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方法文章

用于组织工程的含海藻酸盐微粒的热致凝胶化聚(N-异丙基丙烯酰胺)-接枝-硫酸软骨素复合材料的合成

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DOI：

10.3791/53704

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2016年10月26日

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1Department of Chemical Engineering, Rowan University, 2Department of Biological Sciences, Rowan University, 3Department of Biomedical Engineering, Drexel University

本文内容

摘要

一种由含海藻酸盐微粒的聚(N-异丙基丙烯酰胺)-接枝-硫酸软骨素（PNIPAAm-g-CS）组成的可注射组织工程支架被制备出来。其黏附强度、溶胀性能及 体外 本研究分析了生物相容性。此处开发的表征技术可能适用于其他热致凝胶体系。

摘要

可注射生物材料是指可植入体内并在体内由液态转变为固态的材料 原位此类材料具有可微创植入并在不规则缺损处易于形成填充性固体的临床优势。可注射生物材料已被广泛研究作为组织工程的支架。然而，对于某些承重部位（如椎间盘）的修复，支架应具备粘附性能，以最大限度降低运动过程中发生移位的风险，并确保与周围组织的紧密接触，从而实现力的充分传递。本文描述了一种由热敏性聚(N-异丙基丙烯酰胺)-接枝-硫酸软骨素（PNIPAAM-g-CS）与海藻酸盐微粒组成的支架材料的制备与表征方法。PNIPAAm-g-CS共聚物在室温下于水中形成黏稠溶液，将海藻酸盐微粒悬浮其中以增强粘附性。当温度超过其低临界溶解温度（LCST，约30 °C）时，该共聚物在微粒周围形成固态凝胶。我们对标准生物材料表征方法进行了调整，以适应PNIPAAm-g-CS可逆相变的特性。结果表明，加入50或75 mg/ml 海藻酸盐颗粒加入到5% (w/v) PNIPAAm-g-CS溶液中，可使PNIPAAm-g-CS的粘附拉伸强度提高至原来的四倍（p < 0.05）<0.05）。海藻酸盐微粒的引入还显著提高了PNIPAAm-g-CS的溶胀能力（p<0.05），有助于在组织缺损中维持一种填充空间的凝胶。最后，实验结果表明 体外 毒性检测试剂盒、2,3-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基)-2H-四唑-5-羧苯胺（XTT）以及活/死细胞活力检测结果表明，该粘合剂能够在5天内支持包封的人胚胎肾（HEK）293细胞的存活与增殖。

引言

可注射生物材料是指那些能够以液体形式方便地递送至体内并发生固化的材料 原位此类材料已广泛应用于再生医学，用于将包封的细胞递送至病变部位 1-4 并作为细胞的三维临时细胞外基质 5对患者而言，可注射生物材料具有优势，因为其植入手术具有微创性，且固相材料能够填充形状不规则的组织缺损，从而避免了对定制尺寸植入物的需求。

可注射性可通过多种机制实现。已有研究探讨了pH等外部因素作为触发条件，用于形成包载细胞和生物活性分子的凝胶6-8然而，pH 可能并非在所有生理环境中都最适合作为触发条件。实现可注射性的另一种传统替代方法是使用 原位 化学聚合或交联。某研究团队开发了一种由过硫酸铵和水溶性氧化还原体系组成的系统 N,N,N',N'四甲基乙二胺，并将其用于聚乙二醇和聚丙二醇组成的大分子单体的反应 9,10. Zan 等. 11 开发了由戊二醛交联的可注射壳聚糖-聚乙烯醇网络。在这些系统中，必须考虑反应性组分的细胞毒性，特别是涉及细胞包封的应用。此外，放热聚合可能产生足够高的温度，从而损伤周围组织，这已在聚合物骨水泥中有所报道。 12,13.

还有其他一些可注射聚合物体系被开发出来，这类体系以温度为触发因素，表现出从液态到固态的相变。这些体系被称为热致凝胶化系统，是水性聚合物溶液，无需化学刺激、单体或交联剂即可形成凝胶 原位 形成 14相反，通常在生理温度附近发生的相变会诱导形成物理交联的三维网络。泊洛沙姆类聚合物（如Pluronic F127）是研究最为广泛的热致凝胶药物递送聚合物之一。 15-17 以及细胞包封 18,19然而，这些凝胶在生理条件下缺乏稳定性是公认的事实。已有研究证明，使用链延伸剂可提高其稳定性。 20 或化学交联剂 21,22然而，这些试剂的使用可能会限制材料在细胞包封方面的潜力。

聚（N-异丙基丙烯酰胺）是一种合成的热致凝胶聚合物，在组织工程和药物递送领域已受到广泛关注14。聚（N-异丙基丙烯酰胺）（PNIPAAm）的水溶液表现出较低的临界溶解温度（LCST），通常出现在约32 - 34 °C范围内23,24。在LCST以下，水分子能够水合PNIPAAm链；当温度超过相变温度时，该聚合物变得疏水，从而发生显著的相分离25-27，并形成固体凝胶，且无需使用有毒单体或交联剂。然而，由于其疏水性，PNIPAAm均聚物在生理温度下弹性性能较差，且持水能力低28。在本研究中，我们选择将硫酸软骨素共价引入PNIPAAm网络结构中，以赋予材料酶降解性29、抗炎活性30,31以及增强的水分和营养吸收能力32。我们在实验室中通过在甲基丙烯酸酯功能化的硫酸软骨素（CS）存在下聚合单体NIPAAm，制备了含CS的PNIPAAm共聚物，形成接枝共聚物（PNIPAAm-g-CS）。由于该共聚物交联密度较低，PNIPAAm-g-CS在室温下（RT） 于水中形成黏稠溶液，而在生理温度下则因LCST效应转变为弹性凝胶29。当温度降至LCST以下时，由于相变的可逆性，聚合物溶液再次恢复流动性。

我们已证明，PNIPAAm-g-CS 具有作为组织工程支架的潜力，因其具备可调控的机械性能、可降解性，并且与人胚胎肾（HEK）293 细胞具有良好的细胞相容性29。然而，在某些承重区域，如椎间盘，组织工程支架应能够与周围椎间盘组织形成牢固的界面，以消除移位风险33。该界面对于力在植入物与组织之间界面的有效传递也至关重要33。在本研究中，我们将海藻酸盐微粒悬浮于 PNIPAAm-g-CS 的水溶液中，发现凝胶化过程可使微粒定位，从而提供与周围组织的黏附能力34。本文概述了该温敏性、具有黏附性的聚合物的制备步骤。针对生物材料表征、细胞成像以及细胞活力检测的标准技术，已根据该聚合物的温度敏感性和相变可逆性进行了相应调整。本文所述的可注射聚合物在药物递送和组织工程领域具有广泛的应用前景，超出本文所描述的范围。此外，本文介绍的表征方法也可能适用于其他温敏凝胶体系。

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方案

1. 聚（N-异丙基丙烯酰胺）-g-硫酸软骨素的合成

  1. 在合成生物粘附性水凝胶之前，纯化N-异丙基丙烯酰胺（NIPAAm）单体和甲基丙烯酸化硫酸软骨素（CS）。
    1. 称取至少 10 g NIPAAm，将单体溶解于 400 ml 溶剂中 在60 °C下使用正己烷。定期搅拌容器，直至完全溶解。将溶液在-20 °C冰箱中重结晶24小时。
    2. 从容器中取出结晶单体，使用布氏漏斗对正己烷进行减压过滤。将单体置于室温下的真空烘箱中干燥24小时 以去除残留的正己烷。将单体储存于 -20 °C 冰箱中以备后续使用（见步骤 1.2）。
    3. 称取并溶解 2.0 g 硫酸软骨素于 8.0 ml 溶液中 去离子水。将溶液轻轻加热至 60 °C。
    4. 使用约10至40 µl的溶液将pH值调节至10 50%（w/w）NaOH
    5. 加入 0.298 ml 甲基丙烯酸酐（MA）的回流反应持续24小时，同时在60 °C下搅拌。
    6. 加入400 ml 将丙酮溶液倒入容器中，4℃过夜冷却 在 -20 °C 冰箱中。
    7. 24 小时后 已过去，将全部甲基丙烯酰化壳聚糖（mCS）溶液缓慢倒入400 ml 加入冷丙酮，同时用磁力搅拌子搅拌。
    8. 将mCS从丙酮中取出，并将沉淀物放入真空烘箱中。此步骤需迅速操作，以保持mCS的完整性和凝聚状态。在真空条件下使残留丙酮至少蒸发24小时。
  2. 共溶解10 g纯化的NIPAAm和2.209 g mCS于232 ml 去离子水。
  3. 用惰性氮气去除溶液中的氧气。保持剧烈但低流量的气体通入，持续15分钟，以防止溶液溢出。
  4. 继续用氮气吹扫溶液，并加入0.976 ml 四甲基乙二胺（TEMED）
  5. 接下来，通过加入97.6 mg过硫酸铵（APS）启动聚合反应。
  6. 将溶液混合约 20 秒 迅速密封溶液，防止空气进入容器。将溶液置于荧光灯下聚合24小时。
  7. 24 小时后，将反应容器放入 37 °C 的培养箱中，使水凝胶由液态转变为凝胶态。将聚合后的水凝胶浸入 1X 磷酸盐缓冲液（PBS）中孵育总共7天，以使未反应的单体从水凝胶中充分扩散出来。
  8. 使用剪刀将水凝胶切成若干小块，直径不超过5 cm。为防止水凝胶从凝胶状态转变为液态，需在37 °C的PBS溶液中对聚合物进行切碎。将切好的片段转移至50 ml离心管中 锥形管
  9. 用Kimwipes和橡皮筋包裹管口，准备样品进行冻干。将管子在-70 °C下冷冻1至2小时。
  10. 将锥形管置于冷冻干燥机中，以去除水凝胶中的全部水分。操作前，冷冻干燥机需达到约 -40 °C 的温度和 0.04 mbar 的压力。完全干燥至少需要 7 天。
  11. 将冻干的聚合物研磨成细粉，置于4 °C冰箱中保存以备后续使用（参见步骤3.1）。

2. 海藻酸钙交联微粒的合成

  1. 通过将400 mg海藻酸钠溶解于20 ml 去离子水中，配制2% (w/v)的海藻酸钠溶液。将溶液加热至约60 °C以促进溶解。
  2. 通过将400 mg氯化钙加入20 ml 去离子水中，配制2% (w/v)的氯化钙溶液。
  3. 通过混合100 ml 菜籽油、1.0 ml 吐温20和20 ml 2% (w/v)海藻酸钠溶液，制备油包水乳液。使用均质器在15,000 rpm条件下乳化混合物10 min 。此外，分别以200 rpm或2,000 rpm的磁力搅拌子搅拌，以生成较大或较小的微粒。
  4. 使用带有18 G针头的注射器吸取2% (w/v)氯化钙溶液。缓慢将氯化钙逐滴加入乳液中。
  5. 当20 ml 氯化钙溶液全部加入后，使乳液中的微粒交联10 min。
  6. 将微粒样品均匀分装至带盖的50 ml 离心管中，在1,400 × g条件下离心2 min ，以去除表层的菜籽油。
  7. 用异丙醇连续洗涤、涡旋并离心微粒，共进行三次，每次在1,400 g条件下离心2 min ，以去除残留的菜籽油。每次离心后弃去异丙醇上清液，并用新鲜异丙醇重新洗涤。
  8. 去除油相后，用去离子水重复洗涤步骤三次，以去除残留的异丙醇。每次离心后弃去去离子水上清液，并用新鲜去离子水重新洗涤。取约100 mg湿态微粒置于样品瓶中保存。湿态微粒将用于通过光学显微镜测量批次的平均直径。
    1. 使用光学显微镜，将少量湿态微粒分散于去离子水中并置于载玻片上。根据微粒大小选择10X或20X物镜，并调节数值孔径使微粒清晰成像。确保显微镜已针对所用物镜校准，并根据需要调节光源亮度。使用线性测量工具测量50个随机海藻酸钠微粒的最长直径，计算该批次的平均粒径。
  9. 将微粒用Kimwipe纸包裹并用橡皮筋固定，准备进行冷冻干燥。将微粒在-70 °C下冷冻1 hr。
  10. 将微粒置于冷冻干燥机中，干燥至少24 hr。使用研钵和研杵将冻干后的微粒研磨成细粉，储存于4 °C冰箱中以备后续使用（见步骤3.3）。

3. 黏合剂的制备

  1. 使用冻干的聚合物粉末，将50 mg水凝胶粉末溶于1 ml 1×PBS中，配制5% (w/v)的PNIPAAm-g-CS溶液。
  2. 用涡旋振荡器混匀溶液，并于4 °C冰箱中冷藏24小时。
  3. 待黏稠溶液形成后，向水凝胶溶液中加入25 mg或50 mg冻干海藻酸盐微粒，涡旋振荡以形成均匀的复合物。将该复合物储存于4 °C冰箱中以备后续使用（见步骤4.3和4.8）。

4. 生物粘附力学拉伸试验

  1. 在进行拉伸试验之前，从猪耳中提取软骨基质。
    1. 在温热的0.9%（w/v）NaCl溶液中解冻猪耳，这有助于松解组织。
    2. 使用手术刀，通过垂直切开表皮层、皮下组织和软骨，分离并划定一个平坦的矩形区域。避免切割猪耳的弯曲脊部。
    3. 通过在皮下组织中平行切割，将皮肤的表皮层与软骨分离。软骨是一种坚硬的白色组织，位于猪皮肤下方。
    4. 用手术刀的侧面小心刮除附着在软骨上的皮下组织。避免使用刀片切割软骨组织。
    5. 确保在进行拉伸测试时，软骨仅有一侧暴露且表面平整。如有必要，可通过切除软骨底面不平整的表皮来使其平整。
    6. 将软骨组织切成若干块，每块尺寸为1 cm × 1 cm。将软骨组织置于装有0.9% (w/v) NaCl溶液的锥形管中，于-20 °C冰箱中保存。
  2. 配制 2.0 L 的 0.9% (w/v) NaCl 溶液。将生理盐水预热至 37 °C。在检测过程中需维持该溶液的温度。
  3. 解冻冷冻的软骨。将猪软骨和水凝胶样品置于含冰袋的泡沫塑料盒中保存。
  4. 将力测量仪连接到测试支架的臂上。在力测试支架顶部放置一个加热板，并将温度设置为 50 °C。
  5. 用氰基丙烯酸酯胶水和一对镊子将一块 1 cm × 1 cm 的软骨固定在不锈钢块上。将另一块软骨粘附在Delrin圆柱体上，并将该圆柱体连接至测力计。确保两块软骨表面相对，并与水凝胶接触，这一点至关重要。
  6. 将有机玻璃水浴槽放置在加热板上，并将装有软骨基质的不锈钢块放入水浴槽中。
  7. 降低测试台的臂杆，使两个软骨基质相互对齐。抬起臂杆，留出足够的空间以施加水凝胶。
  8. 使用正向置换移液器，分装 200 µl 生物粘附性水凝胶与软骨底层的粘附性
  9. 以1 mm/min的速度降低力测试仪的臂，直至水凝胶接触上方的软骨并施加0.001 N的预加载力。
  10. 将37 °C的生理盐水倒入浴槽中，直至液面达到指定水位。使用热电偶检测溶液温度。
  11. 让水凝胶总共固化5分钟。凝胶完全固化后，以2 mm/min的速度抬起机械臂。当生物粘合剂从软骨基质上脱离或出现明显的力下降（表明失效）时，测试结束。
  12. 收集记录的数据，升起试验台的臂杆。从力传感器上取下聚甲醛圆柱体。将盐水溶液倒回之前的容器中，并重新加热至 37 °C。
  13. 通过从聚合物的浮力中减去聚合物所受的力来计算应力 "空白"Delrin连接件（无软骨或粘合剂）以相同速率升高，并除以结合面积。

5. 含海藻酸盐微粒的聚N-异丙基丙烯酰胺接枝壳聚糖溶胀性能研究

  1. 准备干净的玻璃小瓶，并根据时间点、样品类型和样品编号进行适当标记。粘合剂的制备可参照前文所述方法。每个时间点的每种样品类型需准备总共五个样品（n = 5）。
  2. 预先称量所有玻璃小瓶，并在室温下记录其初始质量。
  3. 使用注射器将约 0.4 ml 制备好的粘合剂样品分别加入五个小瓶中。对所有测试时间点的每种样品类型重复此步骤。
  4. 在室温下称量并记录每个装有粘合剂样品的小瓶质量。
  5. 将摇床培养箱和 1 L 的 1× PBS 溶液预热至 37 °C。
  6. 将所有小瓶整齐放置于试管架上，并将试管架放入培养箱中。使粘合剂在约 5 至 10 分钟内由液态转变为凝胶态。
  7. 向每个小瓶中加入 5.0 ml 的 1× PBS 溶液。注意沿小瓶壁小心加入 PBS 溶液，以防止水凝胶圆片破裂。
  8. 盖紧每个小瓶以防止 PBS 溶液蒸发，并将培养箱内部温度维持在 37 °C。每组水凝胶圆片需在 PBS 中浸泡指定的时间长度。
  9. 当达到 7 天时间点时，打开该组小瓶的瓶盖，并移除每个小瓶中的 PBS 溶液。再次在室温下称量每个装有粘合剂样品的小瓶。

6. 使用活/死染色法进行细胞活性定性分析

  1. 在使用PNIPAAm-g-CS进行活/死细胞检测之前，将人胚胎肾293细胞（HEK-293）培养至80%汇合度。
    1. 将冻存的HEK-293细胞悬液置于37 °C水浴中快速解冻，然后将细胞在15 ml 锥形管中于4 °C以400 x g离心5 min 。
    2. 配制第一代细胞培养基：在高糖（4.5 g/L）Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中加入热灭活的胎牛血清（FBS），使FBS终浓度为20%，并加入100倍浓度的青霉素-链霉素溶液（pen-strep），使青霉素终浓度为100 I.U/ml ，链霉素终浓度为100 μg/ml 。后续传代培养时，改用含10% FBS和1倍浓度pen-strep的DMEM。
    3. 用10 ml 培养基重悬细胞沉淀，并将悬液转移至一个直径100 mm的培养皿中。通过轻轻前后、左右倾斜培养皿数次，使细胞均匀分布。
    4. 将细胞置于37 °C、5% CO2的加湿培养箱中培养。必要时，每两天更换一次培养基。
    5. 当细胞达到80%汇合度时，将培养物分传至多个培养皿中。从培养皿中移除培养基。
    6. 向培养皿中加入1 ml 0.5%胰蛋白酶。将培养皿于37 °C孵育10 min。通过轻轻旋转培养皿，观察细胞是否从表面脱落。
    7. 按1:10比例分传时，向经胰蛋白酶消化的细胞中加入9 ml 常规生长培养基（含10% FBS的DMEM），并通过倾斜培养皿轻轻混匀。
    8. 将1 ml 稀释后的细胞悬液分装至每个新培养皿中，再加入9 ml 生长培养基。通过倾斜培养皿轻轻混匀。
    9. 将细胞置于37 °C、5% CO2的加湿培养箱中培养。必要时，每两天更换一次培养基，直至细胞达到80%汇合度。
  2. 从两个培养至80%汇合度的培养皿中移除培养基。
  3. 向每个培养皿中加入1 ml 0.5%胰蛋白酶。将培养皿于37 °C孵育10 min。通过轻轻旋转培养皿，观察细胞是否从表面脱落。
  4. 用3 ml 生长培养基洗涤培养皿中的HEK-293细胞两次，并将两次洗涤液合并至同一个15 ml 锥形管中。
  5. 将15 ml 锥形管于4 °C以400 x g离心10 min 。
  6. 弃去上清液，用移液器反复吹打，以3 ml 培养基重悬细胞沉淀。
  7. 取10 µl 细胞悬液加入血细胞计数板，进行细胞计数以确定细胞密度。若初始细胞浓度过高，则增加悬液中培养基体积；反之若浓度过低，则减少体积，以维持目标浓度为1 × 106 cells/ml。将HEK-293细胞以400 x g离心，并根据校正后的体积用相应量的培养基重悬细胞沉淀。
  8. 轻轻涡旋细胞悬液，并将细胞混合物均匀分装至四个独立的15 ml 锥形管中，用于以下测试条件：阳性对照单层细胞、在PNIPAAm-g-CS中使用70%（v/v）甲醇处理的阴性死亡对照、包封于PNIPAAm-g-CS中的HEK-293细胞，以及包封于含海藻酸盐微粒的PNIPAAm-g-CS中的HEK-293细胞。
  9. 通过移液将多份300 µl 细胞混合物加入24孔板中，制备阳性对照单层细胞，生成4–6个重复样本。
  10. 移除与死亡对照、PNIPAAm-g-CS及含海藻酸盐微粒的PNIPAAm-g-CS相关的锥形管中的培养基。
    1. 将锥形管以400 x g离心5分钟，并弃去上清液。
    2. 用与弃去培养基相同体积的PNIPAAm-g-CS重悬细胞，以维持相同的细胞浓度。使用移液管反复吹打聚合物-细胞混合物，直至均匀。
      1. 若需加入海藻酸盐微粒，将PNIPAAm-g-CS-细胞悬液（按6.10.2所述方法获得）转移至35 mm培养皿中，并将微粒加入混合物中。使用移液管反复吹打细胞混合物，直至均匀。
    3. 使用移液管，将多份300 µl 聚合物-细胞混合物分别加入死亡对照、PNIPAAm-g-CS及含海藻酸盐微粒的PNIPAAm-g-CS各孔中，生成4–6个重复样本。
  11. 将培养板于37 °C孵育10至15 min ，使PNIPAAm-g-CS由液态转变为凝胶态（聚合物形成不透明的白色圆盘）。
  12. 在生物安全柜内放置载玻片加热器，并将温度设定为37 °C。利用加热器维持培养板温度，并向每孔加入600 µl 预热的培养基。为进一步防止聚合物转变为液态，可在培养皿上方放置带有荧光灯泡的灯具，以加热其上方空气。
  13. 将细胞在37 °C、5% CO2条件下培养5天。
  14. 五天后，使用乙锭同型二聚体（EthD-1）和钙黄绿素AM配制活/死染料混合液。两种试剂均对光敏感，需在使用当天配制。
    1. 将试剂盒中的钙黄绿素AM和EthD-1在室温下解冻。
    2. 向锥形管中加入5 ml 无菌1×PBS，并用铝箔包裹。
    3. 向锥形管中加入6.67 µl 2 mM EthD-1。充分涡旋混合溶液。
    4. 随后，向锥形管中加入2.5 µl 4 mM钙黄绿素AM。充分涡旋混合溶液。
  15. 移除单层细胞（阳性对照）、PNIPAAm-g-CS及含海藻酸盐微粒的PNIPAAm-g-CS各孔中的培养基。用PBS彻底但轻柔地洗涤所有孔，并移除PBS。
  16. 让含海藻酸盐微粒的水凝胶圆盘在室温下液化，并向每孔加入2 ml 50 mM柠檬酸钠溶液。
  17. 移除死亡细胞孔（阴性对照）中的培养基。让水凝胶圆盘在室温下液化，并向每孔加入300 µl 70%（v/v）甲醇。
  18. 将培养板于37 °C孵育45 min 。
  19. 移除各孔中的柠檬酸钠和甲醇溶液，并将每孔中的水凝胶悬液分别移入独立的微量离心管中。以2,000 x g离心10 min ，以分离细胞与水凝胶悬液。
  20. 小心移除上清液，通过移液将溶液从锥形管中吸出，保留细胞沉淀。用300 µl PBS重悬沉淀，并转移回原始培养板的对应孔中。
  21. 向每孔加入300 µl 活/死染料混合液。用铝箔包裹培养板，并在室温下于摇床上孵育45 min 。
  22. 使用倒置荧光显微镜配合10倍物镜对所有样本进行成像。活细胞和死细胞将分别呈现绿色和红色荧光。

7. 使用XTT法进行细胞活力定量分析

  1. 将 HEK-293 细胞培养至 80% 汇合度。从两个培养皿中移除生长培养基。
  2. 向每个培养皿中加入 1 ml 0.5% 胰蛋白酶。将培养皿置于 37 °C 孵育 10 分钟。通过轻轻摇晃培养皿，检查细胞是否已从表面脱落。
  3. 用 3 ml 培养基将培养皿上的 HEK-293 细胞洗涤两次，并将两次洗涤后的细胞悬液合并至同一个 15 ml 离心管中。
  4. 将 15 ml 离心管在 4 °C 条件下以 400 × g 离心 10 分钟 。
  5. 弃去上清液，用移液器反复吹打，将细胞沉淀重悬于 3 ml 培养基中。
  6. 取 10 µl 细胞悬液加入血细胞计数板，进行细胞计数以确定细胞密度。如前所述，维持目标浓度为 1 × 106 个细胞/ml。将 HEK-293 细胞以 400 × g 离心，并根据所需浓度用适量培养基重悬细胞沉淀。
  7. 轻柔涡旋细胞悬液，并将细胞混合物均匀分配至四个独立的 15 ml 离心管中，用于以下测试条件：阳性对照单层细胞、在 PNIPAAm-g-CS 中使用 70% (v/v) 甲醇处理的阴性失活对照、包埋于 PNIPAAm-g-CS 中的 HEK-293 细胞，以及包埋于含海藻酸盐微粒的 PNIPAAm-g-CS 中的 HEK-293 细胞。
  8. 通过移液将 300 µl 细胞混合物加入 24 孔板中，制备阳性对照单层细胞，每组设置 4–6 个重复样本。
  9. 移除与失活对照、PNIPAAm-g-CS 及含海藻酸盐微粒的 PNIPAAm-g-CS 组对应的离心管中的培养基。
    1. 将离心管以 400 × g 离心 5 分钟 ，弃去上清液。
    2. 用与弃去培养基等体积的 PNIPAAm-g-CS 重悬细胞，保持相同的细胞浓度。使用移液管反复吹打，直至细胞悬液均匀。
      1. 若需加入海藻酸盐微粒，则将 PNIPAAm-g-CS-细胞悬液转移至 35 mm 培养皿中，并将微粒加入混合物中。使用移液管反复吹打，直至混合均匀。
    3. 使用移液管将 300 µl 聚合物-细胞混合物分别加入失活对照、PNIPAAm-g-CS 及含海藻酸盐微粒的 PNIPAAm-g-CS 各孔中，每组设置 4–6 个重复样本。
  10. 当所有含细胞的样本均加入 24 孔板后，在相邻孔中分别加入多份不含细胞的 300 µl PNIPAAm-g-CS 和含海藻酸盐微粒的 PNIPAAm-g-CS，每组设置 4–6 个重复样本。
  11. 将 24 孔板置于 37 °C 孵育 10 至 15 分钟 ，使 PNIPAAm-g-CS 由液态转变为凝胶态（聚合物形成不透明的白色圆盘）。
  12. 在生物安全柜内放置载片加热器，并将温度设定为 37 °C。利用加热器维持孔板温度，向每孔中加入 600 µl 预热的无色 DMEM 培养基。为防止聚合物重新转变为液态，可在培养皿上方放置带有荧光灯泡的灯具，以加热其上方空气。
  13. 将细胞在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 5 天。
  14. 五天后，按照生产商说明配制 2,3-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基)-2H-四氮唑-5-羧苯胺（XTT）试剂。XTT 试剂对光敏感，需在使用当天配制。
    1. 从冰箱中取出装有 XTT 粉末的棕色瓶。使用无菌注射器和针头，将 5 ml 无色 DMEM（不含酚红）通过橡胶隔膜注入棕色瓶中。
    2. 将试剂置于 56 °C 水浴中加热 10 分钟 ，或直至完全溶解。
    3. 在用铝箔包裹的 15 ml 离心管中，将 XTT 试剂进一步稀释至 20% (v/v)。将多余的 XTT 试剂分装至微量离心管中，置于 -20 °C 冰箱中长期保存。
  15. 移除失活细胞孔（阴性对照）中的培养基，并向每孔加入 300 µl 70% (v/v) 甲醇。在 37 °C 孵育 45 分钟 后，移除甲醇。
  16. 移除单层细胞（阳性对照）、PNIPAAm-g-CS 及含海藻酸盐微粒的 PNIPAAm-g-CS 组其余孔中的培养基。用 PBS 轻柔且彻底地洗涤所有孔，随后弃去 PBS。
  17. 向每孔中加入 300 µl 20% XTT 试剂。用铝箔包裹 24 孔板，在室温下置于摇床上孵育 24 小时 。
  18. 24 小时后，向所有孔中加入 200 µl 50 mM 柠檬酸钠，并在摇床上继续孵育 1 小时。
  19. 将所有聚合物悬液转移至微量离心管中，在室温下以 2,000 × g 离心 10 分钟 。 
  20. 从每支微量离心管中转移 200 µl 上清液至 96 孔板中。使用酶标仪，在 450 nm 处测定特异性吸光度，在 690 nm 处测定非特异性吸光度。

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结果

一种热响应性接枝共聚物被成功合成，并对其生物粘附强度、溶胀性能进行了表征， 体外 细胞相容性。我们选择研究海藻酸盐，因其具有明确的黏膜黏附特性。海藻酸盐微粒的平均直径为59.7 ± 14.9 µm，与浓度为 25、50 和 75 mg/ml 的 5% (w/v) PNIPAAm-g-CS 混合。这些浓度分别对应于水溶液中 PNIPAAm-g-CS 干重的一半、相等及两倍。高于 75 mg/ml 的微粒浓度表现出过高的黏度，因此未进行研究。将含不同浓度海藻酸盐微粒的 5% (w/v) PNIPAAm-g-CS 的最大拉伸黏附强度与单独的水凝胶进行比较。在 5% (w/v) PNIPAAm-g-CS 中加入 50 或 75 mg/ml 海藻酸盐微粒，可使拉伸强度提高四倍（p < 0.05）。<0.05），如图所示 图1微粒浓度为25 mg/ml时，与5%（w/v）PNIPAAm-g-CS相比，拉伸强度未显示出显著增加（p < 0.05）。>0.05）。当海藻酸盐微粒浓度从50 mg/ml增加至75 mg/ml时，...

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讨论

在合成水凝胶-微粒复合材料并评估其黏附强度、溶胀能力及细胞生物相容性时，存在若干关键步骤。PNIPAAm-g-CS 的自由基聚合反应需要成功实现硫酸软骨素的甲基丙烯酰化、单体组分的完全溶解以及无氧的反应条件。反应体系中 NIPAAm 单体与甲基丙烯酰化硫酸软骨素的比例是根据我们先前的研究结果选定的，该比例可生成力学性能与天然椎间盘组织相似的共聚物29。增加水凝胶中硫酸软骨素的含量将减少凝胶过程中的水分流失，从而降低凝胶的压缩刚度。已有的研究也表明，所选用的甲基丙烯酰化程度可在水溶液中溶解后，赋予水凝胶良好的操作性能，使其能够通过18 G针头注射29。提高CS上甲基丙烯酸酯取代程度会增加聚合物网络的交联密度，导致低临界溶解温度（LCST）以下溶液黏度升高，并降低凝胶的溶胀能力。其他研究者还探索了不同的PNIPAAm水凝胶合成方法，例如原子转移自由基聚合（ATRP）35或反向加成-断裂链转移（RAFT）36。通过ATRP聚合可制备出分子量分布窄且多分散性可控的水凝胶，通过调节单体与引发剂的比例实现分子量的精确调控。利用RAFT聚合可在聚合物主链上以梳状方...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者谨此衷心感谢 Jennifer Kadlowec 博士在开发胶粘剂拉伸测试方案过程中提供的帮助。

本研究由美国国立卫生研究院下属的关节炎与肌肉骨骼及皮肤病研究所和生物医学成像与生物工程研究所资助，资助编号为1R15 AR 063920-01。本内容仅由作者负责，不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
N-异丙基丙烯酰胺，99%，纯品，稳定化处理Acros Organics2210-25-5冷藏，并用己烷去除稳定剂
硫酸软骨素A钠盐（来自牛气管）Sigma-Aldrich39455-18-0冷藏
己烷Fisher ScientificH302-4存放于易燃品柜中
50% (w/w) 氢氧化钠Fisher ScientificSS254-1具有腐蚀性
甲基丙烯酸酐Sigma-Aldrich276685产生强烈烟雾；需在通风橱中使用
丙酮Fisher ScientificA18-4使用前在冰箱中预冷
氮气Praxair7727-37-9产品编号：NI 4.8，T型钢瓶，99.998%纯度氮气（氩气可作为替代惰性气体）
四甲基乙二胺，99%超纯Acros Organics110-18-9
过硫酸铵Sigma AldrichA3678易吸湿，遇水易降解
磷酸盐缓冲液片剂Fisher ScientificBP2944保持干燥
海藻酸钠Acros Organics177775000加热有助于溶解
二水合氯化钙Fisher ScientificC79
芥花油本地商店从本地商店购买
吐温20Sigma-Aldrich93773
70% (v/v) 异丙醇Fisher ScientificA416-4
猪耳Haine's Pork Shop从本地肉铺获取
氯化钠Fisher ScientificS271-3
人胚肾293细胞ATCCATCC CRL-1573长期保存需置于液氮中
DMEM：1×，高糖，无丙酮酸Life Technologies11965126冷藏
胎牛血清Life Technologies10082-147冷藏
青霉素-链霉素溶液：10,000 U/mlLife Technologies15140-122冷藏
胰蛋白酶-EDTA：0.5%，10×Life Technologies15400-054冷藏
甲醇VWRAAA44571-K7
活/死细胞活力检测试剂盒Life TechnologiesL3224避光，冷冻保存
XTT细胞活力检测试剂盒Sigma AldrichTOX2-1KT避光，冷冻保存
无色DMEM：1×，高糖，无酚红Life Technologies21063-029冷藏
杜氏磷酸盐缓冲液：1×Life Technologies14190136冷藏
柠檬酸钠EMDSX0445-1
正排量移液器BrandTech Scientific, INC2702904可分配100 - 500 µl，配有可拆卸吸头
3号不锈钢手术刀柄Sigma AldrichS2896
Miltex无菌手术刀片Fisher Scientific12-460-44010号规格
Power gem匀浆器Fisher Scientific08-451-660型号 # 125
瓷制研钵和研杵Sigma AldrichZ247464容量50 ml
FreeZone 1 L台式冷冻干燥系统Labconco7740020使用前先冷冻样品
油封旋片式真空泵EdwardsA65301906型号 # RV5
恒温振荡摇床VWR12620-946型号 # 980153
台式制冷离心机Forma Scientific, INC型号 # 5682
加热烘箱VWR型号 # 1235PC
2 N测力计ShimpoFGV-0.5XY型号 # FGV-0.5XY
E型力测试支架ShimpoFGS-200PV型号 # FGS-200PV
组织培养用摆动吊篮离心机Beckman Coulter366830型号 #6S-6KR
组织培养用微量离心机Eppendorf型号 #5415C
血细胞计数板套装Hausser Scientific3720需更换盖玻片
载玻片加热器Lab ScientificXH-2022型号 # XH-2002
便携式加热灯Underwriters Laboratories有助于维持聚合物温度在37 °C
倒置荧光显微镜Zeiss型号 Axiovert 25 CFL
恒温水浴锅VWR型号 # 1235PC
摇摆平台VWR系列 100
Multiskan FC 微孔板读数仪Thermo Scientific型号 357
细胞培养孵育箱VWR型号 # 2350T
Purifier II级生物安全柜LabconcoDelta系列

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