结晶纤维素积累高分辨率的量化拟南芥根监视特定组织细胞壁修改

Summary

结晶纤维素是植物细胞壁的重要组成部分。然而，它在细胞分辨率下的定量在技术上具有挑战性。 在这里，我们报告了使用偏振光技术和根横截面在时空分辨率下获得细胞壁组成的信息。

Abstract

植物细胞被细胞壁包围，细胞壁的组成决定了它们的最终大小和形状。细胞壁由含有多糖的复杂基质组成，其中包括形成晶体结构和无定形组织纤维素链的纤维素微纤维。纤维素纤维的取向及其浓度决定了细胞的机械性能。有几种方法用于确定结晶纤维素的水平，每种方法都有优点和局限性。 有些可以区分总纤维素中结晶区域的比例。然而，它们仅限于缺乏时空信息的整个器官分析。 其他依赖于实时成像的染料则受到使用不精确染料的限制。在这里，我们报道了一种灵敏的基于偏振光的系统，用于相对光延迟的特异性定量，代表拟南芥根横截面中的结晶纤维素积累。在这种方法中，保持了细胞分辨率和解剖数据，从而能够直接比较构成生长根的不同组织。这种方法开辟了一个新的分析维度，阐明了细胞壁组成、细胞行为和全器官生长之间的联系。

Introduction

植物细胞壁是一个动态的结构。生长的细胞是由初级细胞壁，组织其允许细胞扩大包围。细胞停止生长存款更刚性的次生壁，增强植物的机械支撑。两个单元壁是由嵌入在不同的结构（例如 ，半纤维素和果胶），该跨不同发育阶段变化和组织^1,2的多糖的基质纤维素微纤维。纤维素被合成为被严格对齐，以形成晶体结构的微纤丝（1,4）-β-D-葡聚糖的链。无定形纤维素是指其中葡聚糖链较少有序的区域。该结晶和无定形结构域之间的比率是认为影响细胞壁的机械特性的一个参数，通过提供机械强度和粘弹性特性，分别为^3。几种方法已经开发检测和定量的两种形式的纤维素排列的，其中的X射线衍射和交叉极化/魔角旋转固态核磁共振^4。 X射线衍射可以被用来确定样品⁵中结晶与非晶纤维素域的比例。另一种方法使用的细胞壁含量分馏成酸不溶性和酸可溶材料，分别结晶和无定形纤维素或其它聚合物之间进行区分。在这种方法中，标记的葡萄糖^（[14 C]葡萄糖）的掺入来量化纤维素^6,7。这些方法需要大量的用于整个器官的分析，在最好的植物材料，因此，是在细胞壁结构组织特异性变异充分敏感。在细胞分辨率纤维素微的可视化可以在用荧光染料^8,9-结合实时成像研究来实现，它可以识别在改变纤维素微纤维的取向。然而，这些染料不用于定量，它们不是特定于结晶纤维素和可以与细胞壁⁸的正常结构干扰。 Polscope是成像技术，其依赖于结晶纤维素分裂光束和延缓的光¹⁰的一部分的能力。光相位差是最强的为垂直骗光传播方向的微纤维。对于具有类似取向的微纤维，结晶度越高，越大的光延迟^11。因此，polscope是用来研究两个相对水平和纤维素微纤维的取向。

根部呈现线性的增长，在此期间，细胞产生于干细胞小生境，在根的前端，经过一系列的细胞分裂，它们迅速扩大¹²之前。包括根细胞在单向（各向异性）展开方式，作为决定由小分子信令激素影响细胞壁¹³的属性。不同的反应激素，在时间和空间，提供了确保平衡的器官生长¹⁴的一种手段。因此，细胞壁结构的高分辨率分析可以提供更好的理解，以整个器官生长的细胞类型特异性应答之间的连接所需的重要信息。在这里，我们报告polscope，研究结晶纤维素的组织特异性的积累拟南芥根系在高品质的解剖观察部分的执行情况。这种方法最近发现响应于激素活性¹⁵的空间扰动的结晶纤维素的细胞类型特异性蓄积。

Protocol

1.植物生长

1. 表面消毒的种子。
   1. 通过湿法或干法消毒的种子（最多30毫克）。作为一个例子，为干热灭菌法，在一个封闭的干燥器在50毫升漂白加入1毫升冰盐酸37％，在玻璃烧杯中，至少4小时和最多过夜。执行在化学罩此步骤。
2. 传播在0.5倍的Murashige＆Skoog培养基（MS）培养基，0.8％植物琼脂平板上无菌种子。包装用封口膜或多孔带板和铝箔覆盖。
3. 存储平板在4℃下1 - 4天推匀发芽。
4. 传送板，以适于生长的拟南芥幼苗的生长室。将平板垂直地维持在琼脂培养基的顶端的根生长，并防止渗透。
5. 转移苗发芽（DAG）后固定液7天。

2.固定

1. 准备50毫升理查德森搜索解决方案通过在双蒸水1％硼砂（缓冲剂），1％亚甲基蓝和1％天青（组织学染料）等体积的结合Ñ。通过使用前驱动0.22微米的PVDF过滤单元注射器过滤。
2. 准备50毫升固定液:1.25％戊二醛在0.05M二甲胂酸钠（缓冲剂）。
   注意:这些物质是有毒的，并且必须在化学通风橱中处理。
3. 加的理查森溶液100微升（见2.1）的固定溶液（见2.2），得到最终的固定溶液。
4. 标记与相应的样品名称的6孔板的每个孔中。
5. 放置2 - 3毫升最终固定溶液（见2.3）插入的孔中，从而使幼苗，一旦转移，将在液体中完全覆盖。
6. 小心转移，使用镊子，最多10苗每个孔中。使用密封封口膜板。储存在4℃下，在黑暗中，用于至少一个晚上，最多一周。

3.脱水

1. 脱水苗。转移他们的新6孔平板的孔之间，含有增加的乙醇浓度，如下所示:10％乙醇15分钟; 30％乙醇15分钟; 50％乙醇15分钟; 70％乙醇15分钟; 85％乙醇15分钟; 95％乙醇15分钟;在4℃，过夜，以最低95％的乙醇。通过他们的子叶，最好用塑料镊子小心地抓住他们处理苗。

4.渗透

1. 准备渗透网上平台。将1袋ヒ套件激活的内容与一个小玻璃瓶50毫升基本树脂液套件。用磁铁20分钟搅拌。浸润培养基可保持在4℃几周。
2. 标记与相应的样品名称的新6孔平板的每个孔中，并用2填充 - 3毫升浸润培养基。
3. 从95％的乙醇溶液，以使用镊子渗入介质传送苗。确保苗福由介质LLY覆盖。
4. 储存在4℃下至少4天，以确保最大的渗透到植物组织。

5.块准备

1. 将小标签，铅笔标明样品名称，嵌入模具的每一个孔里。
2. 准备加入1 ml固化剂到15ml渗透介质（见4.1）嵌入介质。不要试图准备一个容量小于15毫升，以避免聚合的问题。
3. 填充一半各孔在用200μl包埋介质的模具和与切断模具形状的塔顶薄膜片覆盖，但以一个大小为1毫米的每个侧大。在室温下孵育至少2小时，以允许聚合。不要超过5小时。
4. 制备额外批次包埋培养基（见5.2），并保持在冰上，以避免聚合而根尖被布置在模具中。
5. 用手术刀切下解剖范围内的每个根尖和非常小心我的位置T:垂直的横截面或横向纵向部分，约2 - 从模具边缘3毫米。与封闭液，还包括与架空电影完全填满模具。注意，一旦它被聚合的封闭溶液将略有收缩。
6. 保持在室温下2小时，在最低限度。
7. 干块，放置在干燥硅胶的盒子，并在室温离开过夜，在最低限度。

6切片

1. 从准备玻璃棒玻璃刀用刀子机。使用玻璃刀用于组织切片。切玻璃棒成方形，然后切正方形对角线产生两把刀，使用金刚石得分利器。
2. 节块分成2 - 3微米宽度切片，用切片机。在载玻片上地方切片，在蒸馏水液滴的顶部，并放置为低热量的热块上的滑动件（50 - 60℃），直到水蒸发。

7。幻灯片准备偏光显微镜

1. 理查德森稀释液（见2.1），以原始溶液的0.2％及使用方法1毫升它覆盖片。放置5秒钟的加热块上，然后用蒸馏水冲洗。
2. 干热板上的幻灯片。观察下解剖范围和标记的幻灯片用标记在后面，以指示感兴趣的切片的位置，以便于在显微镜下它们的后面的识别。
3. 将100μl封固剂和覆盖的盖玻片。

8.图像采集

1. 放置装有装有适于获得延迟信息和偏振器/干扰光滤光器（ 图1的AD）Polscope系统在光学显微镜下的根部分中的覆盖滑动。
2. 选择放大，允许整个样本的清晰的可视化（ 例如 ，40X在这项研究中）和聚焦显微镜E在包含块段，但没有根部分的空场。试着找一个干净的区域，没有瑕疵。使用此区域设置背景。
3. 设置成像系统和软件参数:设定范围到17纳米。应用"自动曝光"，并从空场获得背景图像（见图8.2）。一个背景图像被每个实验使用。

9.纤维素微纤丝取向Polscope分析

1. 分析纵向部分。
   1. 将含在显微镜下纵段的幻灯片，并获得它的延迟的图像。专注于感兴趣的根部显微镜。提供一个新的文件名。
   2. 通过"实时Abrio"窗口捕捉abrio图像（迟缓的信息图像）。一定要捕获包括细胞壁，这可以通过沿着电池的周边运行染色纤维素被识别， 如图2C的剖面。
2. 图像分析。
   1. 在图像堆栈相关的图像上双击。在"显示设置"选项卡中选择"方向伪彩"。
   2. 为了估计纤维素微纤丝角，匹配细胞壁的色轮中相应的树荫的。
      注意:在图2C的彩色轮反射光沿其指示沿着微纤维的长轴方向上的微纤维躺着的慢轴。纤维素微纤丝的角度是由颜色和单元的长轴指示的角度。例如，在嵌入的伸长细胞显示青色，约90°倾斜的细胞的长轴。
   3. 为了量化在细胞壁的平均微纤丝角，从软件的工具栏中用"延迟和方位角印记"的工具。在选择工具，点一下就所获得的图像中感兴趣的区域。
      注:此WIL升结果在度角（方位角）（ 图2C）的显示。
   4. 在另一种开放获取偏振光图像分析软件，午餐"波尔分析仪"，从插件菜单插件。在新打开的窗口中，选择"双折射"选项卡，打开并保存背景文件和图像文件。
   5. 在图像窗口中，选择"规格"。并调整"ROI像素尺寸'（使用5个像素为这项研究）。中的"规格"。窗口中，选择"在结果列表中显示的值"。
   6. 使用多边形工具，以纪念在图像窗口中感兴趣的区域。选择"方向线"，以获得纤维素微纤维的取向。
      注意:这将导致在度角（方位角）的显示。
      注意:用两种方法之一计算出的平均角度应然后标准化为沿着滑动根部的定位。为了校正偏差，从沿着滑动整根部的水平定位，量化细胞壁侧翼沿其长轴的小区的平均微纤丝角（即，垂直于该部分和沿着根生长轴， 图2C）。此角度为180°时根部准确沿着滑动地定位。为计算微纤丝角，从180°减去侧翼细胞壁的平均测微纤丝角。所得差添加到细胞壁的平均测微纤丝角，关于滑动平整。

结晶纤维素积累10 Polscope分析

1. 使用横向（横）截面。注意，结晶纤维素积累只能小区之间进行比较时其纤维素微以类似的角度对准的（如在9确定）。
2. 在图像堆栈相关的图像上双击。选择"P"中的"显示设置"选项卡seudo颜色。
3. 为了测量延迟。放大-在图像上。选择"地区"，并标记感兴趣的所有区域。移动到"三围"选项卡和"复制到剪贴板"的所有值。
   1. 将数据传输到Excel和提取所需的信息（平均延迟的区域）。正常化的数据。
      注意:为了考虑切片之间的厚度的差异，表示相对于在滑动一个特定细胞壁边缘的值。正常化，除以不同细胞壁的同一图像中的平均延迟对应于感兴趣的细胞壁的平均延迟。例如，外表皮细胞壁被归一化到在我们的研究中的内皮层细胞壁。
4. 重复测量每根的至少3个部分，用最少的每个样品3根。

Results

我们研究的细胞类型特异性反应油菜素内酯（BRS）的影响，使用拟南芥根作为模型器官^15-17。当BR受体BRI1是有针对性的，在BRI1突变体的背景下，对被称为非毛细胞表皮细胞的一个子集（ 图2A，B）中 ，它抑制相邻小区的单向电池膨胀，并完全根生长^15。进行揭示这背后的抑制机制Polscope分析。从野生型和从非毛细胞表达BRI1线得到的根的纵向部分只，表明纤维素微（ 图2C，D和在9.2.3所解释）的类似取向，使结晶的相对累积的比较纤维素在分生和延长细胞，使用从这些区域（ 图2E，F）截取的横截面。这个分析显示correlat非毛细胞BRI1的表达和结晶纤维素的局部堆积的离子。后续实验表明，纤维素合酶的轻度抑制由低浓度isoxaben的降低结晶纤维素的在这些细胞中，这反过来，部分恢复生长抑制，通过促 ​​进单向细胞扩张和根长¹⁵的水平。

Discussion

在这里，我们提出了一个方法，测定不同组织组成拟南芥根部结晶纤维素的积累，同时保持解剖信息。因此，它提供了对在一个蜂窝分辨率理解在植物生长过程的附加步骤。这种方法也可以应用于其他植物物种和器官的研究。

数点必须应用该方法时，必须考虑。在给定的根段第一，结晶纤维素积累可以组织之间进行比较，从不同基因型的部分之间和处理间，如果他们的纤维素微纤维的取向是相似的。纤维素微取向在含有细胞壁¹⁸的一个表面的纵向截面来确定。因此，一系列纵向部分，覆盖根部的不同组织中，从外到内最那些，使analys是纤维素微纤维取向在不同的组织，在给定的发育阶段的。在这里所示的例子中，表皮的分生组织细胞有140°的平均纤维素微角广泛纤维素微取向，而表皮的延长细胞具有更有组织的结构，具有的平均纤维素微角120°。这些测量是野生型和感兴趣的突变体之间的相似，从而使它们的相对结晶纤维素积累的自信比较，在相应的细胞类型和发育区。

其次，可变性在不同段的宽度会影响测量的光延迟的水平。这是通过正火兴趣（表皮细胞）的组织的原始延迟测量...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Murashige &Skoog （MS）	Duchefa	M0221
硼砂	LOBA化学	6038
亚甲蓝	Sigma	M-9140
Azure	Sigma	861065
针驱动 0.22 毫米 PVDF 过滤器	MILLEX-GV
戊二醛	EMS	16220
二甲胂酸钠	Sigma	C-0250
徕卡试剂盒 historesin	Leica	7022 18 500
包埋模具	琼脂科学	AGG3530
胶片 100 和微量;邮编			架空电影
Knivemaker	LKB	7800
Ultratome III	LKB	8800	Ultratome
Shandon immumount	热	9990402	安装中
光显微镜	尼康	Eclipse 80i
Abrio 成像系统	CRI	Abrio 成像系统
Abrio V2.2 软件	CRI	Abrio V2.2 软件
开放式偏振光图像分析软件	OPS	OpenPolScope	http://www.openpolscope.org/