小鼠脑切片准备扣押样活性的直接电流刺激和多电极阵列记录

Summary

研究表明，阴极经颅直流电刺激可对耐药性癫痫发作产生抑制作用。在这项研究中，设计了一种体外实验装置，其中在小鼠脑切片制备中评估了直流电刺激和癫痫发作样活动的多电极阵列记录。评估直流电刺激参数。

Abstract

阴极经颅直流电刺激（TDCS）诱导的耐药性癫痫发作的抑制作用。要进行有效的行动，刺激参数（ 例如 ，方向，电场强度和持续时间的刺激），需要在老鼠大脑切片筹备工作进行检查。测试和安排相对于小鼠脑切片的位置的电极的取向是可行的。本方法保留thalamocingulate途径来评估DCS对前扣带皮层癫痫样活动的影响。多信道阵列记录的结果表明，阴极DCS显著降低的刺激诱发反应的4-氨基吡啶和荷包牡丹碱诱导的癫痫样活动的振幅和持续时间。这项研究还发现，在15分钟阴极DCS应用程序引起的长期萧条的thalamocingulate途径。本研究探讨DCS对thalamocingulat的影响Ë突触可塑性和急性发作之类的活动。当前程序可以测试最佳刺激参数，包括方向，磁场强度，并在体外的小鼠模型刺激持续时间。此外，该方法可以评估的DCS上皮层癫痫样活动在细胞和网络两级的作用。

Introduction

癫痫是一种常见的神经系统疾病。30% 的癫痫患者患有耐药性癫痫发作¹。经颅直流电刺激 （tDCS） 提供了一种无创方法来控制或改变大大脑区域的网络活动，例如癫痫发作。临床研究表明，tDCS 可有效治疗顽固性癫痫发作²，并且可以对癫痫发作产生短期和长期抑制作用^3-5。然而，tDCS 作用的治疗机制仍不清楚。提出的脑切片模型是一种体外方法，用于研究 tDCS 作用的治疗机制如何改变癫痫样大脑活动的症状。因此，为了达到其最佳效果，需要在实验模型中测试特定的刺激参数，包括方向、场强和刺激持续时间。以前的研究表明，电场的方向对于获得治疗效果很重要⁶。因此，测试和安排电极相对于被测脑切片位置的方向是可行的。

额叶癫痫和前扣带皮层 （ACC） 癫痫发作通常具有耐药性^7,8。一些研究报道了 tDCS 在扣带皮层中的应用^9-11。tDCS 通过改变 ACC 活动来影响警觉性、决策和情绪，并且可以调节该大脑区域的神经元兴奋性和癫痫发作活动¹²。因此，tDCS 对 ACC 癫痫发作的抑制作用可能有助于临床治疗和替代治疗的评估。

本方案描述了在记录室中为脑切片的 DCS 准备电极及其对使用多电极阵列 （MEA） 记录癫痫样活动的影响。

Protocol

涉及受试动物的程序是由机构动物护理和利用委员会，中央研究院，台北，台湾批准。

1.准备多电极阵列记录实验方案及设备

1. 制备人造脑脊髓液（ACSF; 124 mM氯化钠，4.4毫摩尔的KCl，1mM的的NaH ₂ PO _3，2毫_硫酸镁 ，2毫_氯化钙 ，25mM的_碳酸氢钠 ，和10mM葡萄糖，用95％氧气鼓泡₂和5％的CO _2）。
2. 使用两种类型的MEA的探针:6×10平面MEA和8×8的MEA。前者探针盖，其包括皮质，纹状体和丘脑的区域。后者探头只包括皮质区域。
3. 使用60通道放大器0.1 Hz和1200扩增3千赫之间设置一个带通滤波器。收购在10 kHz采样率的数据。
4. 将两个氯化银涂层的银线的MEA室里面的DCS。使用氯化银涂覆的银线，以产生由一个孤立的刺激产生的电场。
5. 放置一个钨电极（直径，127微米;长度，7.62厘米; 8°的AC锥形尖端;电阻，5MΩ）为丘脑刺激，并放置在MEA室中的参比电极。交付使用由脉冲发生器控制的分离的激励器的钨电极的电流。

2.脑切片准备

1. 使用雄性C57BL / 6J小鼠，4-8周龄。房子动物在空调房间（21-23℃，湿度50％; 12小时/ 12小时亮/暗循环，在8:00 am开灯），自由获取食物和水。
2. 把在步骤1.1中制备的脑脊液的250毫升等分试样，并将其放置在含有冰的烧杯中。与此同时，供给它由95％O ₂和5％CO ₂的连续气体。
3. 手术
   1. 麻醉，用4％的异氟醚的动物中的玻璃框约3分钟。一旦动物达到手术的麻醉深度（由于缺乏脚趾掐响应的指示），将它放在一个浅盘一个充满碎冰，并用剪刀去除头。
   2. 暴露颅骨，并剪掉剩余的肌肉。接下来，用咬骨钳，剥远离大脑头骨的背水面。剪掉用咬骨钳头骨的侧面。消毒所有手术器械的具有75％的乙醇溶液。
   3. 用刮刀切嗅球和​​神经连接沿大脑腹面，并取出大脑。断头后，大脑迅速转移到填充有冰冷含氧学联的烧杯中。
4. 内侧丘脑（MT）-ACC脑片的制备
   注意:准备包含从MT到ACC ¹³通路切片。
   1. 手切两个削减矢状脑块2.0毫米外侧中线在每个半球显示皮层下解剖。然后提出两个斜切。使交叉切割平行于纹状体可见纤维束的第一。
   2. 使从该中点的前连合和视束是腹侧和平行于thalamocingulate通路之间小​​脑和视觉皮层之间的连接的第二横切。
   3. 附加脑块的角板（〜120°）与腈基丙烯酸酯粘合剂，和使切割正好途径的转折点的上​​方。展开板，压平，然后把它粘到vibratome的室内舞台。
   4. 使内侧丘脑-ACC脑切片（500微米厚），然后沉浸其中在冰冷含氧aCSF.Transfer切片到录音室，而根据连续灌流（12毫升/分钟）保持在32℃下用含氧脑脊液1小时。

3.灌注腔的研制多电极阵列记录

1. 制备灌注腔
   1. 放置一个多通道系统上的MEA的探针，并使用两个单独的聚乙烯管，以将探头连接到蠕动泵。用一个管引导脑脊液到MEA腔和其他管引导脑脊液出室。最后，不断灌注用温水（29-30℃）含氧学联（8毫升/分钟）的规定编制。
2. 脑转移切片MEA。按住用湿棉签MEA大脑切片。仔细动脑子片，保证了ACC是面向在电极上方。
3. 使用切片锚套件和保持起伏按脑片。这个步骤保证了片和电极之间的良好的电连接。

通过DCS电场4代

注意:在电场方向的定义是基于在ACC的axodendritic轴的方向。树突和索玛车厢的方向是使用高尔基染色¹²证实。

1. 放置氯化银电极（定义为阳极）的近端到ACC，以及放置在另一电极（定义为阴极）远端到ACC。记录由所述两个场取向（平行和垂直于ACC axodendritic纤维）通过在MEA中产生的磁场强度，并提供使用刺激电场的电流。
2. 修复氯化银电极（约1.5-2厘米）的距离，并调整刺激的电流强度，使DCS的0.5和2 3mA之间。

5.电致皮层突触反应

注意:通过在MT电刺激，其中，一个可编程的电刺激发生器产生的矩形双相电流脉冲诱导在ACC突触反应。

1. 重复上述第3节。
2. 放置在MT钨电极，并且从刺激器传送脉冲到贫通过双极钨电极片酰胺区域。
3. 使用不同的电流强度，以确定引起ACC的反应阈值。在这里，采用±150μA的强度和持续时间200微秒，这引起了ACC在大多数切片80％的最大反应。
4. 移动沿thalamocingulate途径（从MT能够胼胝体）的钨电极在MT-ACC切片，以获得最佳的响应曲线。
5. 使ACC对10-20扫描，并使用软件自动平均所有MT刺激诱发ACC的。 ISS在ACC由MT-ACC途径从MT刺激诱发突触反应的结果。

6.电诱发癫痫样活动

注意:癫痫样活性诱导的4-氨基吡啶的应用（4-AP; 250μM）和荷包牡丹碱（5μM）。上一个时间控制的研究表明，最大的和稳定的反应出现药后应用¹⁴ 2-3小时。

1. 重复上述第5节。
2. 添加药物的灌注溶液中。使用4-AP（250μM）和荷包牡丹碱（5μM）。混合均匀的药物，继续灌注2-3小时。
3. 为了便于癫痫样活动，保持在一个相对较快的灌注速率（8毫升/分钟），这也可以帮助防止pH梯度的积聚灌注泵。
4. 放置在一个MT钨极，并提供电刺激（150μA，200微秒持续时间），以获得ACC响应曲线。
5. 让10-20扫描和平均响应。
6. 替换用新鲜脑脊液灌注溶液洗出药物。重复步骤6.5。

DCS对诱发皮层响应7.测试效果

1. 并重复第3 4.确保均匀电场通过使被置于其内M个两个平行的AgCl涂层的银导线之间的电流产生的EA室。如果没有问题，在DCS停留0.5和2 3mA之间。
2. 关闭DCS，并把钨电极刺激丘脑（±150μA，200微秒持续时间）。为了获得在ACC最大突触反应，使10-20扫描和平均响应。
3. 同时打开的DCS（2毫伏/毫米DCS强度）和丘脑刺激（350微安，200微秒持续时间）。评估DCS在丘脑刺激诱发的ACC反应的幅度的变化。
4. 关掉DCS和添加4-AP（250μM）和荷包牡丹碱（5微米），以灌注溶液。然后等待2-3个小时。当药物影响大脑切片，切片生产皮质发作的反应。
5. 使ACC对10-20扫描，然后测量电诱发癫痫发作皮质反应的幅度和持续时间。
6. 步骤7.5之后，同时打开在DCS（2毫伏/毫米DCS强度）和丘脑刺激（150微安，200 durati在微秒）。在评估过程中DCS应用的幅度和皮质诱发癫痫发作的反应持续时间的变化。
7. 更换新学联灌注液洗出的药物，并重复步骤7.2和7.3。
8. 收集所有的记录数据，并且数据分组为不同的实验条件。评估不同的实验条件下，皮质癫痫响应的幅度和持续时间。

8.数据分析

1. 使用软件（ 如 MC机架软件）来自动平均记录的响应，以及原始数据导出到电子表格。分析原始数据的幅度和持续时间，并产生颜色的数字。
2. 以检测振荡发作的事件，使用软件来测量基准值和标准偏差（SD）。设置3 SD噪声电平阈值。振荡活动期间的峰值振幅是超过这个阈值的自动检测编辑。
3. 执行使用学生的t检验进行统计分析。
4. 明示的测量和在文本以平均值±SE的方差（ANOVA）结果单向分析，其中n指示的片的数目的研究^12。

Results

在Thalamocingulate切片和MEA记录系统设置的准备

从小鼠MT-ACC切片是一种特殊的切片准备，允许thalamocingulate通路的电生理特性的探索。 图1A示出了制备MT-ACC切片的方式。老鼠的大脑迅速取出并存放于阴凉含氧学联（ 图1A，A，B）。揭示皮层下解剖，将脑切2.0毫米横向从中线在每个半球获得矢状脑块（ 图1A，C，D）。两个成角度的腹侧削减了在大脑中的块作出保留thalamocingulate通路。第一横切口是在大脑块的前面制成，平行于在纹状体中可见纤维束。第二横切于脑块从连接下注后制成吐温小脑和视觉皮层的前连合和视束之间的中点。切口作了后，大脑块被粘在成角度的塑料板（120°角），和一个切直接通过皮质（ 图1A，例如 ）在背侧制成。大脑块板粘在vibratome和凉爽的含氧学联淹没。...

Discussion

在本研究中，DCS系统上ACC癫痫样活动的持续时间和方向的影响进行了试验。以获得在小鼠脑切片稳定的数据，如何保持在MT-ACC通路的完整性，并避免损坏它是关键，特别是在其中两个成角度的腹侧削减和皮质的背切制成的步骤。此外，以制备脑切片的时间也可以影响脑切片，这应该是尽可能短的时间，以保持大脑新鲜和强的活性。先前的研究表明，对靶组织的电化学损伤可在体内制备¹⁵发生。 体外脑切片制剂可用于避免这一问题。 在体外制备中，组织不直接接触的电极，从而最大限度地减少电化学效应^16。 DCS的影响与被定向在不同的方向上该电极进行了比较。当该电极ES在90°和270°取向，DCS没有影响诱发活性（ 图3）。因此，这种对照实验排除了电化学反应的任何副作用的损坏在我们的研究组织DCS的可能性。大脑切片的保护恢复方法是另一个关键;在这项研究中的脑脊液公式提供到保护切割方法的替代，并且是在脑切片的神经元保存从4至8周龄的动物的高度有效的。该方法不适合所有年龄的动物中使用;使用的Tris脑脊液的出现是在老年小鼠6周，老年人使用NMD...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
麻醉剂：
Isoflurane	Halocarbon Products Corporation	NDC 12164-002-25	4%
名称	公司	目录号	评论
aCSF（总计：1 L）：
D（+）-葡萄糖	MERCK	1.08337.1000	10 mM
碳酸氢钠	MERCK	1.06329.0500	25 mM
氯化钠	MERCK	1.06404.1000	124 mM
（+）-L-抗坏血酸钠，>=98%	SIGMA	A4034-100G	0.15 g/2 c.c
无水硫酸镁，ReagentPlus	SIGMA	M7506-500G	2 mM
氯化钙二水合	MERCK	1.02382.1000	2 mM
磷酸二氢钠一水合	MERCK	1.06346.1000	1 mM
氯化钾	May &贝克有限公司 Dagenham England	MS 7616	4.4 mM
名称	Company	目录号	评论
药物：
（+）-Bicuculline	TOCRIS	0130	5 µm在 aCSF
4-氨基吡啶	TOCRIS	0940	250 µm在aCSF
名称	公司	目录号	评论
脑切片制备：
振动切片		系列1000	块切成500和微;m 厚切片
名称	公司	目录号	评论
MEA 系统：
多电极阵列 （MEA） 探头：6 x 10 平面 MEA	多通道系统	60MEA500/30iR-Ti-pr MEAS 6x10	电极直径，30 微米;m;电极间距，500 &m;阻抗，50 kΩ在 200 Hz 时
电极阵列 （MEA） 探头：8 x 8 MEA	Ayanda Biosystems	60MEA200/10iR-Ti-pr MEAS 8x8	金字塔形电极;直径，40 µm;尖端高度，50 µm;电极间距，200 &m;阻抗，1,000 kΩ在 200 Hz 时
，使用 60 通道放大器，在 0.1 Hz 和 3 KHz 之间的带通滤波器，放大 1,200 倍	多通道系统	MEA-1060-BC
MC Rack 软件，采样率为 10 KHz	通道系统		数据收集和记录
发生器的控制	多通道系统	STG 1002
切片锚定套件和固定装置	华纳仪器	SHD-26H/10;WI64-0250
蠕动泵-minipuls3	Gilsom	MINIPULS3	灌注率：8 ml/min
名称	Company	目录号	评论
刺激系统：
隔离刺激器	A-M Systems	Model 2100	强度 ±350 &亩;a ，持续时间为 200 μsec
钨电极	A-M Systems	575300	放置在丘脑中