原位表征水溶液中水合蛋白质的 SALVI 与 ToF-SIMS 方法

摘要

本研究提供了一种用于液体处理及将样品引入微通道的实验方案 原位 飞行时间二次离子质谱法分析水溶液中的蛋白质生物分子

摘要

本研究展示了 原位 利用液体-真空界面分析系统（SALVI）和飞行时间二次离子质谱（ToF-SIMS）对水溶液中蛋白质生物分子进行表征。纤维连接蛋白（fibronectin）蛋白膜被固定在构成SALVI检测区域的氮化硅（SiN）膜上。在进行ToF-SIMS分析时，共采用三种分析模式：高空间分辨率质谱、二维（2D）成像和深度剖析。质谱数据在正离子和负离子模式下均被采集。去离子水也被作为参比样品进行分析。实验结果表明，与纯水相比，水中的纤维连接蛋白膜表现出更明显且更强的水簇峰。在水合蛋白的ToF-SIMS谱图中，还可观察到氨基酸片段的特征峰。这些结果表明，首次实现了在液相环境中利用SALVI与ToF-SIMS对蛋白质分子在界面上的吸附行为进行动态研究。 关键词：SALVI，飞行时间二次离子质谱，ToF-SIMS，纤维连接蛋白，水溶液，蛋白质吸附，液相界面分析，水簇峰，氨基酸片段，深度剖析，二维成像，高空间分辨率质谱

引言

水合作用对蛋白质的结构¹、构象²以及生物活性³至关重要。若蛋白质周围没有水分子，则其将不具备可行使的生物活性。具体而言，水分子会与蛋白质的表面及内部结构发生相互作用，而蛋白质不同的水合状态会使这些相互作用表现出差异⁴。蛋白质与固体表面的相互作用是一种基本现象，在纳米技术、生物材料和组织工程过程中具有重要意义。长期以来的研究表明，当蛋白质接触表面时可能发生构象变化。飞行时间二次离子质谱（ToF-SIMS）被认为是一种具有潜力用于研究蛋白质-固体界面的技术^5-7。理解蛋白质在固体表面上的水合状态至关重要，这有望为揭示其结构、构象及生物活性的机制提供基础性认识。

然而，主要的表面分析技术大多基于真空环境，由于挥发性液体在真空条件下会迅速蒸发，因此难以直接将其应用于挥发性液体的研究。我们开发了一种与真空兼容的微流控接口——液体-真空界面分析系统（System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface, SALVI），可实现利用飞行时间二次离子质谱（ToF-SIMS）对液体表面及液-固相互作用进行直接观测。^8-11 该系统具有以下独特优势：1）检测窗口为直径2-3 μm的微孔，可实现对液体表面的直接成像；2）利用表面张力将液体稳定地保持在微孔内；3）SALVI可在多种分析平台上通用。^11,12

方案

1. SALVI 微通道的清洗与灭菌

1. SALVI 中微通道的灭菌
   1. 用注射器吸取 2 ml 70% 乙醇水溶液，将注射器连接至 SALVI 的入口端，缓慢注入 1 ml 液体，用时 10 分钟。注射结束后取下注射器。随后，使用聚醚醚酮（PEEK）接头将 SALVI 的入口和出口连接。或者，可使用注射泵执行相同操作，例如，设置流速为 100 μl/min。
   2. 在室温下使 SALVI 微通道中充满 70% 乙醇溶液，静置 4 小时。
2. 将去离子水（DI 水）引入 SALVI
   1. 用注射器吸取 2 ml 灭菌去离子水，将注射器连接至 SALVI 的入口，缓慢注入 1 ml 液体，用时 10 分钟。取下注射器后，使用 PEEK 接头连接 SALVI 的入口和出口。或者，可参照步骤 1.1.1 使用注射泵进行操作。

2. 在SALVI中固定蛋白质膜

1. 在 SALVI 中固定蛋白质膜
   1. 用注射器吸取 2 ml 纤连蛋白溶液（10 μg/ml，溶于磷酸盐缓冲液 PBS 中），将注射器连接至 SALVI 的进样口，缓慢注入 1 ml 液体，用时 10 分钟，移除注射器，并使用 PEEK 接头将 SALVI 的进样口和出样口连接。
   2. 将装有纤连蛋白溶液的 SA....

结果

展示了一些代表性结果，以说明所提出方案的优势。通过使用SALVI微流控接口，一次离子束（Bi₃⁺）可直接轰击去离子水中的水合纤连蛋白薄膜，从而成功获得液体表面的分子化学分布图谱。

图1a 和1b 分别展示了水合纤连蛋白薄膜和去离子水的正离子飞行时间二次离子质谱（ToF-SIMS）图谱。红箭头标示了感兴趣的峰，包括水团簇（即，m/z 19、37、55、73、91 和 109）以及氨基酸碎片峰（即，m/z 30、44、61、74、81、83 和 98）。除了在干燥蛋白质样品中广泛报道的特征性氨基酸碎片峰外，在去离子水中水合纤连蛋白薄膜的质谱图中还观察到了水团簇峰。此外，这些水团簇峰的强度与去离子水质谱图中的相应峰强度显著不同。该结果为水分子在水合蛋白质分子周围及内部所具有的特性提供了直接证据，表明这些水分子在其.......

讨论

SALVI 是一种微流控界面，可通过基于真空的仪器（如飞行时间二次离子质谱仪（ToF-SIMS）和扫描电子显微镜（SEM））实现对动态液体表面和液-固界面的分析。由于采用小孔径结构使液体直接暴露于真空中，SALVI 无需任何修改即可适用于多种高聚焦的光谱和成像技术²²；微流控系统的便携性和多功能性使其成为一个真正的多模态成像平台。与其他现有技术相比，SALVI 的独特特征和重要意义已在多篇近期综述中进行了总结^22–25。作为 SALVI 技术的开发者，我们的研究团队已积极将其应用于涉及动态液体表面和液-固界面的多种研究中。一些新应用的实例包括哺乳动物细胞膜、细菌生物膜附着^15,16，以及由水相表面氧化反应引发的纳米颗粒形成。本文中，我们展示了吸附在 SiN 表面上的水合蛋白薄膜的初始液相 ToF-SIMS 分析结果。

在实验方案中，必须格外注意标亮的步骤。例如，在步骤1和步骤2中将液体吸入注射器时，务必确保注射器内无任何气泡。因为一旦气泡被注入SALVI装置，可能会导致真空系统发生泄漏⁹。因此，.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ToF-SIMS	IONTOF	TOF.SIMS 5	分辨率：>10,000 m/Δm（质量分辨率）；>4,000 m/Δm（高空间分辨率）
液体-真空界面分析系统（SALVI）	太平洋西北国家实验室	N/A	SALVI 是一种独特、自成一体且可移动的分析工具，首次使基于真空的科学仪器（如飞行时间二次离子质谱，ToF-SIMS）能够在分子水平上对液体表面的自然状态进行分析。
PEEK 接头	Valco	ZU1TPK	用于连接 SALVI 的进样口和出样口
五轴样品台	IONTOF	N/A	样品台为自制，用于在 ToF-SIMS 中安装 SALVI
Barnstead Nanopure 水纯化系统	赛默飞世尔科技	D11921	ROpure LP 反渗透过滤模块（D2716）
注射器	BD	309659	1 ml
移液器	赛默飞世尔科技	21-377-821	量程：100 至 1,000 ml
移液器吸头	Neptune	2112.96.BS	1,000 µl
离心管	Corning	430791	15 ml
纤连蛋白	Sigma-Aldrich	F1141	1 mg/ml
乙醇	赛默飞世尔科技	S25310A	95% 变性乙醇
Gibco 磷酸盐缓冲液（PBS）	赛默飞世尔科技	10010-023	pH 7.4