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原位表征水溶液中水合蛋白质的 SALVI 与 ToF-SIMS 方法

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DOI：

10.3791/53708

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2016年2月15日

 ,  ,  ,  , 
1Fundamental & Computational Sciences Directorate, Pacific Northwest National Laboratory, 2Wiley Environmental Molecular Sciences Laboratory, Pacific Northwest National Laboratory

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本研究提供了一种用于液体处理及将样品引入微通道的实验方案 原位 飞行时间二次离子质谱法分析水溶液中的蛋白质生物分子

摘要

本研究展示了 原位 利用液体-真空界面分析系统（SALVI）和飞行时间二次离子质谱（ToF-SIMS）对水溶液中蛋白质生物分子进行表征。纤维连接蛋白（fibronectin）蛋白膜被固定在构成SALVI检测区域的氮化硅（SiN）膜上。在进行ToF-SIMS分析时，共采用三种分析模式：高空间分辨率质谱、二维（2D）成像和深度剖析。质谱数据在正离子和负离子模式下均被采集。去离子水也被作为参比样品进行分析。实验结果表明，与纯水相比，水中的纤维连接蛋白膜表现出更明显且更强的水簇峰。在水合蛋白的ToF-SIMS谱图中，还可观察到氨基酸片段的特征峰。这些结果表明，首次实现了在液相环境中利用SALVI与ToF-SIMS对蛋白质分子在界面上的吸附行为进行动态研究。 关键词：SALVI，飞行时间二次离子质谱，ToF-SIMS，纤维连接蛋白，水溶液，蛋白质吸附，液相界面分析，水簇峰，氨基酸片段，深度剖析，二维成像，高空间分辨率质谱

引言

水合作用对蛋白质的结构1、构象2以及生物活性3至关重要。若蛋白质周围没有水分子，则其将不具备可行使的生物活性。具体而言，水分子会与蛋白质的表面及内部结构发生相互作用，而蛋白质不同的水合状态会使这些相互作用表现出差异4。蛋白质与固体表面的相互作用是一种基本现象，在纳米技术、生物材料和组织工程过程中具有重要意义。长期以来的研究表明，当蛋白质接触表面时可能发生构象变化。飞行时间二次离子质谱（ToF-SIMS）被认为是一种具有潜力用于研究蛋白质-固体界面的技术5-7。理解蛋白质在固体表面上的水合状态至关重要，这有望为揭示其结构、构象及生物活性的机制提供基础性认识。

然而，主要的表面分析技术大多基于真空环境，由于挥发性液体在真空条件下会迅速蒸发，因此难以直接将其应用于挥发性液体的研究。我们开发了一种与真空兼容的微流控接口——液体-真空界面分析系统（System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface, SALVI），可实现利用飞行时间二次离子质谱（ToF-SIMS）对液体表面及液-固相互作用进行直接观测。8-11 该系统具有以下独特优势：1）检测窗口为直径2-3 μm的微孔，可实现对液体表面的直接成像；2）利用表面张力将液体稳定地保持在微孔内；3）SALVI可在多种分析平台上通用。11,12

SALVI 由作为检测区域的氮化硅（SiN）膜和聚二甲基硅氧烷（PDMS）制成的微通道组成。其在洁净室中制备，制备方法及关键设计因素已在先前的论文和专利中详细描述。8-12 通过使用多种水溶液和复杂液体混合物（其中一些含有纳米颗粒），展示了飞行时间二次离子质谱（ToF-SIMS）作为分析工具的应用。13-17 具体而言，SALVI 液体飞行时间二次离子质谱（liquid ToF-SIMS）可实现对活体生物系统液-固界面的动态探测（即，生物膜）、单细胞以及固态电解质界面，为相关研究开辟了新的机遇 原位 包括使用飞行时间二次离子质谱（ToF-SIMS）对液体等凝聚相体系的研究。然而，当前的设计尚不支持气液相互作用的分析，这将是未来发展的方向。本研究首次利用SALVI对水合蛋白质薄膜进行了研究。

纤连蛋白是一种常用的蛋白质二聚体，由两个几乎相同的单体通过一对二硫键连接而成18，以其结合细胞的能力而广为人知19,20。本研究选择其作为模型体系，以证明水合蛋白质薄膜可通过SALVI液相飞行时间二次离子质谱（ToF-SIMS）方法进行动态探测。将蛋白质溶液引入微通道中，孵育12小时后，在氮化硅（SiN）膜的背面形成一层水合蛋白质薄膜。在引入蛋白质后，使用去离子水（DI水）冲洗通道。利用动态ToF-SIMS从SALVI微通道中的水合纤连蛋白分子获取信息。同时研究了去离子水作为对照，以与水合纤连蛋白薄膜的检测结果进行比较。在水合蛋白质薄膜与去离子水之间观察到显著差异。本工作表明，在液相环境中蛋白质在表面的吸附行为可通过新型SALVI与液相ToF-SIMS方法进行研究。该视频方案旨在为有意将这一新型分析工具应用于SALVI结合ToF-SIMS多种研究领域的人员提供技术指导，并减少液体操作以及ToF-SIMS数据采集与分析过程中的不必要错误。

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方案

1. SALVI 微通道的清洗与灭菌

  1. SALVI 中微通道的灭菌
    1. 用注射器吸取 2 ml 70% 乙醇水溶液，将注射器连接至 SALVI 的入口端，缓慢注入 1 ml 液体，用时 10 分钟。注射结束后取下注射器。随后，使用聚醚醚酮（PEEK）接头将 SALVI 的入口和出口连接。或者，可使用注射泵执行相同操作，例如，设置流速为 100 μl/min。
    2. 在室温下使 SALVI 微通道中充满 70% 乙醇溶液，静置 4 小时。
  2. 将去离子水（DI 水）引入 SALVI
    1. 用注射器吸取 2 ml 灭菌去离子水，将注射器连接至 SALVI 的入口，缓慢注入 1 ml 液体，用时 10 分钟。取下注射器后，使用 PEEK 接头连接 SALVI 的入口和出口。或者，可参照步骤 1.1.1 使用注射泵进行操作。

2. 在SALVI中固定蛋白质膜

  1. 在 SALVI 中固定蛋白质膜
    1. 用注射器吸取 2 ml 纤连蛋白溶液（10 μg/ml，溶于磷酸盐缓冲液 PBS 中），将注射器连接至 SALVI 的进样口，缓慢注入 1 ml 液体，用时 10 分钟，移除注射器，并使用 PEEK 接头将 SALVI 的进样口和出样口连接。
    2. 将装有纤连蛋白溶液的 SALVI 置于洁净的培养皿中，在室温下的超净台内孵育 12 小时。
    3. 用注射器吸取 2 ml 灭菌去离子水，并将其连接至 SALVI 的进样口。缓慢注入 1 ml 水，用时 10 分钟，移除注射器，并连接 SALVI 的进样口和出样口。
      注意：若配备光学显微镜，可在显微镜下检查 SALVI，确保在进行 ToF-SIMS 分析前氮化硅（SiN）膜完整无损。此时 SALVI 装置已准备好进行 ToF-SIMS 分析。

3. 将SALVI安装到飞行时间二次离子质谱仪的进样室中

注意：在操作 SALVI 装置以及将其安装到 ToF-SIMS 样品台时，应始终佩戴手套，以避免表面分析过程中可能发生的污染。

  1. 将SALVI安装到载物台上
    1. 将飞行时间二次离子质谱（ToF-SIMS）载物台放置在平坦且洁净的表面上。将SALVI装置置于载物台上，使硅晶圆和氮化硅（SiN）膜朝上。使用四个金属夹片固定SALVI，并通过四颗螺丝将固定装置四角的金属片拧紧至金属板上。
    2. 轻轻卷起连接至微流控通道的聚四氟乙烯（PFTE）管路。使用四个金属片和四颗螺丝将刚性部分固定压紧。确保该装置位于SIMS载物台的开放区域中，以免在分析过程中干扰一次离子束。有关SALVI的制备与安装的额外图像和示意图可参见先前发表的文献8,9,11。
  2. 将法拉第杯安装到载物台上
    1. 用一颗螺丝将法拉第杯固定在载物台上。
  3. 将载物台装入飞行时间二次离子质谱（ToF-SIMS）进样锁室
    1. 打开飞行时间二次离子质谱（ToF-SIMS）进样锁室，水平握住载物台并将其放置在装载平台上，然后关闭进样锁室门。

4. ToF-SIMS 数据采集

  1. 打开真空泵，确保达到合适的真空度（例如，数量级为10-6 mbar 或 Torr）时。
  2. 约30分钟真空稳定后，将SALVI移入主腔室。
    注意：真空度应低于 5 x 10-6 主腔室在数据采集期间应维持 mbar 真空。否则，过高的真空度表明 SALVI 系统存在泄漏。
  3. 根据制造商建议，调节飞行时间二次离子质谱（ToF-SIMS）的初级离子束和分析器，空间分辨率约为400 nm。在直流模式下，初级离子束电流为1,200 pA，循环时间为30 μsec。
    注意：此过程主要遵循制造商的建议。
  4. 使用光学显微镜找到微流控通道。以光学图像中心为参考，将其与二次离子图像中心对齐。
  5. 每次测量前，使用1 KeV O2+ 束流（约40 nA）在500 × 500 µm的SiN窗口上进行扫描2 区域约15秒以去除表面污染。同时，在所有测量过程中使用电子淹没枪以补偿表面电荷积累。此步骤中，将淹没枪的自动功能设置为默认模式。
  6. 在数据采集前选择正离子或负离子模式。使用 25 keV Bi3+ 在所有测量中均使用该束流作为初级离子束。
    注意：正离子模式和负离子模式的数据采集步骤相似。为节省篇幅，此处详细描述正离子模式。
    1. 深度剖析
      1. 扫描 Bi3+ 在直径约为 2 µm 的圆形区域上，以 32 像素 × 32 像素的分辨率进行光束照射。
      2. 为尽量减少穿透氮化硅（SiN）膜所需的时间，应使用较长的脉冲宽度（即，180 纳秒，束流强度约 1.0 pA，周期时间为 100 微秒）Bi3+ 束流。当达到击穿时，来自液体表面的次级离子强度会增加。击穿时间在300秒至500秒之间，具体取决于SiN膜的批次。
        注意：根据我们的经验，这种差异似乎与所采购的SiN膜批次有关。然而，击穿时间实际上并不影响数据分析。
      3. 在SiN膜穿孔后，保持相同的电流约200秒，以获取足够的数据用于二维图像重建。
      4. 将脉冲宽度减小至80纳秒以进行数据采集，从而获得更高质量分辨率的质谱图。继续采集约200秒。所示谱图数据在 图1 从此区域获得。
    2. 二维成像与质谱图
      1. 在测量深度剖析数据的同时，同步采集二维成像和质谱数据。飞行时间二次离子质谱（ToF-SIMS）仪器在实验过程中保存每个测量点的全部信息。数据分别显示在数字控制软件的不同窗口中（即“FPanel - 谱图”、“FPanel - 深度分布”和“FPanel - 图像”）。在数据采集过程中，应仔细检查各个面板中的数据。

5. ToF-SIMS 数据分析

注意：数据分析最初使用 IonToF ToF-SIMS 仪器软件进行。

  1. 打开 SIMS 分析软件（Measurement Explorer），然后依次点击 "profiles”、“spectra”和“image”按钮，分别处理深度剖面、质荷比（m/z）谱图和图像数据。
  2. 打开扩展名为 ".ita" 的数据文件。
  3. 选择感兴趣的峰，在 "ion" 框中输入物种名称，并用不同颜色在谱图中标注。使用鼠标滚轮沿 x 轴拖动。按住 Ctrl 键并滚动鼠标滚轮可调整峰的高度和宽度。字母 "L" 可在 y 轴的线性（Linear）和对数（Log）模式之间切换。
  4. 在质量校准前进行数据重构。否则，在质量校准步骤中将难以选择峰之间的间距。
    1. 选择感兴趣的深度剖析数据，并根据深度剖面的时间序列重建谱图。
    2. 点击重建按钮。在 "Start Reconstruction" 窗口中输入感兴趣的扫描范围。点击 "OK" 以重建深度剖面数据。
  5. 执行质量校准。按 "F3" 键打开 "mass calibration" 窗口。根据具体样品选择用于校准的峰。21 本研究中，正离子模式下使用以下峰：CH3+（m/z 15）、H3O+（m/z 19）、C2H5+（m/z 29）、H5O2+（m/z 37）、C3H7+（m/z 43）、H7O3+（m/z 55）、H9O4+（m/z 71）、H11O5+（m/z 99）和 H13O6+（m/z 109）；负离子模式下使用以下峰：CH-（m/z 13）、O-（m/z 16）、OH-（m/z 17）、C2H-（m/z 25）、C3H-（m/z 37）和 C4H-（m/z 49）。
    1. 选择一个峰，确保窗口左下角的向下箭头指向该峰。点击该峰，并在 "mass calibration" 窗口中输入峰名称，点击 "Add"，即可将目标离子纳入质量校准。
    2. 最后，点击 "Recalibrate" 按钮。检查各峰区域是否根据其质荷比（m/z）处于正确位置。在 "Spectrum" 菜单中，选择并点击 "Apply Mass Calibration"，根据具体分析需求应用于 "All Spectra" 或 "Selected spectra"。
  6. 由于样品分析需要进行峰选择，应根据文献或其他先前研究结果确定样品的特征峰。比较 m/z 谱图中感兴趣峰的强度。如有必要，在峰列表中添加新峰或删除无用峰。
    1. 添加峰。点击一个峰，在左下角窗口中找到红色线条。按住 "Ctrl" 键，水平滚动鼠标以定义峰宽，系统将自动将该峰添加至峰列表。另一种添加峰的方法是：在主谱图窗口中选择一个峰，然后点击窗口上方的 "add peak" 按钮。若需添加多个峰，可在 "Spectrum" 菜单中选择 "search peaks"，在新打开的窗口中勾选相关参数，然后按需添加峰。
    2. 导出峰列表时，在 "Peak List" 菜单中选择 "Save…”，将峰列表保存为 "itmil" 格式。使用 Ctrl 键和鼠标左键沿谱图拖动。在谱图窗口中选择一个感兴趣的峰，并将两条虚线拖动至理想位置。
    3. 导入峰列表时，在 "Mass interval List" 菜单中选择 "Import…”，定位到扩展名为 ".ITPL" 的现有峰列表文件，点击 "Open"。
    4. 使用 "itmil" 峰列表时，在 "Mass Interval List" 菜单中点击 "Open…”，找到文件后点击 "Open"。
  7. 应用峰列表进一步分析数据。在 "Spectra" 窗口左下角有一个名为 "Mass Interval List" 的窗口，导入的峰列表将在此显示。
    1. 右键点击要使用的峰列表文件，将其应用于 "active spectrum" 或 "all spectra"。
  8. 查看数据剖面图。在 "Profile" 窗口中，使用字母 "M" 适配窗口（全范围），使用字母 "N" 适配 y 轴。使用 Ctrl 键和鼠标滚轮调整剖面宽度。或者使用键盘上的 "/" 和 "*" 键更改 y 轴的范围和高度。
  9. 初步分析完成后，导出数据以便使用其他图形软件作图。
    1. 导出深度剖面时，在 "Profile" 窗口中点击 "File" 菜单，选择 "Export"，然后选择 "Save as" 为 ".txt" 文件。
    2. 导出 m/z 谱图文件时，在 "Spectra" 窗口中点击 "File" 菜单，选择 "Export"，然后选择 "Save as" 为 ".txt" 文件。
    3. 导出图像文件时，在 "Image" 窗口中截屏并保存为图像文件。

6. ToF-SIMS 数据绘图与展示

注意：使用仪器配套软件处理 SIMS 数据后，利用图形工具绘制数据。

  1. 使用图形工具导入数据。
  2. 以 m/z 为横轴、峰强度为纵轴绘制图表，以显示重建的质谱图。示例见图1。
  3. 以溅射时间为横轴、峰强度为纵轴绘制图表，以显示重建的深度剖面时间序列。示例见图2。
  4. 将不同 m/z 的重建二维图像组合成矩阵，以显示离子分布图。示例见图2。

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结果

展示了一些代表性结果，以说明所提出方案的优势。通过使用SALVI微流控接口，一次离子束（Bi3+）可直接轰击去离子水中的水合纤连蛋白薄膜，从而成功获得液体表面的分子化学分布图谱。

图1a 和1b 分别展示了水合纤连蛋白薄膜和去离子水的正离子飞行时间二次离子质谱（ToF-SIMS）图谱。红箭头标示了感兴趣的峰，包括水团簇（即，m/z 19、37、55、73、91 和 109）以及氨基酸碎片峰（即，m/z 30、44、61、74、81、83 和 98）。除了在干燥蛋白质样品中广泛报道的特征性氨基酸碎片峰外，在去离子水中水合纤连蛋白薄膜的质谱图中还观察到了水团簇峰。此外，这些水团簇峰的强度与去离子水质谱图中的相应峰强度显著不同。该结果为水分子在水合蛋白质分子周围及内部所具有的特性提供了直接证据，表明这些水分子在其...

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讨论

SALVI 是一种微流控界面，可通过基于真空的仪器（如飞行时间二次离子质谱仪（ToF-SIMS）和扫描电子显微镜（SEM））实现对动态液体表面和液-固界面的分析。由于采用小孔径结构使液体直接暴露于真空中，SALVI 无需任何修改即可适用于多种高聚焦的光谱和成像技术22；微流控系统的便携性和多功能性使其成为一个真正的多模态成像平台。与其他现有技术相比，SALVI 的独特特征和重要意义已在多篇近期综述中进行了总结22–25。作为 SALVI 技术的开发者，我们的研究团队已积极将其应用于涉及动态液体表面和液-固界面的多种研究中。一些新应用的实例包括哺乳动物细胞膜、细菌生物膜附着15,16，以及由水相表面氧化反应引发的纳米颗粒形成。本文中，我们展示了吸附在 SiN 表面上的水合蛋白薄膜的初始液相 ToF-SIMS 分析结果。

在实验方案中，必须格外注意标亮的步骤。例如，在步骤1和步骤2中将液体吸入注射器时，务必确保注射器内无任何气泡。因为一旦气泡被注入SALVI装置，可能会导致真空系统发生泄漏9。因此，...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢太平洋西北国家实验室（PNNL）化学成像计划—实验室自主研究与发展（CII-LDRD）以及跨尺度材料合成与模拟（MS3）计划LDRD基金的支持。仪器使用权限通过W. R. Wiley环境分子科学实验室（EMSL）科学主题提案获得。EMSL是由PNNL生物与环境研究办公室（BER）资助的国家级科学用户设施。作者感谢隋晓先生、丁元钊先生和姚娟女士对稿件的校对及提供的有益反馈。PNNL由巴特尔公司根据合同DE-AC05-76RL01830为美国能源部（DOE）运营。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
ToF-SIMSIONTOFTOF.SIMS 5分辨率：>10,000 m/Δm（质量分辨率）；>4,000 m/Δm（高空间分辨率） 
液体-真空界面分析系统（SALVI）太平洋西北国家实验室N/ASALVI 是一种独特、自成一体且可移动的分析工具，首次使基于真空的科学仪器（如飞行时间二次离子质谱，ToF-SIMS）能够在分子水平上对液体表面的自然状态进行分析。
PEEK 接头ValcoZU1TPK用于连接 SALVI 的进样口和出样口
五轴样品台IONTOFN/A样品台为自制，用于在 ToF-SIMS 中安装 SALVI
Barnstead Nanopure 水纯化系统赛默飞世尔科技D11921ROpure LP 反渗透过滤模块（D2716）
注射器BD3096591 ml
移液器赛默飞世尔科技21-377-821量程：100 至 1,000 ml
移液器吸头Neptune2112.96.BS1,000 µl
离心管Corning43079115 ml
纤连蛋白Sigma-AldrichF11411 mg/ml
乙醇赛默飞世尔科技S25310A95% 变性乙醇
Gibco 磷酸盐缓冲液（PBS）赛默飞世尔科技10010-023pH 7.4

参考文献

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