养的因素

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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本工作部分得到了邓肯和南希·麦克米兰教职发展讲席捐赠基金（K.Y.K.）、布什生物医学研究资助（K.Y.K.）以及罗格斯大学教职发展资助（K.Y.K.）的支持。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
无酒精细胞冷冻容器 CoolCell LXBioCisionBCS-405
冻存管（2 ml） Corning430654
1.5 厚度玻璃盖玻片（圆形，直径 12 mm）Electron Microscopy Sciences72230-01
DMEM/F12Life Technologies11320-082
Neurobasal 培养基Life Technologies21103
磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4Life Technologies10010-023
Hank's 平衡盐溶液（HBSS）Life Technologies14025-092
B27 添加剂（50X），无血清Life Technologies17504-044以 1 ml 分装保存
L-谷氨酰胺（200 mM） Life Technologies25030-081以 5 ml 分装保存
天然小鼠层粘连蛋白Life Technologies23017-015以 1 mg/ml 分装保存
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Life TechnologiesC10337
Synth-A-Freeze 冷冻保存培养基Life TechnologiesA12542-01
Prolong Gold 抗荧光淬灭封片剂Life Technologies47743-736以 10 mg/ml 的 100 µl 分装保存
Moxi Z Mini 自动细胞计数仪Orflo MXZ001
Moxi Z S 型计数卡盒Orflo MXC002
重组小鼠碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）Peprotech450-33用含 0.1% BSA 的 H2O 重悬，并以 20 mg/ml 分装保存
多聚-D-赖氨酸SigmaP7886用 1× PBS 重悬，并以 10 mg/ml 的 100 µl 分装保存
羧苄青霉素二钠盐Thermo Fisher ScientificBP2648-1用 10 mM Hepes（pH 7.4）重悬，并以 100 mg/ml 分装保存
5 ml 移液管，单支纸包（每箱 200 支）Thermo Fisher Scientific1367811D
10 ml 移液管，单支纸包（每箱 200 支）Thermo Fisher Scientific1367811E
组织培养处理 Biolite 24 孔板Thermo Fisher Scientific130188
组织培养处理 Biolite 6 孔板Thermo Fisher Scientific130184 
组织培养处理 6 cm 培养皿Thermo Fisher Scientific130181 
EMD Millipore Millex 无菌 PVDF 针式滤器，孔径：0.22 μmThermo Fisher ScientificSLGV033RS
TipOne 滤芯吸头，0.1 - 10 μl，加长滤芯吸头USA Scientific1120-3810
TipOne 滤芯吸头，1 - 20 μl，滤芯吸头USA Scientific1120-1810
TipOne 滤芯吸头，1 - 200 μl ，滤芯吸头USA Scientific1120-8810
TipOne 滤芯吸头，101 - 1000 μl，滤芯吸头USA Scientific1126-7810
15 ml 无菌锥形离心管，20 袋，每袋 25 支（共 500 支）USA Scientific1475-0511
50 ml 无菌锥形离心管，20 袋，每袋 25 支（共 500 支）USA Scientific1500-1211

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Petit, C., Richardson, G. P. Linking genes underlying deafness to hair-bundle development and function. Nat Neurosci. 12 (6), 703-710 (2009).
  2. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after 'temporary'....

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iMOP bFGF EdU Cdkn1b Cdh1 Cdkn1b Tubb3

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