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方法文章

用于节肢动物扩散研究的蛋白质标记施加与检测

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DOI：

10.3791/53693

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2016年1月28日

 , 
1USDA-ARS, Arid-Land Agricultural Research Center

本文内容

摘要

蛋白质常被用于标记节肢动物以开展扩散研究。本文展示了对节肢动物施加内源性和外源性蛋白质标记的方法，同时也介绍了通过间接或夹心式酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测蛋白质标记的技术。

摘要

监测节肢动物的移动对于更好地理解其相关的种群动态、扩散模式、寄主植物偏好以及其他生态相互作用通常十分必要。在自然环境中，通常通过为节肢动物标记独特的标识，然后在不同时间和空间重新采集个体，以确定其扩散能力。除了使用彩色粉尘或染料等物理标记外，多种蛋白质已被证明在生态学研究中对节肢动物标记非常有效。蛋白质可通过体内和/或体外方式施加。随后可通过针对特定蛋白质的酶联免疫吸附测定法（ELISA）在重新捕获的节肢动物上检测这些蛋白质标记。本文描述了对节肢动物进行体外和体内蛋白质标记的操作方案。文中展示了两个简单的实验示例：（1）通过提供富含蛋白质的食物，将蛋白质标记引入昆虫体内；（2）使用医用雾化器将蛋白质标记直接喷洒于昆虫体表。随后，我们详细介绍了用于检测昆虫体表蛋白质标记的夹心法ELISA和间接法ELISA的逐步操作流程。本演示中讨论了在标记-释放-重捕、标记-捕获以及自标记-捕获等类型研究中，节肢动物蛋白质标记的获取与检测的各个方面，同时介绍了免疫标记技术如何被广泛调整以适应多种不同的研究目标。

引言

追踪节肢动物害虫、天敌（寄生性天敌和捕食性天敌）以及传粉昆虫在自然环境中的移动，对于深入理解如何提升生态系统服务功能至关重要。大多数扩散研究的关键在于具备一种可靠的标记目标节肢动物的方法。已有多种材料（例如：油漆、染料、彩色粉尘、标签、稀有元素、蛋白质）被用于标记节肢动物，以评估其种群动态、扩散能力、取食行为及其他生态相互作用1,2。

用于特定扩散研究的标记物是否合适，取决于所进行研究的类型。节肢动物标记方法大致可分为三类：（1）标记-释放-再捕法（MRR），（2）标记-捕获法，（3）自标记-捕获法。在标记-释放-再捕研究中，研究者通常在实验室中对节肢动物进行集中标记，然后在野外某一中心位置将其释放。随后，在不同的空间和时间间隔内，利用多种采集装置对这些节肢动物进行再捕获例如扫网、真空吸虫器、粘虫 trap3,4,5重新捕获的标本随后将被检查特定标记，以区分放归个体与本地个体。在标记-重捕研究中，研究者通常在野外使用喷雾设备直接对标本进行标记。例如，背负式喷雾器，喷杆和喷嘴喷雾器）。用于标记-重捕研究的最佳标记物应价格低廉且易于施用于节肢动物栖息环境。在自标记-重捕研究中，研究者通常将标记物施加于节肢动物诱饵上6,7 或巢穴入口8节肢动物通过摄食标记过的诱饵在体内留下标记，或通过体外附着来标记自身 "刷洗" 当它离开巢穴时紧贴标记处。

如上所述，已有多种类型的标记物被用于标记多种节肢动物物种。然而，极少有标记物适用于上述三种扩散研究类别的全部。蛋白质免疫标记技术的开发是昆虫标记领域的一项重大突破。免疫标记通过在节肢动物体内或体表施加一种蛋白质标签，随后利用针对该蛋白质的特异性酶联免疫吸附测定法（ELISA）进行检测。最早使用的此类蛋白质标记物为兔免疫球蛋白（IgG）和鸡免疫球蛋白（IgG/IgY）9,10。这些标记物已被证明在释放-再捕获（MRR）和自标记-捕获研究中非常有效（见讨论部分）。遗憾的是，IgG/IgY 蛋白质成本较高，因此在标记-捕获研究以及大多数类型的自标记-捕获研究中并不实用。随后，研究人员开发了第二代蛋白质检测 ELISA 方法，用于检测鸡蛋清中的蛋白质（卵白蛋白）、牛奶中的蛋白质（酪蛋白）以及豆奶中的蛋白质（胰蛋白酶抑制剂蛋白）。这些检测方法均具有高度敏感性和特异性，更重要的是，所用蛋白质的成本远低于 IgG/IgY 蛋白质11。这些蛋白质已被证实适用于释放-再捕获、标记-捕获以及自标记-捕获研究（见讨论部分）。

本文中，我们描述并演示如何开展蛋白质标记的实验室滞留研究。此类研究是开展任何类型野外扩散研究之前所需的第一阶段研究工作。具体而言，在开展野外扩散研究之前，研究人员必须明确标记物在目标节肢动物物种上能够保留的时间长度。本文中，我们描述并演示如何对昆虫进行体内和体外标记，以用于标记-重捕（MRR）、标记-捕获以及自标记-捕获等类型的野外研究。随后，我们演示如何通过间接ELISA和夹心ELISA方法检测标记的存在。

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方案

1. 内部标记、保留与检测流程

  1. 内部标记步骤
    1. 从人工饲料饲养的实验室种群或野外采集目标昆虫（n ≈ 100 只），并将其分为两份，分别放入两个洁净的饲养容器中。
    2. 将一份常规的 20 ml 饲料包（未标记的阴性对照处理）放入其中一个容器中；在另一份 20 ml 人工饲料包中加入 1.0 ml 浓度为 1.0 mg/ml 的鸡 IgG/IgY 溶液，充分混匀后放入另一个容器中。
      注意：若目标昆虫无适用的人工饲料，可将标记物添加至其常规食物中（例如，绿豆、蛾卵、水、糖、蜂蜜）。
    3. 让昆虫继续取食 24 小时。
  2. 内部标记保留步骤
    1. 从每个容器中取出饲料包，并为昆虫提供另一种食物来源以维持实验期间的生存（例如，绿豆）。
    2. 每天（或按所需时间间隔）从每种处理组中采集一批昆虫（n = 20），立即于 -20 °C 冷冻保存。
  3. 夹心 ELISA 步骤
    1. 将兔抗鸡 IgY 一抗用 Tris 缓冲盐水（TBS）按 1:500 稀释后，每孔加入 50 µl 至洁净的 ELISA 微孔板中，室温孵育至少 1 小时（注意：微孔板也可在 4 °C 过夜孵育）。
    2. 弃去孔内抗体溶液，每孔加入 300 µl 1.0% 脱脂奶粉溶液封闭 30 分钟。
    3. 在等待前一步孵育的同时，将冷冻昆虫分别放入 1.6 ml 微离心管中，每管加入 1.0 ml TBS。
    4. 用洁净研杵逐个研磨昆虫至完全匀浆，然后将每份样品取 100 µl 加入 ELISA 板的独立孔中，室温孵育 1 小时。
    5. 在每块 ELISA 板的第一列孔中加入 100 µl 阴性对照（仅 TBS）和阳性对照（含于 TBS 中的蛋清）；同时，在每块板的最后一列 8 个孔中加入 100 µl 未标记昆虫的阴性对照样品（图 1）。对照样品室温孵育 1 小时。注意：图 1 提供的模板是我们标准化检测所使用的模板，样品在孔中的排布可根据研究人员的判断进行调整。
    6. 用含吐温的磷酸盐缓冲液（PBS-tween）洗板三次，然后每孔加入 50 µl 用 1% 奶粉溶液按 1:10,000 稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡 IgG/IgY 二抗，室温孵育 1 小时。
    7. 用 PBS-tween 洗板三次，每孔加入 50 µl 四甲基联苯胺（TMB）底物溶液。
    8. 10 分钟后，使用酶标仪在 650 nm 波长下读取各孔吸光值。

ELISA 检测的微孔板布局；样本、对照；数据分析、免疫测定结果评估。
图 1. 显示典型 96 孔 ELISA 微孔板所用标准化孔位设计的示意图。 每块板包含 7 个用于 Tris 缓冲盐水阴性对照（TBS）的孔、1 个用于阳性蛋白对照（Pos Ctrl）的孔、80 个用于重新捕获昆虫（样本 1…80）的独立孔，以及 8 个用于无标记（阴性）昆虫对照（Neg Ctrl 1…8）的孔。请点击此处查看该图的放大版本。

2. 外部标记、保留与检测步骤

  1. 外部标记操作步骤
    1. 从实验室种群或野外采集目标昆虫（n ≈ 100 只），分别放入两个 1.0 L 的塑料容器中，每个容器侧壁打一个直径为 2.5 cm 的孔。
    2. 使用医用雾化器，向第一个容器中的昆虫喷洒 1.0 ml 的 dH2O（阴性对照处理）；向第二个容器中的昆虫喷洒 1.0 ml 含 5.0% 鸡蛋清的溶液。
    3. 将雾化器的软管连接至标准实验室气源，然后将雾化器喷嘴插入容器的 2.5 cm 孔中。缓慢打开气源，直至雾化器产生雾状气溶胶。
    4. 持续喷洒（标记）直至鸡蛋清溶液完全喷出（约 2–5 分钟）。
    5. 移除雾化器，并用软木塞封住塑料容器上的孔。将昆虫置于室温下静置，直至溶液完全干燥。
  2. 外部标记保留操作步骤
    1. 将经不同处理的干燥昆虫分别转移至各自洁净的饲养容器中，以避免进一步接触标记物。
    2. 向洁净容器中添加食物和水，以维持昆虫在整个实验期间的生存。
    3. 每天从每组处理中随机取样一批昆虫（n = 20），立即于 -20 °C 冷冻保存。
  3. 间接 ELISA 操作步骤
    1. 将冷冻昆虫逐个放入 1.6 ml 微离心管中，每管加入 1.0 ml TBS。
    2. 将样品置于转速为 120 rpm 的摇床中浸泡 1 小时。
    3. 设置阴性与阳性对照，具体方法见步骤 1.3.5。
    4. 浸泡完成后，用移液器吸取每份样品 100 µl，加入新 96 孔 ELISA 板上指定的 80 个样品孔中（如图 1所示）。在室温下孵育 1 小时（注：微孔板也可在 4 °C 过夜孵育）。
    5. 用 PBS-吐温溶液洗涤各孔三次，然后每孔加入 300 µl 含 1% 牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液（PBS-BSA）。
    6. 室温孵育 30 分钟后，用 PBS-吐温溶液洗涤两次。
    7. 每孔加入 50 µl 兔抗卵白蛋白一抗，用 PBS-BSA-Silwet（0.05%）按 1:8,000 比例稀释，室温孵育 1 小时。
    8. 每孔洗涤三次后，加入 50 µl 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG 二抗，用 PBS-BSA-Silwet（0.05%）按 1:2,000 比例稀释，室温孵育 1 小时。
    9. 每孔再洗涤三次，然后每孔加入 50 µl TMB 底物溶液。
    10. 10 分钟后，使用酶标仪在 650 nm 波长下读取各孔吸光值。

3. 数据分析

  1. 计算每块ELISA板上8个阴性对照昆虫的平均吸光度值，然后根据同一研究中所有ELISA板的合并阴性对照数据计算标准差12。
  2. 将合并后的标准差乘以6，再加到每块ELISA板所得的平均值上，以此确定ELISA阳性阈值。任何吸光度值等于或高于该阈值的昆虫样本均被判定为含有该蛋白标记物。

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结果

内部标记：

内部标记保留试验的结果如图2A所示。计算得到的ELISA临界阈值为0.054。总体而言（合并四个取样日期的数据），未饲喂蛋白质的昆虫ELISA值 consistently 较低（x̄ = 0.038 ± 0.002，n = 80）。相反，所有饲喂富含蛋白质饲料的昆虫均表现出 consistently 较高的ELISA值（x̄ = 0.475 ± 0.221，n = 80）。

外部标记：

外部标记保留试验的结果如图2B所示。计算得到的...

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讨论

节肢动物蛋白质免疫标记技术首次描述于近二十五年前9自那时起，该方法已被改进，用于研究多种节肢动物的扩散模式，通过体内和体外施用IgG/IgY进行标记。这些蛋白质已被证实可作为迄今测试的多种昆虫物种的稳定标记物。然而，如上所述，使用IgG/IgY的主要局限在于其成本极为昂贵。因此，IgG/IgY仅适用于大量昆虫可在小范围内集中标记的重捕标记回收（MRR）或自标记类研究，或可将标记物掺入饲料或诱饵中的实验。本文提供了一个简单示例，展示如何通过喂食添加了鸡源IgG/IgY的人工饲料，将内部标记物施用于目标昆虫。随后，采用夹心ELISA法检测昆虫体内的IgG/IgY。对于已使用含鸡蛋成分饲料的研究者而言，该体系可能尤为有利，因为该检测方法可自然识别鸡蛋中存在的IgG/IgY。此外，可使用上述医用雾化器将少量IgG/IgY蛋白通过体表方式施用于昆虫图 3A。首先使用雾化器将兔IgG用于大量标记非常微小且脆弱的寄生蜂，以进行MRR类型研究3此后，其他方法也被用于向节肢动物施加IgG/IgY标记，以开展扩散研究。例如，已有研究使用香水喷雾器将IgG/IgY标记应用于其他寄生...

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披露

本出版物中提及的商标名称或商业产品仅为提供具体信息之目的，并不意味着美国农业部的推荐或认可。美国农业部为平等机会提供者和雇主。

致谢

本研究由美国农业部CRIS项目5347-22620-021-00D资助，部分由美国农业部国家食品与农业研究所农业与食品研究计划竞争性拨款2011-67009-30141资助。我们感谢Johanna Nassif提供的技术支持。同时感谢Paul Baker、David Horton、Diego Nieto和Frances Sivakoff提供用于图3的部分图片。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
昆虫饲养用食品储存容器Rubbermaid/Tupperware不同尺寸不同制造商 &和供应商。网眼织物被粘贴在窗口处
小容量雾化器（Micro Mist）Teleflex-Hudson RCI1881可在网上和医疗用品商店购买。其他品牌也可使用。
1.6 ml 带盖微型离心管Continental Lab Products4445.X任何类似类型均可使用。我们更倾向于选择盖子易于开启的品牌。
用于微量离心管的泡沫塑料储存盒（5×20网格）RPI Corp.145746这种设计的优点在于不会使试管过于拥挤。
分配器，重复加样器Eppendorf4982000322类似的操作将有助于加快分液速度。
研钵，塑料一次性组织研磨器，1.5 mlKimble Chase749521-1500可从不同供应商处获取。研杵可清洗并经高压灭菌后重复使用。
BD Falcon ELISA 板，96 孔（平底）BD351172
Ovation 移液器，手动式（20-200） µl)VistaLab1057-0200 或 1070-0200任何类似类型均可使用。该型号符合人体工学设计。
储液器，无菌试剂VistaLab4054-1000类似的东西均可使用。
电子移液器，8通道（50-1,200 µ（Biohit eLine）赛多利斯730391如果你必须选择一种电子模型，这种尺寸最为实用。
电子移液器，8通道（10-300 µl)（Biohit eLine）赛多利斯730361类似的东西均可使用。
多通道多孔板洗板机（8通道，直头）Sigma-AldrichZ369802 类似的手动洗板操作均可采用此方法。
具有吸光度检测功能的微孔板读板仪Molecular DevicesSpectraMax 250类似的方法均可适用。
鸡 IgG/IgY美国生物公司I1903-15R也可从其他来源获取
蛋清杂货店“所有白人”, “Egg Beaters”, 等等。将5 ml与95 ml dH混合25% 溶液的 O
Tris（Trizma Base）Sigma-AldrichT15032.42 g/L 以配制 TBS
氯化钠（NaCl）Sigma-AldrichS988829.22 克/升以配制 TBS 和 8.0 g⁠/⁠PBS 的 L
磷酸氢二钠（Na2HPO4)Sigma-AldrichS08761.14 g/L PBS
磷酸二氢钾（KH₂PO₄）2PO4)Sigma-AldrichP56550.2 g/L PBS
氯化钾（KCl）Sigma-AldrichP95410.2 g/L PBS
Tween 20，EIA 级Sigma-AldrichP1379每升 PBS 在盐溶解后加入 0.5 ml。
含1% BSA的PBSSigma-AldrichP3688将1包溶于1 L dH₂O中2O
兔抗鸡IgY（IgG）（全分子）抗体（1:500）Sigma-AldrichC6409混合 100 µ50 ml TBS 中
脱脂牛奶、奶粉或鲜牛奶（1%）杂货店将10 g与1 L dH₂O混合21% 溶液的 O
抗鸡IgY（IgG）（全分子）-辣根过氧化物酶抗体，兔源（1:10,000）Sigma-AldrichA9046混合 100 µ1 升 1% 脱脂牛奶中的升
兔抗鸡卵白蛋白抗体（1:8,000）Sigma-AldrichC6534稀释 125 µl 在 1 L PBS-BSA 中
辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（1:2,000）Sigma-AldrichA6154将0.5 ml稀释于1 L PBS-BSA中，然后加入1.3 ml Silwet
Vac-In-Stuff（Silwet L-77）硅氧烷-聚醚共聚物Lehle SeedsVIS-01最后加入该成分
TMB 微孔板单组分过氧化物酶底物SurModicsTMBW-1000-01

参考文献

  1. Hagler, J. R., Jackson, C. G. Methods for marking insects: Current techniques and future prospects. Annu. Rev. Entomol. 46, 511-543 (2001).
  2. Lavandero, B. I., Wratten, S. E., Hagler, J. R., Jervis, M. A. The need for effective marking and tracking techniques for monitoring the movements of insect predators and parasitoids. Int. J. Pest Manage. 50 (3), 147-151 (2004).
  3. Hagler, J. R., Jackson, C. G., Henneberry, T. J., Gould, J. Parasitoid mark-release-recapture techniques: II. Development and application of a protein marking technique for Eretmocerus spp., parasitoids of Bemisia argentifolii. Biocontrol Sci. Techn. 12 (6), 661-675 (2002).
  4. Blackmer, J. L., Hagler, J. R., Simmons, G. S., Henneberry, T. J. Dispersal of Homalodisca vitripennis (Homoptera: Cicadellidae) from a point release site in citrus. Environ. Entomol. 35 (6), 1617-1625 (2006).
  5. Swezey, S. L., Nieto, D. J., Hagler, J. R., Pickett, C. H., Bryer, J. A., Machtley, S. A. Dispersion, distribution and movement of Lygus.spp. (Hemiptera: Miridae) in trap-cropped strawberries. Environ. Entomol. 42 (4), 770-778 (2013).
  6. Hagler, J. R., Baker, P. B., Marchosky, R., Machtley, S. A., Bellamy, D. E. Methods to mark termites with protein for mark-release-recapture and mark-capture studies. Insect. Soc. 56 (2), 213-220 (2009).
  7. Baker, P. B., et al. Utilizing rabbit immunoglobulin G protein for mark-capture studies on the desert subterranean termite, Heterotermes aureus (Synder). Insect. Soc. 57 (2), 147-155 (2010).
  8. Hagler, J. R., Mueller, S., Teuber, L. R., Machtley, S. A., Van Deynze, A. Foraging range of honey bees, Apis mellifera, in alfalfa seed production fields. J. Insect Sci. 11 (1), 1-12 (2011).
  9. Hagler, J. R., Cohen, A. C., Bradley-Dunlop, D., Enriquez, F. J. A new approach to mark insects for feeding and dispersal studies. Environ. Entomol. 21 (1), 20-25 (1992).
  10. Hagler, J. R. Field retention of a novel mark-release-recapture method. Environ. Entomol. 26 (5), 1079-1086 (1997).
  11. Jones, V. P., Hagler, J. R., Brunner, J., Baker, C., Wilburn, T. An inexpensive immunomarking technique for studying movement patterns of naturally occurring insect populations. Environ. Entomol. 35 (4), 827-836 (2006).
  12. Sivakoff, F. S., Rosenheim, J. A., Hagler, J. R. Threshold choice and the analysis of protein marking data in long-distance dispersal studies. Methods Ecol. Evol. 2 (1), 77-85 (2011).
  13. Hagler, J. R., Jackson, C. G. An immunomarking technique for labeling minute parasitoids. Environ. Entomol. 27 (4), 1010-1016 (1998).
  14. Janke, J., et al. Serological marking of Pnigalio agraules (Hymenoptera: Eulophidae) for field dispersal studies. J. Pest Sci. 82 (1), 47-53 (2009).
  15. DeGrandi-Hoffman, G., Hagler, J. R. The flow of incoming nectar through a honey bee (Apis mellifera L.) colony as revealed by a protein marker. Insect. Soc. 47 (4), 302-306 (2000).
  16. Peck, S. L., McQuate, G. T. Ecological aspects of Bactrocera latifrons (Diptera: Tephritidae) on Maui, Hawaii: Movement and host preference. Environ. Entomol. 33 (6), 1722-1731 (2004).
  17. Hagler, J. R., Durand, C. M. A new method for immunologically marking prey and its use in predation studies. Entomophaga. 39 (3), 257-265 (1994).
  18. Hagler, J. R. An immunological approach to quantify consumption of protein-tagged Lygus hesperus by the entire cotton predator assemblage. Biol. Control. 58 (3), 337-345 (2011).
  19. Fournier, V., Hagler, J. R., Daane, K., de Leòn, J., Groves, R. Identifying the predator complex of Homalodisca vitripennis (Hemiptera: Cicadellidae): A comparative study of the efficacy of an ELISA and PCR gut content assay. Oecologia. 157 (4), 629-640 (2008).
  20. Hagler, J. R. Development of an immunological technique for identifying multiple predator--prey interactions in a complex arthropod assemblage. Ann. Appl. Biol. 149 (2), 153-165 (2006).
  21. Mansfield, S., Hagler, J. R., Whitehouse, M. A comparative study of the efficiency of a pest-specific and prey-marking ELISA for detection of predation. Entomol. Exp. Appl. 127 (3), 199-206 (2008).
  22. Buczkowski, G., Wang, C., Bennett, G. Immunomarking reveals food flow and feeding relationships in the eastern subterranean termite, Reticulitermes flavipes (Kollar). Environ. Entomol. 36 (1), 173-182 (2007).
  23. Lundgren, J. G., Saska, P., Honĕk, A. Molecular approach to describing a seed-based food web: The post-dispersal granivore community of an invasive plant. Ecol. Evol. 3 (6), 1642-1652 (2013).
  24. Kelly, J. L., Hagler, J. R., Kaplan, I. Semiochemical lures reduce emigration and enhance pest control services in open-field augmentation. Biol. Control. 71, 70-77 (2014).
  25. Zilnik, G., Hagler, J. R. An immunological approach to distinguish arthropod viviphagy from necrophagy. BioControl. 58 (6), 807-814 (2013).
  26. Irvin, N. A., Hagler, J. R., Hoddle, M. S. Laboratory investigation of triple marking the parasitoid, Gonatocerus ashmeadi (Hymenoptera: Mymaridae) with a fluorescent dye and two animal proteins. Entomol. Exp. App. 143 (1), 1-12 (2011).
  27. Hagler, J. R., Mueller, S., Teuber, L. R., Van Deynze, A., Martin, J. A method for distinctly marking honey bees, Apis mellifera, originating from multiple apiary locations. J. Insect Sci. 11 (143), 1-14 (2011).
  28. Peck, G. W., Ferguson, H. J., Jones, V. P., O'Neal, S. D., Walsh, D. B. Use of a highly sensitive immunomarking system to characterize face fly (Diptera: Muscidae) dispersal from cow pats. Environ. Entomol. 43 (1), 116-122 (2014).
  29. Boina, D. R., Meyer, W. L., Onagbola, E. O., Stelinski, L. L. Quantifying dispersal of Diaphorina citri (Hemiptera: Psyllidae) by immunomarking and potential impact of unmanaged groves on commercial citrus management. Environ. Entomol. 38 (4), 1250-1258 (2009).
  30. Lewis-Rosenblum, H., Tawari, X. M. S., Stelinski, L. L. Seasonal movement patterns and long-range dispersal of Asian citrus phyllid in Florida citrus. J. Econ. Entomol. 108 (1), 3-10 (2015).
  31. Krugner, R., Hagler, J. R., Groves, R. L., Sisterson, M. S., Morse, J. G., Johnson, M. W. Plant water stress effects on the net dispersal rate of the insect vector, Homalodisca vitripennis (Germar) (Hemiptera: Cicadellidae), and movement of its egg parasitoid, Gonatocerus ashmeadi Girault (Hymenoptera: Mymaridae). Environ. Entomol. 41 (6), 1279-1289 (2012).
  32. Klick, J., et al. Distribution and activity of Drosophila suzukii in cultivated raspberry and surrounding vegetation. Entomol. Exp. App. , (2015).
  33. Basoalto, K., Miranda, M., Knight, A. L., Fuentes-Contreras, E. Landscape analysis of adult codling moth (Lepidoptera: Tortricidae) distribution and dispersal within typical agroecosystems dominated by apple production in Central Chile. Environ. Entomol. 39 (5), 1399-1408 (2010).
  34. Horton, D. R., Jones, V. P., Unruh, T. R. Use of a new immunomarking method to assess movement by generalist predators between a cover crop and tree canopy in a pear orchard. Amer. Entomol. 55 (1), 49-56 (2009).
  35. Swezey, S. L., Nieto, D. J., Pickett, C. H., Hagler, J. R., Bryer, J. A., Machtley, S. A. Spatial density and movement of the Lygus spp. parasitoid Peristenus relictus (Hymenoptera: Braconidae) in organic strawberries with alfalfa trap crops. Environ. Entomol. 43 (2), 363-369 (2014).
  36. Sivakoff, F. S., Rosenheim, J. A., Hagler, J. R. Relative dispersal ability of a key agricultural pest and its predators in an annual agroecosystem. Biol. Control. 63 (3), 296-303 (2012).
  37. Slosky, L. M., Hoffmann, E. J., Hagler, J. R. A comparative study of the retention and lethality of the first and second generation arthropod protein markers. Entomol. Exp. App. 144 (2), 165-171 (2012).
  38. Hagler, J. R., Machtley, S. A., Blackmer, F. A potential contamination error associated with insect protein mark-capture data. Entomol. Exp. App. 154 (1), 28-34 (2015).
  39. Hagler, J. R., Jones, V. P. A protein-based approach to mark arthropods for mark-capture type research. Entomol. Exp. App. 135 (2), 177-192 (2010).
  40. Hagler, J. R., Naranjo, S. E., Machtley, S. A., Blackmer, F. Development of a standardized protein immunomarking protocol for insect mark-capture dispersal research. J. Appl. Entomol. 138 (10), 772-782 (2014).
  41. Hagler, J. R. Variation in the efficacy of several predator gut content immunoassays. Biol. Control. 12 (1), 25-32 (1998).
  42. Clark, M. F., Adams, A. N. Characteristics of microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses. J. Gen. Virol. 34 (3), 475-483 (1977).
  43. Crowther, J. R. The ELISA guidebook. , Humana Press. Totowa, NJ. (2001).
  44. Stimmann, M. W. Marking insects with rubidium: Imported cabbageworm marked in the field. Environ. Entomol. 3 (2), 327-328 (1974).

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