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方法文章

高分辨率定量分析结晶纤维素的积累 拟南芥 监测组织特异性细胞壁修饰的根部方法

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DOI：

10.3791/53707

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2016年5月10日

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1Faculty of Biology, Technion-Israel Institute of Technology, 2Smith Institute of Plant Sciences and Genetics in Agriculture, Hebrew University of Jerusalem

本文内容

摘要

结晶纤维素是植物细胞壁的重要组成成分。然而，在细胞分辨率下对其进行定量在技术上具有挑战性。本文中，我们报道了利用偏振光技术结合根部横切片，以获取具有时空分辨率的细胞壁组分信息。

摘要

植物细胞由细胞壁包围，细胞壁的组分决定了细胞的最终大小和形状。细胞壁由复杂的基质构成，其中包含多糖，如形成结晶结构的纤维素微纤丝以及无定形排列的纤维素链。纤维素纤维的取向及其浓度决定了细胞的力学特性。目前有多种方法用于测定结晶纤维素的含量，每种方法均有其优势与局限性。某些方法能够区分总纤维素中结晶区域所占的比例，但仅限于对整个器官进行分析，缺乏时空分辨率信息。另一些依赖活体成像的方法则受限于使用不够精确的染料。本文报道了一种基于偏振光的高灵敏度系统，可特异性定量拟南芥（Arabidopsis thaliana）根横切面中相对光延迟值，从而反映结晶纤维素的积累情况。该方法保持了细胞分辨率和解剖学信息，能够实现对生长中根部不同组织之间的直接比较。这一技术开辟了新的分析维度，有助于揭示细胞壁组分、细胞行为与整个器官生长之间的关联。

引言

植物细胞壁是一种动态结构。生长中的细胞被初生细胞壁所包围，其结构组织允许细胞扩展。停止生长的细胞则沉积出更为坚硬的次生壁，以增强植物的机械支撑能力。这两种细胞壁均由嵌入不同结构多糖基质中的纤维素微纤丝构成 （例如，半纤维素和果胶）在不同发育阶段和组织中存在差异1,2纤维素被合成为紧密排列的（1,4）-β-D-葡聚糖链，进而形成具有结晶结构的微纤丝。无定形纤维素是指葡聚糖链有序性较低的区域。结晶区与无定形区的比例是影响细胞壁机械性能的一个参数，分别赋予细胞壁机械强度和黏弹性特征。3已开发出多种方法用于检测和定量纤维素的两种排列形式，其中包括X射线衍射和交叉极化/魔角旋转固态核磁共振4X射线衍射可用于测定样品中结晶态与非晶态纤维素区域的比例5一种替代方法是将细胞壁成分分离为酸不溶性和酸可溶性物质，以分别区分结晶纤维素和无定形纤维素或其他聚合物。该方法中，通过掺入标记的葡萄糖（[14C]葡萄糖）用于定量纤维素6,7这些方法最多仅适用于对整个器官进行分析，且需要大量植物材料，因此对细胞壁结构的组织特异性差异敏感性不足。通过结合荧光染料的活体成像研究，可在细胞分辨率水平实现对纤维素微纤丝的可视化观察。8,9，可识别纤维素微纤丝方向的变化。然而，这些染料不能用于定量分析，对结晶纤维素不具特异性，且可能干扰细胞壁的正常结构8偏光显微镜成像技术依赖于结晶纤维素分裂光束并延迟部分光线的特性10光延迟效应在微纤丝的排列方向与光传播方向垂直时最强。对于取向相似的微纤丝，结晶度越高，光延迟越大。11因此，偏光显微镜被用于研究纤维素微纤丝的相对含量及其取向。

根部表现出线性生长，其细胞起源于根尖的干细胞微环境，在经历一系列细胞分裂后迅速伸长12。构成根部的细胞以单向（各向异性）方式伸长，这一过程由小分子信号激素调控，这些激素影响细胞壁的性质13。激素在时间和空间上的差异性响应，为确保器官平衡生长提供了机制基础14。因此，对细胞壁结构进行高分辨率分析，可提供重要的信息，有助于深入理解特定细胞类型响应与整个器官生长之间的关联。本文报道了利用偏光显微镜（polscope）研究在高质量解剖切片中观察到的拟南芥（Arabidopsis）根部组织特异性结晶纤维素积累的方法。该方法最近揭示了在激素活性发生空间扰动时，不同细胞类型中结晶纤维素的特异性积累现象15。

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方案

1. 植物生长

  1. 对种子进行表面灭菌。
    1. 采用湿法或干法对种子（最多30 mg）进行灭菌。例如，采用干法灭菌时，将1 ml 37%浓盐酸加入50 ml 次氯酸钠溶液中，置于密闭干燥器内的玻璃烧杯中，处理至少4小时至过夜。该步骤需在通风橱中进行。
  2. 将无菌种子均匀铺在含有0.8%植物琼脂的0.5×Murashige & Skoog（MS）培养基平板上。用Parafilm封口膜或透气胶带封住平板，并用铝箔包裹。
  3. 将平板置于4 °C条件下保存1至4天，以促进种子萌发整齐一致。
  4. 将平板转移至适合拟南芥（Arabidopsis）幼苗生长的培养室中。将平板垂直放置，以使根在琼脂培养基表面生长，并防止根插入培养基内部。
  5. 在种子萌发后第7天（DAG）将幼苗转移至固定液中。

2. 固定

  1. 通过将等体积的1%硼砂（缓冲剂）、1%亚甲蓝和1%伊红（组织学染料）溶于双蒸水中，配制50 ml Richardson溶液。使用前经0.22 μm PVDF针筒过滤器过滤。
  2. 配制50 ml固定液：将1.25%戊二醛溶于0.05 M二甲胂酸钠（缓冲剂）中。
    注意：这些试剂具有毒性，必须在通风橱中操作。
  3. 向固定液（见2.2）中加入100 µl Richardson溶液（见2.1），得到最终固定液。
  4. 用相应样本名称标记6孔板的每个孔。
  5. 将2–3 ml最终固定液（见2.3）加入各孔中，确保转移幼苗后液体能完全覆盖样本。
  6. 用镊子小心将最多10株幼苗转移至每个孔中。用Parafilm密封板孔，在4 °C避光条件下保存至少一晚，最长可保存一周。

3. 脱水

  1. 对幼苗进行脱水处理。将幼苗转移至新的6孔板的不同孔中，依次经过浓度递增的乙醇溶液，具体如下：10% 乙醇处理15分钟；30% 乙醇处理15分钟；50% 乙醇处理15分钟；70% 乙醇处理15分钟；85% 乙醇处理15分钟；95% 乙醇处理15分钟；最后在4 °C条件下用95% 乙醇浸泡过夜，至少持续过夜。操作时应使用塑料镊子轻轻夹住幼苗的子叶进行处理。

4. 渗入 

  1. 配制浸润液。取组织树脂试剂盒中的一袋固化剂，与50 ml基础树脂液体试剂在小玻璃瓶中混合，用磁力搅拌器搅拌20分钟。浸润液可在4 °C下保存数周。
  2. 用记号笔在新的6孔板的每个孔上标记相应的样品名称，并加入2–3 ml浸润液。
  3. 用镊子将幼苗从95%乙醇溶液转移至浸润液中，确保幼苗完全被液体覆盖。
  4. 在4 °C下保存至少4天，以确保浸润液充分渗透至植物组织内部。

5. 区块制备

  1. 在包埋模具的每个孔内放置小标签，并用铅笔标记样品名称。
  2. 通过将1 ml固化剂加入15 ml浸润介质中来制备包埋介质（参见4.1）。请勿尝试制备小于15 ml的体积，以避免聚合问题。
  3. 向模具的每个孔中加入200 µl包埋介质，填充至孔的一半，并用比模具每边大1 mm、按模具形状裁剪的封口膜覆盖。室温孵育至少2小时，以确保充分聚合。孵育时间不得超过5小时。
  4. 另配一批包埋介质（参见5.2），置于冰上保存，以防止在将根尖排列于模具中时发生聚合。
  5. 在解剖镜下用手术刀切割每个根尖，并小心地将其垂直放置（用于横切面）或水平放置（用于纵切面），位置距离模具边缘约2–3 mm。用阻断溶液完全填充模具，并用封口膜覆盖。注意：阻断溶液聚合后会略微收缩。
  6. 室温下至少静置2小时。
  7. 为干燥包埋块，将其放入装有干燥硅胶的盒子中，室温下静置过夜，至少放置一晚。

6. 切片

  1. 使用刀具制作仪从玻璃棒制备玻璃刀。用这些玻璃刀进行组织切片。先用金刚石刻划工具将玻璃棒切割成方形，再沿对角线切割该方形，得到两把刀片。
  2. 使用切片机将包埋块切成 2 - 3 µm 宽的切片。将切片置于载玻片上的蒸馏水滴中，然后将载玻片放在设定为低温（50 - 60 °C）的加热块上，直至水分蒸发。

7. 偏光显微镜用玻片制备

  1. 将Richardson溶液（见2.1）稀释至原浓度的0.2%，取1 ml覆盖切片。置于加热块上加热5秒，然后用蒸馏水洗涤。
  2. 将载玻片放在加热板上烘干。在解剖显微镜下观察，并用记号笔在载玻片背面标记出目标切片的位置，以便后续在显微镜下快速识别。
  3. 加入100 µl封片介质，盖上盖玻片。

8. 图像采集

  1. 将含有根部切片的盖玻片置于配备Polscope系统、可用于获取延迟信息以及带有偏振器/干涉光滤光片的光学显微镜下图1 A-D).
  2. 选择能够清晰观察整个样本的放大倍数例如，本研究中为40倍）并将显微镜聚焦于一个包含包埋块切片但无根切片的空白区域。尽量选择无瑕疵的干净区域，用于设定背景。
  3. 设置成像系统和软件参数：将范围设置为 17 nm。应用 "自动曝光" 并从空白视野中获取背景图像（参见8.2）。每次实验使用一张背景图像。

9. 纤维素微纤丝取向的偏振光显微分析

  1. 纵向切片分析
    1. 将含有纵切面的载玻片置于显微镜下，获取其延迟图像。调整显微镜焦距至感兴趣的根部切面区域。输入新的文件名。
    2. 通过 abrio 成像系统获取一幅 abrio 图像（包含延迟信息的图像） "Live Abrio" 窗口。务必捕获包含细胞壁的区域，细胞壁可通过沿细胞周边分布的染色纤维素进行识别，如图所示。 图 2C.
  2. 图像分析。
    1. 双击图像堆栈中的相关图像。选择 "取向伪彩色" 在 "显示设置" 表。
    2. 为了估算纤维素微纤丝角度，将细胞壁的相应颜色与色轮中的颜色进行比对。
      注意：色轮中的 图2C 反映了光的慢轴沿微纤丝方向排列，指示了微纤丝长轴的方向。纤维素微纤丝的角度由颜色所示角度与细胞长轴之间的夹角决定。例如，插图中的伸长细胞呈青色，与细胞长轴的夹角约为90°。
    3. 为了量化细胞壁中微纤丝的平均角度，使用 "延迟与方位角标记" 从软件的工具栏中选择工具。选择工具后，在所获得的图像中点击并选中目标区域。
      注意：这将使角度（方位角）以度为单位显示图2C).
    4. 在另一种开源偏振光图像分析软件中，午餐 "Pol-Analyzer" 从插件菜单中选择插件。在新打开的窗口中，选择 "双折射" 点击标签并打开，然后保存背景文件和图像文件。
    5. 在图像窗口中，选择 "规格" 并调整“ROI像素大小”（本研究使用5像素）。在 "规格" 窗口，选择 "在结果表中显示数值".
    6. 使用多边形工具在图像窗口中标记感兴趣区域。选择 "取向线" 以获得纤维素微纤丝的取向。
      注意：这将使角度（方位角）以度为单位显示。
      注意：通过两种方法之一计算出的平均角度需根据切片上根部区段的定位进行归一化处理。为校正整个根部区段沿切片方向相对于水平位置的偏差，应量化细胞长轴两侧细胞壁的平均微纤丝角度（即垂直于切片方向，并沿根的生长轴方向）。 图2C）。当根部切片在载玻片上准确定位时，此角度为180°。计算微纤丝角时，用180°减去两侧细胞壁测得的平均微纤丝角，将所得差值加至平贴于载玻片上的细胞壁测得的平均微纤丝角上。

10. 结晶纤维素积累的Polscope分析

  1. 使用横切（横截）面。请注意，只有当细胞的纤维素微纤丝以相似角度排列时（如步骤9中所确定），才能在细胞之间比较结晶纤维素的积累量。
  2. 在图像堆栈中双击相关图像。在“"显示设置"”选项卡中选择“"伪彩色"”。
  3. 测量延迟值。放大图像，选择“"区域"”并标记所有感兴趣区域。切换到“"测量"”选项卡，将所有数值“"复制到剪贴板"”。
    1. 将数据导入 Excel 并提取所需信息（延迟值的平均区域）。对数据进行归一化处理。
      注：为校正切片间厚度差异，应将数值相对于切片中某一特定细胞壁边缘进行表达。归一化方法为：将目标细胞壁对应的平均延迟值除以同一图像中另一细胞壁的平均延迟值。例如，在本研究中，外层表皮细胞壁以内部皮层细胞壁为参照进行归一化。
  4. 每条根至少重复测量3个切片，每个样品至少检测3条根。

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结果

我们利用细胞类型特异性反应研究油菜素类固醇（BRs）的影响， 拟南芥 根作为模式器官15-17. 当靶向BR受体BRI1时，在……背景下 bri1 突变体，至一类称为非毛细胞的表皮细胞子集（图2A、B），它会抑制邻近细胞的单向细胞扩展，并影响整个根部的生长15通过Polscope分析揭示了这种抑制作用的机制。对野生型植株以及仅在非毛细胞中表达BRI1的株系所获得的根部纵切面显示，纤维素微纤丝的排列方向相似（图 2C,D，并如9.2.3节所述，通过获取这些区域的横切面，实现对分生区细胞与伸长区细胞中结晶纤维素相对积累量的比较图 2E,F）。该分析显示，非毛细胞中BRI1的表达与结晶纤维素的局部积累之间存在相关性。后续实验表明，通过低浓度异噁唑苯对纤维素合酶进行轻度抑制，可降低这些细胞中结晶纤维素的含量，进而部分恢复生长抑制，促进细胞的单向扩展和根的伸长15.

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讨论

在此，我们介绍一种用于测定构成不同组织中结晶纤维素积累量的方法 拟南芥 根部，同时保留解剖学信息。因此，该方法为在细胞分辨率下理解植物生长过程提供了进一步的步骤。该方法也可应用于其他植物物种及器官的研究。

应用该方法时需考虑若干要点。首先，只有当纤维素微纤丝的取向相似时，才能对特定根段中的不同组织、不同基因型的根段或不同处理之间的结晶纤维素积累进行比较。纤维素微纤丝的取向是在包含细胞壁一个侧面的纵切面上确定的18。因此，从根的最外层到最内层组织依次获取的一系列纵切面，可在特定发育阶段对不同组织中的纤维素微纤丝取向进行分析。在本示例中，表皮的分生组织细胞具有较宽范围的纤维素微纤丝取向，其平均纤维素微纤丝角度为140°，而表皮的伸长细胞结构更为有序，其平均纤维素微纤丝角度为120°。这些测量值在野生型与目标突变体之间相似，从而可对相应细胞类型和发育区域的结晶纤维素相对积累量进行可靠比较。

其次，不同区域宽度的差异可能影响测得的光延迟水平。本研究通过将目标组织（表皮细胞）的原始延迟值归一化为另...

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致谢

我们感谢 M. Rosenberg 博士在解剖切片方面的建议和帮助。同时感谢 D. Eisler 提供的技术支持。本研究得到了 FP7-PEOPLE-IRG-2008、国际农业研究与发展双边基金（BARD；IS-4246-09）以及以色列科学基金会（ISF；592/13）资助项目的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
MS培养基（Murashige & Skoog）DuchefaM0221
硼砂LOBA CHEMIE 6038
亚甲蓝SigmaM-9140
亮甲苯蓝Sigma861065
注射器驱动式0.22 mm PVDF滤器 MILLEX-GV
戊二醛EMS16220
二甲胂酸钠SigmaC-0250
Leica组织树脂试剂盒 Leica7022 18 500
包埋模具Agar ScientificAGG3530
100 µ P.P.C.薄膜 www.Jolybar.com投影胶片
切刀制作仪LKB7800
超薄切片机III型LKB8800超薄切片机
Shandon免疫封片剂 Thermo9990402封片介质
光学显微镜NikonEclipse 80i
Abrio成像系统CRIAbrio imaging system
Abrio V2.2软件CRIAbrio V2.2 software
开源偏振光图像分析软件  OPSOpenPolScopehttp://www.openpolscope.org/

参考文献

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