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方法文章

直流电刺激与多电极阵列记录小鼠脑片中类癫痫样活动

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DOI：

10.3791/53709

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2016年6月7日

 ,  ,  , 
1Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica, 2Department of Anesthesiology, University of Alabama at Birmingham

本文内容

摘要

研究表明，阴极经颅直流电刺激可对耐药性癫痫发作产生抑制作用。本研究设计了一种体外实验装置，用于评估小鼠脑片制备中癫痫样活动的直流电刺激与多电极阵列记录，并对直流电刺激参数进行了评价。

摘要

阴极经颅直流电刺激（tDCS）对耐药性癫痫发作具有抑制作用。为实现有效干预，需设定适当的刺激参数（例如，方向、电场强度和刺激持续时间）需要在小鼠脑片制备中进行检测。测试并调整电极相对于小鼠脑片位置的方向是可行的。本方法保留了丘脑-扣带回通路，以评估直流电刺激（DCS）对前扣带皮层类癫痫样活动的影响。多通道阵列记录结果显示，阴极直流电刺激显著降低了由4-氨基吡啶和荷包牡丹碱诱导的类癫痫样活动的诱发电反应幅度和持续时间。本研究还发现，在刺激15分钟后施加阴极直流电刺激可导致丘脑-扣带回通路产生长时程抑制。本研究探讨了直流电刺激对丘脑-扣带回突触可塑性及急性类癫痫样活动的影响。当前实验流程可用于测试包括方向、电场强度和刺激持续时间在内的最佳刺激参数 体外 小鼠模型。此外，该方法能够在细胞和网络水平上评估双环醇（DCS）对皮层类癫痫样活动的影响。

引言

癫痫是一种常见的神经系统疾病。30%的癫痫患者会出现耐药性发作。1经颅直流电刺激（tDCS）提供了一种非侵入性方法，用于调控大范围脑区的网络活动，例如癫痫发作。临床研究显示，tDCS 可有效治疗难治性癫痫发作2 并且能够对癫痫发作产生短期和长期的抑制作用3-5然而，tDCS作用的治疗机制仍不明确。所呈现的脑切片模型是一种 体外 研究tDCS治疗机制如何改变类癫痫脑活动症状的方法。因此，为了达到最佳治疗效果，需要在实验模型中测试特定的刺激参数，包括电场方向、场强和刺激持续时间。既往研究表明，电场方向对于获得治疗效果至关重要。6因此，测试并调整电极相对于被测脑片位置的方向是可行的。

额叶癫痫和前扣带皮层（ACC）发作常表现为药物难治性7,8。一些研究已报道了经颅直流电刺激（tDCS）在扣带皮层中的应用9-11。研究表明，tDCS 通过调节前扣带皮层的活动，可影响警觉性、决策能力和情绪，并能调节该脑区的神经元兴奋性和癫痫样放电活动12。因此，tDCS 对前扣带皮层发作的抑制作用可能有助于临床治疗及替代疗法的评估。

本实验方案描述了在记录室中为脑片的直流刺激（DCS）准备电极的方法，以及该方法对使用多电极阵列（MEA）记录类癫痫样活动的影响。

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方案

涉及动物受试者的实验程序已获得中国台湾台北市中央研究院动物实验管理与使用委员会的批准。

1. 多电极阵列记录实验溶液与设备的准备

  1. 制备人工脑脊液（aCSF；124 mM NaCl、4.4 mM KCl、1 mM NaH2PO3、2 mM MgSO4、2 mM CaCl2、25 mM NaHCO3 和 10 mM 葡萄糖），用 95% O2 和 5% CO2 混合气体持续通气平衡。
  2. 使用两种类型的多电极阵列（MEA）探针：6 × 10 平面 MEA 和 8 × 8 MEA。前一种探针覆盖包含皮层、纹状体和丘脑的区域，后一种探针仅覆盖皮层区域。
  3. 使用具有 0.1 Hz 至 3 kHz 带通滤波器（增益设为 1,200 倍）的 60 通道放大器，以 10 kHz 的采样率采集数据。
  4. 在 MEA 腔室内放置两根镀有 AgCl 的银丝用于直流刺激（DCS）。使用这些镀 AgCl 的银丝，通过隔离式刺激器产生电场。
  5. 放置一根钨电极（直径 127 µm，长度 7.62 cm，8° 交流锥形尖端，阻抗 5 MΩ）用于丘脑刺激，并将参考电极置于 MEA 腔室内。通过由脉冲发生器控制的隔离式刺激器输送钨电极的刺激电流。

2. 脑切片制备

  1. 使用4-8周龄的雄性C57BL/6J小鼠。将动物饲养在空调房间内（21-23 °C；50%湿度；12小时光照/12小时黑暗循环，光照时间为上午8:00），自由摄食和饮水。
  2. 取步骤1.1中配制的250 ml aCSF，置于盛有冰的烧杯中。同时持续通入由95% O2 和5% CO2 组成的混合气体。
  3. 手术
    1. 在玻璃罩内使用4%异氟烷对动物进行麻醉，时间约为3分钟。当动物达到手术深度麻醉状态（表现为对足趾夹捏无反应）时，将其置于装有碎冰的浅盘上，用剪刀去除头部。
    2. 暴露颅骨，并剪除残留的肌肉组织。接着使用咬骨钳剥离脑部背侧的颅骨，再用咬骨钳修剪颅骨两侧。所有手术器械均需用75%乙醇溶液消毒。
    3. 使用解剖刀沿脑腹侧切断嗅球及神经连接，取出脑组织。断头后迅速将脑组织转移至盛有冰冻含氧aCSF的烧杯中。
  4. 内侧丘脑（MT）-前扣带皮层（ACC）脑切片的制备
    注意：制备包含从MT到ACC通路的切片13。
    1. 使用刀片手工对脑组织块进行切割，在每侧半球中线外侧2.0 mm处做两个矢状切面，以暴露皮层下解剖结构。然后进行两个斜向切面：第一个横切面与纹状体中可见的纤维束平行。
    2. 第二个横切面从小脑与视觉皮层的连接处延伸至前连合与视束之间中点，该切面位于丘脑-扣带回通路的腹侧并与其平行。
    3. 使用氰基丙烯酸盐胶水将脑组织块固定在角度板（约120°）上，在通路转折点稍上方进行一次切割。展开角度板并将其展平，然后粘附到振动切片机的切片室载物台上。
    4. 制备500 µm厚的内侧丘脑-ACC脑切片，随后将其浸入冰冻含氧aCSF中。将切片转移至记录室，在持续灌流（12 ml/min）含氧aCSF的条件下，于32 °C孵育1小时。

3. 多电极阵列记录用灌流室的制备

  1. 灌流室的准备
    1. 将MEA探针放置在多通道系统上，并使用两条独立的聚乙烯管将探针连接至蠕动泵。其中一条管用于将aCSF导入MEA室，另一条管用于将aCSF导出。最后，以温热（29–30 °C）且充氧的aCSF持续灌流样本（8 ml/min）。
  2. 将脑切片转移至MEA。使用湿润的棉签固定脑切片，并小心移动切片，确保前扣带皮层（ACC）位于电极上方。
  3. 使用切片固定套件和压片装置压紧脑切片，以确保切片与电极之间形成良好的电接触。

4. 通过直流电刺激产生电场

注意：电场方向的定义基于前扣带皮层（ACC）中轴突-树突轴的方向。树突和胞体区室的方向通过高尔基染色法确认12。

  1. 将 AgCl 电极（定义为阳极）放置在靠近 ACC 的位置，并将另一电极（定义为阴极）放置在远离 ACC 的位置。通过 MEA 记录由两种电场方向（平行于和垂直于 ACC 轴突-树突纤维）产生的场强，并使用刺激器施加电场电流。
  2. 固定 AgCl 电极之间的距离（约 1.5–2 cm），并调节刺激器的电流强度，使直流电刺激（DCS）电流在 0.5 至 2 mA 之间。

5. 电刺激诱导的皮层突触反应

注意：通过在 MT 区施加电刺激来诱导 ACC 的突触反应，其中可编程电刺激发生器产生矩形双相电流脉冲。

  1. 重复上述第3节操作。
  2. 将钨电极置于丘脑（MT），通过双极钨电极向脑片的丘脑区域传递刺激器发出的脉冲。
  3. 使用不同强度的电流确定引发前扣带皮层（ACC）反应的阈值。此处采用±150 µA的电流强度和200 µsec的持续时间，该参数在大多数脑片中可引发ACC约80%的最大反应。
  4. 在MT-ACC脑片的丘脑-扣带回通路（从MT至胼胝体）上移动钨电极，以获得最佳的反应图谱。
  5. 记录10–20次ACC反应的扫描数据，并使用软件自动平均所有由MT刺激诱发的ACC反应。结果即为通过MT-ACC通路刺激诱发的ACC突触反应。

6. 电刺激诱导的类癫痫发作活动

注意：通过应用4-氨基吡啶（4-AP；250 µM）和荷包牡丹碱（5 µM）诱导产生类似癫痫发作的活动。既往的时间对照研究表明，给药后2-3小时出现最大且稳定的反应14。

  1. 重复上述第5节操作。
  2. 向灌流液中加入药物，使用4-AP（250 µM）和荷包牡丹碱（bicuculline，5 µM）。将药物充分混匀后，继续灌流2–3小时。
  3. 为促进类似癫痫样活动的产生，保持灌流泵在相对较快的流速（8 ml/min），这也有助于防止pH梯度的形成。
  4. 将钨电极置于MT区域，并施加电刺激（150 µA，持续时间200 µsec），以获取前扣带回（ACC）的反应特征。
  5. 进行10–20次扫描，对所得反应进行平均处理。
  6. 用新鲜的aCSF更换灌流液，以洗脱药物。重复步骤6.5。

7. 测试 DCS 对诱发电皮层反应的影响

  1. 重复第3和第4节操作。确保通过置于MEA室内的两根平行的AgCl镀银导线之间传递电流，以产生均匀电场。若无异常，直流电刺激（DCS）电流应维持在0.5至2 mA之间。
  2. 关闭直流电刺激（DCS），使用钨电极刺激丘脑（±150 µA，持续时间200 µsec）。为获得前扣带皮层（ACC）的最大突触反应，进行10-20次扫描并取反应的平均值。
  3. 同时开启直流电刺激（DCS强度为2 mV/mm）和丘脑刺激（350 µA，持续时间200 µsec）。评估在直流电刺激期间，丘脑刺激诱发的ACC反应幅度的变化。
  4. 关闭直流电刺激（DCS），并向灌流液中加入4-AP（250 µM）和荷包牡丹碱（bicuculline，5 µM）。随后等待2-3小时。当药物作用于脑片时，脑片将产生皮层癫痫样放电反应。
  5. 记录10-20次ACC反应，测量电刺激诱发的皮层癫痫样放电反应的幅度和持续时间。
  6. 在步骤7.5之后，同时开启直流电刺激（DCS强度为2 mV/mm）和丘脑刺激（150 µA，持续时间200 µsec）。评估在应用直流电刺激期间，诱发的皮层癫痫样放电反应的幅度和持续时间的变化。
  7. 更换为新鲜的aCSF灌流液，以洗脱药物，并重复步骤7.2和7.3。
  8. 收集所有记录数据，并按不同实验条件分组。评估在不同实验条件下皮层癫痫样放电反应的幅度和持续时间。

8. 数据分析

  1. 使用软件（例如，MC Rack 软件）自动平均记录的反应，并将原始数据导出至电子表格。分析原始数据的幅度和持续时间，并生成彩色图示。
  2. 为检测振荡性癫痫样放电事件，使用软件测量基线值和标准差（SD）。将噪声水平的 3 倍标准差设为阈值。振荡事件中超过该阈值的峰幅度将被软件自动识别。
  3. 采用 Student's t-检验进行统计分析。
  4. 在文本中以均值 ± 标准误（mean ± SE）表示测量值和单因素方差分析（ANOVA）结果，其中 n 表示所研究的脑片数量12。

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结果

丘脑扣带回脑片制备及多电极阵列记录系统搭建

小鼠的MT-ACC脑片是一种特殊的脑片制备方法，可用于研究丘脑-扣带回通路的电生理特性。图1A展示了MT-ACC脑片的制备过程。迅速取出小鼠脑组织并置于冰冷的含氧人工脑脊液（aCSF）中（图1A, a, b）。为暴露皮层下结构，将每侧半球从正中线向外侧切割2.0 mm，以获取矢状位脑组织块（图1A, c, d）。在脑组织块上进行两次斜向腹侧切割，以保留丘脑-扣带回通路。第一次横切位于脑组织块前部，与纹状体中可见的纤维束平行；第二次横切从脑组织块后部开始，起始于小脑与视觉皮层之间的连接处，终止于前连合与视束中点之间。完成切割后，将脑组织块粘附于一个呈120°角的塑料切片板上，并在背侧直接穿过皮层进行一次切削（图1A, e-g）。随后将带有脑组织块的切片板固定于振动切片机中，并浸...

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讨论

在本研究中，测试了直流电刺激（DCS）的持续时间和方向对前扣带皮层（ACC）类似癫痫样活动的影响。为了在小鼠脑片中获得稳定的数据，保持内侧丘脑-前扣带皮层（MT-ACC）通路的完整性并避免其受损是关键，尤其是在进行两次倾斜的腹侧切割和一次皮层背侧切割的步骤中。此外，制备脑片所需的时间也可能影响脑片的活性，应尽可能缩短该时间以保持脑组织的新鲜和活力。先前的研究表明，目标组织可能发生电化学损伤 体内 制备15。一个 体外 脑切片制备可用于 避免此问题。在一种 体外 制备过程中，组织不直接接触电极，从而最大限度地减少电化学效应16将DCS的效果与不同方向放置的电极进行了比较。当电极方向分别为90°和270°时，DCS对诱发电活动无影响（图3因此，该对照实验排除了电化学反应对DCS产生副作用从而损伤组织的可能性。脑片的保护性复苏方法是另一个关键；本研究中的aCSF配方为保护性切片方法提供了一种替代方案，对保存4至8周龄动物脑片中的神经元具有高度有效性。该方法并不适用于所有年龄段的动物。 Tris...

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披露

作者声明不存在任何竞争利益。

致谢

我们感谢中国台湾中央研究院神经回路电生理学核心提供的技术支持。本研究得到了国家科学委员会（102-2320-B-001-026-MY3 和 100-2311-B-001-003-MY3）以及中央研究院神经科学计划的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>麻醉剂：
异氟烷Halocarbon Products Corporation NDC 12164-002-254%
<强>名称<强>公司<强>货号<强>评论
<强>aCSF（总量：1 L）：
D(+)-葡萄糖默克1.08337.100010 mM
碳酸氢钠MERCK1.06329.050025 mM
氯化钠MERCK1.06404.1000124 mM
(+)-L-抗坏血酸钠 >=98%SIGMAA4034-100G0.15 g/2 c.c
硫酸镁，无水，ReagentPlusSIGMAM7506-500G2 mM
二水合氯化钙默克1.02382.10002 mM
磷酸二氢钠一水合物MERCK1.06346.10001 mM
氯化钾五月 & Baker LTD，达格南，英格兰MS 76164.4 mM
<强>名称<强>公司<强>货号<强>评论
<强>药物：
(+)-荷包牡丹碱TOCRIS01305 µM 在 aCSF 中
4-氨基吡啶TOCRIS0940250 µM 在 aCSF 中
<强>名称<强>公司<强>货号<强>评论
<强>脑切片制备：
振动切片机振动切片机系列 1000将组织块切成500微米厚片 µm 厚切片
<强>名称<强>公司<强>货号<强>评论
<强>MEA系统：
多电极阵列（MEA）探针：6 × 10 平面 MEAMulti Channel Systems60MEA500/30iR-Ti-pr MEAS 6×10电极直径，30 µ米；电极间距，500 µ米；阻抗，50 千欧Ω 在 200 Hz 时
多电极阵列（MEA）探针：8 × 8 MEA Ayanda Biosystems60MEA200/10iR-Ti-pr MEAS 8x8锥形电极；直径，40 µ米；针尖高度，50 µ米；电极间距，200 µ米；阻抗，1,000 千欧姆Ω 在 200 Hz 时
使用60通道放大器，带通滤波器设置为0.1 Hz至3 kHz，放大倍数为1,200倍。多通道系统MEA-1060-BC
MC Rack 软件以 10 KHz 采样率多通道系统用于数据采集和记录的软件
脉冲发生器的控制多通道系统STG 1002
切片固定套件和压紧装置华纳仪器SHD-26H/10；WI64-0250
蠕动泵-minipuls3GilsomMINIPULS3灌注速率：8 ml/min
<强>名称<强>公司<强>货号<强>评论
<强>刺激系统：
独立刺激器A-M SystemsModel 2100强度 ±350 μA，持续时间为200 μ秒
钨电极A-M Systems575300置于丘脑

参考文献

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