蛋白质常被用于标记节肢动物以开展扩散研究。本文展示了对节肢动物施加内源性和外源性蛋白质标记的方法，同时也介绍了通过间接或夹心式酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测蛋白质标记的技术。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
监测节肢动物的移动对于更好地理解其相关的种群动态、扩散模式、寄主植物偏好以及其他生态相互作用通常十分必要。在自然环境中，通常通过为节肢动物标记独特的标识，然后在不同时间和空间重新采集个体，以确定其扩散能力。除了使用彩色粉尘或染料等物理标记外，多种蛋白质已被证明在生态学研究中对节肢动物标记非常有效。蛋白质可通过体内和/或体外方式施加。随后可通过针对特定蛋白质的酶联免疫吸附测定法（ELISA）在重新捕获的节肢动物上检测这些蛋白质标记。本文描述了对节肢动物进行体外和体内蛋白质标记的操作方案。文中展示了两个简单的实验示例：（1）通过提供富含蛋白质的食物，将蛋白质标记引入昆虫体内；（2）使用医用雾化器将蛋白质标记直接喷洒于昆虫体表。随后，我们详细介绍了用于检测昆虫体表蛋白质标记的夹心法ELISA和间接法ELISA的逐步操作流程。本演示中讨论了在标记-释放-重捕、标记-捕获以及自标记-捕获等类型研究中，节肢动物蛋白质标记的获取与检测的各个方面，同时介绍了免疫标记技术如何被广泛调整以适应多种不同的研究目标。
引言
追踪节肢动物害虫、天敌（寄生性天敌和捕食性天敌）以及传粉昆虫在自然环境中的移动，对于深入理解如何提升生态系统服务功能至关重要。大多数扩散研究的关键在于具备一种可靠的标记目标节肢动物的方法。已有多种材料（例如：油漆、染料、彩色粉尘、标签、稀有元素、蛋白质）被用于标记节肢动物，以评估其种群动态、扩散能力、取食行为及其他生态相互作用1,2。
用于特定扩散研究的标记物是否合适，取决于所进行研究的类型。节肢动物标记方法大致可分为三类：（1）标记-释放-再捕法（MRR），（2）标记-捕获法，（3）自标记-捕获法。在标记-释放-再捕研究中，研究者通常在实验室中对节肢动物进行集中标记，然后在野外某一中心位置将其释放。随后，在不同的空间和时间间隔内，利用多种采集装置对这些节肢动物进行再捕获例如扫网、真空吸虫器、粘虫 trap3,4,5重新捕获的标本随后将被检查特定标记，以区分放归个体与本地个体。在标记-重捕研究中，研究者通常在野外使用喷雾设备直接对标本进行标记。例如，背负式喷雾器，喷杆和喷嘴喷雾器）。用于标记-重捕研究的最佳标记物应价格低廉且易于施用于节肢动物栖息环境。在自标记-重捕研究中，研究者通常将标记物施加于节肢动物诱饵上6,7 或巢穴入口8节肢动物通过摄食标记过的诱饵在体内留下标记，或通过体外附着来标记自身 "刷洗" 当它离开巢穴....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 内部标记、保留与检测流程
- 内部标记步骤
- 从人工饲料饲养的实验室种群或野外采集目标昆虫（n ≈ 100 只），并将其分为两份，分别放入两个洁净的饲养容器中。
- 将一份常规的 20 ml 饲料包（未标记的阴性对照处理）放入其中一个容器中；在另一份 20 ml 人工饲料包中加入 1.0 ml 浓度为 1.0 mg/ml 的鸡 IgG/IgY 溶液，充分混匀后放入另一个容器中。
注意：若目标昆虫无适用的人工饲料，可将标记物添加至其常规食物中（例如，绿豆、蛾卵、水、糖、蜂蜜）。 - 让昆虫继续取食 24 小时。
- 内部标记保留步骤
- 从每个容器中取出饲料包，并为昆虫提供另一种食物来源以维持实验期间的生存（例如，绿豆）。
- 每天（或按所需时间间隔）从每种处理组中采集一批昆虫（n = 20），立即于 -20 °C 冷冻保存。
- 夹心 ELISA 步骤
- 将兔抗鸡 IgY 一抗用 Tris 缓冲盐水（TBS）按 1:500 稀释后，每孔加入 50 µl 至洁净的 ELISA 微孔板中，室温孵育至少 1 小时（注意：微孔板也可在 4 °C 过夜孵育）。
- 弃去孔内抗体溶液，每孔加入 300 µl 1.0....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
内部标记：
内部标记保留试验的结果如图2A所示。计算得到的ELISA临界阈值为0.054。总体而言（合并四个取样日期的数据），未饲喂蛋白质的昆虫ELISA值 consistently 较低（x̄ = 0.038 ± 0.002，n = 80）。相反，所有饲喂富含蛋白质饲料的昆虫均表现出 consistently 较高的ELISA值（x̄ = 0.475 ± 0.221，n = 80）。
外部标记：
外部标记保留试验的结果如图2B所示。计算得到的.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
节肢动物蛋白质免疫标记技术首次描述于近二十五年前9自那时起，该方法已被改进，用于研究多种节肢动物的扩散模式，通过体内和体外施用IgG/IgY进行标记。这些蛋白质已被证实可作为迄今测试的多种昆虫物种的稳定标记物。然而，如上所述，使用IgG/IgY的主要局限在于其成本极为昂贵。因此，IgG/IgY仅适用于大量昆虫可在小范围内集中标记的重捕标记回收（MRR）或自标记类研究，或可将标记物掺入饲料或诱饵中的实验。本文提供了一个简单示例，展示如何通过喂食添加了鸡源IgG/IgY的人工饲料，将内部标记物施用于目标昆虫。随后，采用夹心ELISA法检测昆虫体内的IgG/IgY。对于已使用含鸡蛋成分饲料的研究者而言，该体系可能尤为有利，因为该检测方法可自然识别鸡蛋中存在的IgG/IgY。此外，可使用上述医用雾化器将少量IgG/IgY蛋白通过体表方式施用于昆虫图 3A。首先使用雾化器将兔IgG用于大量标记非常微小且脆弱的寄生蜂，以进行MRR类型研究3此后，其他方法也被用于向节肢动物施加IgG/IgY标记，以开展扩散研究。例如，已有研究使用香水喷雾器将IgG/IgY标记应用于其他寄生.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
本出版物中提及的商标名称或商业产品仅为提供具体信息之目的，并不意味着美国农业部的推荐或认可。美国农业部为平等机会提供者和雇主。
致谢
本研究由美国农业部CRIS项目5347-22620-021-00D资助，部分由美国农业部国家食品与农业研究所农业与食品研究计划竞争性拨款2011-67009-30141资助。我们感谢Johanna Nassif提供的技术支持。同时感谢Paul Baker、David Horton、Diego Nieto和Frances Sivakoff提供用于图3的部分图片。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 昆虫饲养用食品储存容器 | Rubbermaid/Tupperware | 不同尺寸 | 不同制造商 &和供应商。网眼织物被粘贴在窗口处 |
| 小容量雾化器（Micro Mist） | Teleflex-Hudson RCI | 1881 | 可在网上和医疗用品商店购买。其他品牌也可使用。 |
| 1.6 ml 带盖微型离心管 | Continental Lab Products | 4445.X | 任何类似类型均可使用。我们更倾向于选择盖子易于开启的品牌。 |
| 用于微量离心管的泡沫塑料储存盒（5×20网格） | RPI Corp. | 145746 | 这种设计的优点在于不会使试管过于拥挤。 |
| 分配器，重复加样器 | Eppendorf | 4982000322 | 类似的操作将有助于加快分液速度。 |
| 研钵，塑料一次性组织研磨器，1.5 ml | Kimble Chase | 749521-1500 | 可从不同供应商处获取。研杵可清洗并经高压灭菌后重复使用。 |
| BD Falcon ELISA 板，96 孔（平底） | BD | 351172 | |
| Ovation 移液器，手动式（20-200） µl) | VistaLab | 1057-0200 或 1070-0200 | 任何类似类型均可使用。该型号符合人体工学设计。 |
| 储液器，无菌试剂 | VistaLab | 4054-1000 | 类似的东西均可使用。 |
| 电子移液器，8通道（50-1,200 µ（Biohit eLine） | 赛多利斯 | 730391 | 如果你必须选择一种电子模型，这种尺寸最为实用。 |
| 电子移液器，8通道（10-300 µl)（Biohit eLine） | 赛多利斯 | 730361 | 类似的东西均可使用。 |
| 多通道多孔板洗板机（8通道，直头） | Sigma-Aldrich | Z369802 | 类似的手动洗板操作均可采用此方法。 |
| 具有吸光度检测功能的微孔板读板仪 | Molecular Devices | SpectraMax 250 | 类似的方法均可适用。 |
| 鸡 IgG/IgY | 美国生物公司 | I1903-15R | 也可从其他来源获取 |
| 蛋清 | 杂货店 | “所有白人”, “Egg Beaters”, 等等。 | 将5 ml与95 ml dH混合25% 溶液的 O |
| Tris（Trizma Base） | Sigma-Aldrich | T1503 | 2.42 g/L 以配制 TBS |
| 氯化钠（NaCl） | Sigma-Aldrich | S9888 | 29.22 克/升以配制 TBS 和 8.0 g/PBS 的 L |
| 磷酸氢二钠（Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S0876 | 1.14 g/L PBS |
| 磷酸二氢钾（KH₂PO₄）2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | 0.2 g/L PBS |
| 氯化钾（KCl） | Sigma-Aldrich | P9541 | 0.2 g/L PBS |
| Tween 20，EIA 级 | Sigma-Aldrich | P1379 | 每升 PBS 在盐溶解后加入 0.5 ml。 |
| 含1% BSA的PBS | Sigma-Aldrich | P3688 | 将1包溶于1 L dH₂O中2O |
| 兔抗鸡IgY（IgG）（全分子）抗体（1:500） | Sigma-Aldrich | C6409 | 混合 100 µ50 ml TBS 中 |
| 脱脂牛奶、奶粉或鲜牛奶（1%） | 杂货店 | 将10 g与1 L dH₂O混合21% 溶液的 O | |
| 抗鸡IgY（IgG）（全分子）-辣根过氧化物酶抗体，兔源（1:10,000） | Sigma-Aldrich | A9046 | 混合 100 µ1 升 1% 脱脂牛奶中的升 |
| 兔抗鸡卵白蛋白抗体（1:8,000） | Sigma-Aldrich | C6534 | 稀释 125 µl 在 1 L PBS-BSA 中 |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（1:2,000） | Sigma-Aldrich | A6154 | 将0.5 ml稀释于1 L PBS-BSA中，然后加入1.3 ml Silwet |
| Vac-In-Stuff（Silwet L-77）硅氧烷-聚醚共聚物 | Lehle Seeds | VIS-01 | 最后加入该成分 |
| TMB 微孔板单组分过氧化物酶底物 | SurModics | TMBW-1000-01 |
参考文献
- Hagler, J. R., Jackson, C. G. Methods for marking insects: Current techniques and future prospects. Annu. Rev. Entomol. 46, 511-543 (2001).
- Lavandero, B. I., Wratten, S. E., Hagler, J. R., Jervis, M. A. The need for....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
