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方法文章

表征线虫胚胎伸长的新指标 秀丽隐杆线虫

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DOI：

10.3791/53712

⸱

2016年3月28日

 ,  , 
1Department of Chemistry, Pharmaqam, Université du Québec à Montréal

本文内容

摘要

本文详细描述了专门用于监测线虫秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）胚胎伸长早期和晚期阶段发生的形态发生缺陷的实验方案。这些方案最终旨在鉴定调控这些阶段的基因，并表征其在胚胎前后轴线上差异性的功能需求。

摘要

解析在胚胎发育过程中调控形态发生过程改变的信号通路，需要可靠且敏感的测量指标。线虫Caenorhabditis elegans的胚胎伸长是发育后期的一个阶段，表现为胚胎沿其纵轴伸长。该发育阶段由表皮细胞与下方体壁肌肉之间的细胞间通讯所调控。这些信号机制通过重塑细胞骨架和细胞间连接结构来控制表皮细胞的形态。胚胎致死率、幼虫阶段的发育停滞，以及表皮细胞和肌肉细胞中细胞骨架和细胞间黏附结构的改变，是过去25年多来用于解析这些信号通路的经典表型。近期研究需要开发新的测量指标，专门针对胚胎伸长的早期或晚期阶段，并沿胚胎的前后轴对形态发生缺陷进行表征。本文提供了详细的实验方案，可用于精确测量伸长中胚胎的长度和宽度，以及同步化幼虫的长度。这些方法是识别调控伸长相关基因的有力工具，可用于评估这些基因是否同时调控该阶段的早期和晚期过程，以及其在胚胎前后轴上是否均匀发挥作用。

引言

近50年来，线虫 秀丽隐杆线虫 已成为研究发育、神经生物学、进化、宿主-病原体相互作用等重要科学问题的有力模型， 等等。1 该模型在发育研究中的优势在于：其生命周期短至3天；动物遗传操作简便；通体透明，便于在活体动物中观察细胞迁移与形态变化；且其发育主要在体外进行。线虫的发育阶段包括胚胎期及四个幼虫期（L1至L4），随后进入成虫期。在胚胎发育过程中，表皮形态发生备受关注，因其有助于深入理解上皮细胞如何以群体形式迁移、如何重组细胞连接、如何改变个体形态以及在功能性上皮中的相对位置。表皮形态发生可分为四个阶段：背侧嵌合，即背侧表皮细胞（亦称角质层下细胞）的重排；腹侧封闭，即腹侧角质层下细胞向腹侧中线迁移，从而将胚胎包裹为单层上皮细胞；早期与晚期伸长，将豆状胚胎转变为蠕虫形幼虫。形态发生完成后，胚胎孵化，L1幼虫开始摄食周围环境中的可利用细菌。

因此，胚胎伸长是胚胎发育的一个晚期阶段，其过程包括胚胎沿纵轴延伸以及横径缩小。这一过程涉及下皮细胞形态的显著改变。胚胎伸长分为早期和晚期两个阶段。早期阶段始于逗号期，结束于体壁肌肉开始收缩的1.75倍体长阶段（wild-type（wt）胚胎），即胚胎长度达到未伸长胚胎长度的1.75倍时。此阶段发生的形态发生过程主要由位于下皮细胞顶极的肌动蛋白丝束（FBs）收缩所驱动，促使细胞沿胚胎的前后轴方向伸长2。FBs的收缩受三种激酶LET-502/ROCK、MRCK-1和PAK-1介导的肌球蛋白轻链磷酸化调控5。伸长的晚期阶段始于体壁肌肉具备功能并开始收缩时，涉及从体壁肌肉向背侧和腹侧下皮细胞传递的机械转导信号，直至动物孵化完成该过程3。

伸长缺陷通常以胚胎致死率（胚胎致死性；Emb）以及L1幼虫期发育停滞（幼虫停滞表型；Lva）且体长显著短于wt的个体所占百分比来表征。确定发育停滞的具体阶段需要在显微镜下观察死亡的胚胎和停滞发育的幼虫3-6。

最近研究表明，一些基因（如 Cdc42/Rac 调控因子和效应因子 pix-1 和 pak-1）在胚胎早期和晚期伸长过程中均调控形态发生过程3,7。我们最近还发现，在早期伸长阶段，胚胎沿前后轴的形态发生过程存在差异37。这些发现推动了专门针对早期或晚期伸长阶段的新指标的开发，同时也促进了其他指标的发展，以表征胚胎在早期伸长过程中沿前后轴的形态特征。

这些新方法包括测量胚胎在早期伸长阶段开始和结束时的长度，以及其头部和尾部的宽度。7 此外，还开发了两种用于测量新孵化的、处于L1期同步化幼虫长度的实验方案。7

胚胎的卵壳可保护其免受碱性次氯酸盐处理的影响，而培养基中存在的幼虫、成虫和细菌则会被该处理溶解。该方法随后用于从非同步化群体中纯化胚胎，这些群体主要包含充分喂养的成虫8。通过食物限制可使新孵化的幼虫达到同步化。随后通过测量这些幼虫的体长来检测伸长缺陷。该测量方法优于在培养板上测量停滞幼虫的体长，因为从未完全伸长的胚胎中孵化出的幼虫在有食物供给时可恢复至"正常长度"，但在缺乏食物导致发育停滞时则会保持较小的体型。

本文介绍了利用延时微分干涉差（DIC）显微镜和图像分析技术测量伸长中胚胎的体长及其头部和尾部宽度的详细实验方案（方案1）。此外，我们还提供了利用图像分析（方案2）和流式细胞术（方案3）测量同步化幼虫体长的详细实验方案。

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方案

1. 早期延伸缺陷的表征 野生型 和突变动物

  1. 用于微分干涉相差显微镜观察的胚胎固定
    1. 准备以下培养基和材料：
      1. M9缓冲液：将12.8 g/L Na2HPO4•7H2O、3 g/L KH2PO4、5 g/L NaCl、0.25 g/L MgSO4•7H2O溶于蒸馏水中，高压灭菌以灭菌。
      2. NGM平板：将3 g/L NaCl、16 g/L琼脂、2.5 g/L蛋白胨溶于ddH2O中，高压灭菌后加入1 mM MgSO4、1 mM CaCl2、1 mM磷酸盐缓冲液和5 µg/ml胆固醇。每60 mm培养皿倒入6 ml NGM。室温下静置24小时使培养基凝固。加入数滴在LB液体培养基中培养的饱和E. coli OP50菌液。让细菌生长48小时 ，然后将平板储存在4 °C。
      3. 制作线虫挑取针：将直径为0.01"的铂丝固定在短巴斯德吸管上。用本生灯加热玻璃吸管末端，将铂丝牢固地固定在末端。将铂丝末端压平，形成类似小铲的形状。
    2. 在60 mm NGM平板上于20 °C培养线虫品系。
      注：温度敏感型等位基因可能需要在高达25.5 °C的非许可温度下培养动物。平板上应含有大量年轻成虫，并保留充足食物，以便继续进行后续操作。
    3. 将一张载玻片置于两张覆盖有两层遮蔽胶带的间隔片之间（图1A）。
    4. 通过在微波炉中加热30秒，将0.6 g琼脂糖粉末溶于20 ml M9缓冲液中，制备3%（质量/体积）的琼脂糖溶液。让溶液冷却5分钟。
      注：琼脂糖溶液在微波炉熔化后可使用数天。也可分装后在4 °C保存数周。
    5. 在位于两片间隔片之间的载玻片上滴加一滴热的3%琼脂糖溶液。避免产生气泡。
    6. 迅速如图1B所示用另一张载玻片覆盖琼脂糖，并轻轻按压。上层载玻片会压平琼脂糖液滴，形成厚度相当于两层遮蔽胶带的垫层。
    7. 让琼脂糖在室温下凝固至少1分钟，或直至胚胎准备好转移至垫层上。
    8. 使用线虫挑取针，将20至30只喂养良好的年轻成虫从NGM平板转移至含有400 µl M9缓冲液的微量离心管中。
    9. 让线虫依靠重力沉降约5分钟，然后用移液器移除上清液。此步骤旨在尽可能去除随线虫挑取的细菌。
    10. 向每根试管中加入200 µl M9缓冲液。
    11. 使用巴斯德吸管将试管内容物（缓冲液和线虫）转移至表面皿中。
    12. 使用一根或两根25G 5/8"针头在身体中部（位于受精囊与阴门之间）切割线虫。
      注：也可使用手术刀片代替针头。此操作需在游动的线虫上进行，可能需要一定练习。根据使用的针头数量，可将针头用作剪刀或刀片。一旦线虫被切开，雌雄同体便会将胚胎释放到缓冲液中。
    13. 通过在液体中制造环形涡流，将胚胎集中至表面皿中心。
    14. 使用移液器从表面皿中移除大部分M9缓冲液，仅保留约30 µl M9与胚胎共存。
    15. 通过滑动方式移除覆盖琼脂糖垫层的载玻片（图1B）。
    16. 用剃刀片切割垫层，以便能用盖玻片完全覆盖（图1C）。
    17. 使用巴斯德吸管将所有胚胎（及线虫碎片）转移至琼脂糖垫层上。
    18. 使用粘附在200 µl移液器吸头末端的睫毛毛，将胚胎聚集在垫层中央。
    19. 缓慢放置盖玻片于垫层上，避免形成气泡并进行封片。
      注：可使用多种封片剂。我们使用美术用品店中常见的绘图胶（通常用于水彩画遮蔽）。该胶水具有亲水性，凝固速度适中，且对线虫无毒。也可使用指甲油或VALAP（凡士林、羊毛脂和石蜡的混合物）进行封片。
    20. 让绘图胶干燥约15分钟。
  2. 利用四维微分干涉相差显微镜记录早期伸长过程
    注：本步骤的目的是记录从逗号期到晚期伸长初期的早期伸长过程——晚期伸长初期定义为体壁肌肉开始收缩的时刻。我们还希望同时记录多个胚胎。通常需要8小时的连续记录，以覆盖一组非同步胚胎的早期伸长过程。
    1. 将固定好的载玻片放置在显微镜载物台上。确保显微镜配备10X和60X物镜、微分干涉（DIC）透镜、棱镜、相机及支持延时摄影和Z轴层扫（自动Z轴平台）的图像采集软件。
      注：确保显微镜室温度恒定在20至23 °C之间。尤其在使用温度敏感型突变体时，显微镜载物台可能需要配备加热-冷却装置。
    2. 使用10X物镜识别处于前形态发生阶段的一组胚胎。
    3. 定位后，移开10X物镜，并在载玻片上滴加一滴浸油。
    4. 使用60X物镜确定胚胎的顶部和底部，以设定Z轴层扫成像参数。
      注：Z轴层扫范围可略大于胚胎厚度。将相邻两层之间的距离设为0.8 µm，这样可在35至50个Z平面内覆盖胚胎的全部深度。
      注：若显微镜配备自动xy平台，可同时记录垫层上不同位置的多个胚胎。为此，记录实验过程中希望分析的每个位置的xy坐标。在设置记录参数时确保选择这些xy位置，并按指示继续后续操作。本方案中所述测量无需在记录期间对胚胎进行薄层Z轴切片。然而，以最高分辨率记录野生型（wt）和突变体动物的胚胎发育过程是良好实践，有助于建立支持进一步分析的影像资料库。
    5. 设置延时摄影参数，两次采集之间间隔2分钟，持续8小时。
      注：曝光时间取决于显微镜设定的光照强度。早期伸长期间细胞运动非常缓慢，曝光时间可约为每秒一帧或更短。若胚胎处于早期形态发生阶段（背侧嵌合、腹侧闭合），则早期伸长过程将在1小时内完成记录。确保每次采集之间关闭光源快门。
    6. 运行图像采集并保存数据。
  3. 利用图像分析测量早期伸长缺陷
    1. 打开Fiji-ImageJ软件（v1.48o – http://fiji.sc/Fiji）。
    2. 在菜单中选择“分析/设置测量”，勾选“周长”。对每个胚胎，调整Z轴标尺以聚焦于胚胎咽部，如图2A所示。这将确保聚焦于胚胎中心。
    3. 为测量胚胎长度，调整时间标尺，使目标胚胎处于早期伸长起始阶段（逗号期；图2A）。记录此时的时间（"起始时间"）。
    4. 选择分段线工具。沿胚胎中线，从胚胎口部顶端画至尾部顶端（图2A）。通过菜单“分析/测量”获取所画线段的长度（"起始长度"）。
    5. 对同一胚胎，在早期伸长结束时（肌肉开始收缩的时刻）重复上述测量。记录此时的时间（"结束时间"），并按上述方法测量胚胎长度（"结束长度"）（图2B）。
    6. 按下述方式计算早期伸长的持续时间（D）和此阶段的长度增加量（L）：
          D = "结束时间" - "起始时间"
          L = "结束长度" - "起始长度"
    7. 为测量头部宽度，调整时间标尺使胚胎处于目标阶段（1.2倍体长阶段或早期伸长结束）。选择直线工具，画出头部的横向（背腹轴）中线。该截面为胚胎最厚部分（图2C）。使用“分析/测量”菜单获取对应头部宽度的线段长度。
    8. 在同一时间点，通过画出尾部的横向中线（肠道瓣膜与尾部顶端之间的中线；图2C）重复此步骤，并测量以获得尾部宽度。
      注：使用此测量值比较不同表型间相同发育阶段的胚胎。为确保测量的可重复性，应选择动物尾部中线附近一个在不同个体间易于识别的位置。
    9. 为计算头尾宽度比，将头部宽度除以尾部宽度。

2. 利用图像分析表征转录延伸晚期缺陷

  1. 使用碱性次氯酸盐处理同步化L1幼虫
    1. 从一个含有大量成年雌雄同体且未饥饿的60 mm培养皿中，用巴斯德吸管加入1 ml M9缓冲液冲洗线虫，将所有线虫收集至微量离心管中。
    2. 在室温下以3,500 × g离心3分钟使线虫沉淀，并用移液器小心去除上清液，避免扰动虫体沉淀。
    3. 向每根离心管中加入1 ml次氯酸盐溶液（0.4 M次氯酸盐，0.5 M NaOH），振荡3分钟。
      注意：碱性次氯酸盐溶液应新鲜配制，且溶液中的胚胎需持续轻柔振荡，以优化成虫溶解和胚胎供氧。振荡3分钟后，大多数成虫应已将卵释放到溶液中。
    4. 在室温下以3,500 × g离心3分钟，迅速用移液器去除上清液，避免扰动沉淀。
    5. 用1 ml M9缓冲液洗涤四次，每次洗涤后均以3,500 × g离心3分钟。
    6. 第四次洗涤后，去除上清液，将卵重悬于700 µl M9缓冲液中，注意不要用移液器反复吹打卵（以免卵粘附在吸头塑料表面）。
    7. 将离心管固定在置于适当生长温度培养箱内的3 mm轨道摇床上，以600 rpm速度振荡过夜。
  2. 同步化幼虫体长测量
    1. 将停滞的L1幼虫在室温下以3,500 × g离心3分钟，去除上清液。将幼虫重悬于100 µl M9缓冲液中，用巴斯德吸管转移至琼脂糖垫上（琼脂糖垫的制备方法见第1.1.2至1.1.8节）。在垫上加盖盖玻片。
      注意：由于本实验仅需短时间成像，琼脂糖垫无需用封片胶密封。
    2. 若使用高分辨率相机，采用10倍物镜和相差照明观察幼虫体长。提高光照强度，以便在几毫秒内完成图像采集，从而获得清晰的幼虫图像（图2D）。
      注意：尽管琼脂糖垫可减少幼虫的游动，但其仍存在运动。因此，快速成像对于获取清晰图像至关重要。
    3. 打开Fiji-ImageJ软件，重复步骤1.3.1。为测量幼虫体长，选择“分段线”工具。沿幼虫中轴线，从头部顶端至尾部末端绘制一条分段线（图2D，右图）。
    4. 通过菜单“分析/测量”获取所绘线条的长度，即为幼虫体长（单位：微米）。

3. 使用流式细胞术表征转录延伸晚期缺陷

  1. 同步幼虫
    1. 使用碱性次氯酸盐处理法纯化胚胎，具体步骤如2.1节所述，从喂养充分的年轻成虫的完整100 mm培养皿中获取胚胎，让胚胎在M9缓冲液中孵化，并在20或25.5 °C下根据所分析的品系使L1幼虫停滞16至24小时。
      注意：每种品系取一整块培养皿的健康成虫即可满足下述分析所需。
  2. 线虫分选仪的校准
    注意：此处使用的流式细胞仪为大颗粒流式细胞仪（以下简称线虫分选仪）。该线虫分选仪配备一个位于消光检测器前方的670 nm红色二极管激光器，以及一个多谱线氩离子激光器用于荧光激发。标准仪器包含三个光电倍增管（PMT）荧光检测器，用于检测光谱中绿色、黄色和红色区域的荧光发射信号。在本方案中，飞行时间（TOF）将用于测量幼虫的大小，红色通道将用于识别经碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）染色的死亡线虫。实验中使用的通用高荧光控制微粒（GP High Fluorescence Control Particles）用于仪器校准及作为内部对照，其在绿色、黄色和红色通道均呈现强荧光信号。在样本分析中，仅有这些微粒在绿色通道检测到高强度荧光发射，因此将依据此特征对其进行识别。
    注意：活体动物根据绿色和红色通道以及飞行时间（TOF）中无荧光信号来识别。在L1阶段，幼虫肠道的自发荧光发射无法检测到。
    1. 打开激光模块、计算机、压缩机和蠕虫分选仪。按照仪器说明书中的指示，在打开的蠕虫分选软件界面上按下“START”按钮。
    2. 观察氩离子激光器控制弹出窗口。选择“运行”模式，并等待激光功率达到 10 ± 1 mW。在激光器控制窗口中选择“完成”。
    3. 将鞘液压力和样品压力分别设置为 5.10 ± 0.02 和 5.51 ± 0.01。保持压力平衡至少 15 分钟，然后点击“PRESSURE OK”复选框。
      注意：流速取决于鞘液压力和样品压力。
    4. 确保消除样本杯与分析室之间流路管道中的所有气泡。为此，请点击“ACQUIRE”，并轻轻弹击管道，直至采集窗口中不再显示气泡为止。
    5. 荧光和飞行时间检测的所有参数设置如下：
      1. 将TOF、Ext、Green、Yellow和Red的量程均设置为256。增益设置方法如下所述。 表1将绿色和黄色的PMT控制设为700，红色的设为900。
        注意：提供两种激发滤光片（488 nm 和 514 nm），可用于多线氩离子激光器在这些波长下激发绿色荧光蛋白（GFP）、黄色荧光蛋白（YFP）或任何在这些波长被激发的荧光染料。需将适当的滤光片插入设备的滤光片室中。本实验中我们使用了 488 nm 滤光片。
    6. 为校准线虫分选仪，请选择 "运行对照颗粒" 在工具菜单中。加入20 ml的1x 杯中的通用（GP）高荧光控制微粒（这些微粒为精确尺寸的荧光微粒，由流式细胞仪制造商出售，用于校准仪器）。
    7. 单击“采集”按钮以启动鞘液和样本流动。
      注意：预期对照颗粒分布的均值为 21 ± 6，该均值的变异系数（C.V.）≤11。如果 C.V. 超过此范围，则需检查实验操作及仪器性能。 >11，平均值为 >27 尝试通过多次点击清洁按钮或快速切换流道来清洗小管。
  3. 动物飞行时间数据采集
    注意：当物体在流动池中通过激光源与消光检测器之间时，光会发生散射。物体飞行过程中引起光散射所需的时间（飞行时间，TOF）用于测量物体的轴向长度。物体遮蔽光的程度（消光，EXT）用作其不透明度/光学密度的测量指标。
    1. 加入10 µl同步化的野生型（野生型（wt） 在表面皿中放置L1，使用解剖显微镜估计死卵的百分比。
      注意：表现出高 Emb（高于 20%）的同步化 L1 幼虫 野生型 不应将其用于进一步分析。
    2. 将同步化的L1从微量离心管（约700 µl含L1的M9）转移至15 ml锥形管中。加入碘化丙啶（PI），使其终浓度为10 µg/ml（1/100稀释）th 从1 mg/ml的储备液中加入并室温孵育30分钟。
      注意：死亡的卵和幼虫将通过PI染色，并在红光通道下显示为高荧光信号的物体。
    3. 加入10 ml M9缓冲液以稀释染色后的菌群。取5 ml稀释后的菌液，加入15 ml M9缓冲液进行4倍稀释。将该稀释液置于样品杯中。
    4. 点击“ACQUIRE”运行样品流，并观察流速。
      注意：为了获得准确的测量结果，流速应保持在每秒15至25个物体之间。
    5. 如有必要，调整杯中动物的数量以达到所需的流速。
      注意：流速取决于3.2.3节中所述的恒定压力（鞘液压力和样品压力）以及样品杯中幼虫的浓度。如果流速高于25个对象/秒，则向样品杯中添加缓冲液；如果流速低于15个对象/秒，则向样品杯中加入浓缩的L1幼虫（来自步骤3.3.3）。
    6. 当达到物体的适当浓度后，评估杯中的体积，并加入1/4th 高荧光GP对照颗粒4倍溶液的该体积。
    7. 调整门控和分选参数。为此，请在菜单中点击“Gating”，然后选择“TOF vs.”和“Green”。接着在菜单中点击“Sorting”，并选择“TOF vs.”和“Red”。随后将显示如图所示的门控和分选图形 图3A.
      注意：这将允许观察对照颗粒（绿色和红色通道发射荧光）、被碘化丙啶（PI）染色的死亡个体（仅在红色通道发射荧光，无绿色荧光）以及活体动物（绿色和红色通道均无荧光发射）图3A).
    8. 点击“采集”开始实验。
      注意：为了检测幼虫之间微小的尺寸差异，需分析约10,000个对象，即大约8,000只动物。点击“STORE”停止实验并将数据导出为.txt格式。
  4. 同步群体中活体动物相对大小的测量
    1. 使用能够处理大型数据表的软件打开 .txt 文件。
    2. 从分析对象中提取与对照颗粒相关的飞行时间（TOF）值，这些对照颗粒在绿色通道的发射信号高于100个任意单位（该数值取决于第3.2.5节中设置的参数）。新建一列并命名为“对照颗粒”。创建另一列，包含除对照颗粒外的所有其他对象，命名为“样本”。注意：在开始采集之前，需验证新批次颗粒的荧光发射特性。这将设定荧光阈值，从而实现对照颗粒与L1s的有效区分。
    3. 针对每种被分析的菌株，确定实验中流速发生变化的部分（例如由于存在卵团块所致）。操作方法如下：
      1. 将各样品的“对照颗粒”飞行时间（TOF）随时间作图图3B).
      2. 使用趋势线工具绘制线性趋势线，并在图表上显示方程。
        注意：对照颗粒的飞行时间（TOF）应随时间保持恒定（水平直线）， 图3B）。考虑到在数据上绘制的线性趋势线方程 y = ax + b，确保“a”值小于10-4所有在控制粒子排列出现断裂的时间段内测得的数据均应从分析中剔除。
    4. 移除“样本”测量中的死亡胚胎和气泡（红色信号强度高于15）、小碎片以及大卵块（飞行时间分别低于10和高于70）。
    5. 绘制所分析各菌株的“对照颗粒”分布图。如图所示， 图3C 这些分布应几乎完全重叠，以确保不同菌株获得的飞行时间（TOF）测量结果具有可比性。注意：如果样品中对照颗粒的分布与对照样品的分布不重叠，可采用将样品中各组分的TOF相对于对照颗粒进行归一化处理。归一化TOF的计算方法如下：
      1. 将基因型G的飞行时间标准化 = （基因型G的样本飞行时间）/（基因型G的“对照颗粒”平均飞行时间）×（所有基因型“对照颗粒”平均飞行时间） 野生型）其中 野生型 是对照样品。
    6. 绘制每种品系（包括对照样本）的幼虫飞行时间分布图 野生型 动物（图3D）。测定每个群体的平均值及平均值的标准误（SEM）图 5A 和 B).

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结果

头部宽度、尾部宽度以及头尾宽度比是可靠的测量指标。

本文所述方案已成功用于表征Rho GTP酶调控因子和效应因子的功能 pix-1, pak-1 和 let-502 在早期延伸阶段7. pix-1 和 pak-1 分别编码Rac/Cdc42 GTP酶的鸟嘌呤交换因子（GEF）和特异性效应因子 let-502 编码 RHO-1 的效应因子 7在本研究中，pix-1 和 pak-1 在早期伸长过程中被证明可调控表...

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讨论

本方案描述了用于表征胚胎伸长早期和晚期阶段的新颖指标。

在第1部分中，关键步骤是垫片上可能存在细菌。在图像采集过程中，胚胎被密封在垫片和盖玻片之间。由于采集时间超过两小时，封片是必要的，以防止样本脱水。据我们所知，目前用于将琼脂糖垫片固定在载玻片与盖玻片之间的封片剂均不具备透气性。因此，当垫片上存在大量细菌（或胚胎）时，经过数小时后可能导致缺氧，进而引起胚胎过早死亡。在观察目标胚胎的同时，记录三倍长胚胎（即长度为未伸长胚胎三倍的胚胎）的活动情况，可作为判断是否存在缺氧条件的良好指标，因为在缺氧情况下，这些胚胎会在卵壳内停止运动。切勿在缺氧条件下或对已死亡胚胎进行任何形态学测量。

使用延时成像技术时另一个关键步骤是胚胎发育所处的温度。C. elegans 目前使用温度敏感型突变体。温度变化的生物学效应可能是即时的，也可能是延迟的，具体取决于蛋白质的半衰期及其所携带突变的性质。因此，胚胎所处的温度应在时间上保持恒定，并通过显微镜室的适当通风或显微镜载物台上的加热-冷却装置进行精确控制。

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本研究工作得到了加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）和加拿大创新基金会的资助。感谢加拿大卡尔加里大学的 Paul Mains 博士提供 let-502(sb118ts) 菌株。部分菌株由线虫遗传学中心（Caenorhabditis Genetics Center）提供，该中心由美国国立卫生研究院研究基础设施项目办公室资助（P40 OD010440）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
琼脂 BioShopAGR001.500
琼脂糖BioshopAGA001.500
CaCl2（氯化钙）Bio Basic Inc.CT1330
胆固醇Sigma-aldrichC8667
清洗液 union Biometrica300-5072-000
玻璃盖玻片Fisherbrand12-542B
载玻片Fisherbrand12-552-3
高荧光对照颗粒union Biometrica310-5071-001
K2HPO4（磷酸氢二钾）Bio Basic Inc.PB0447
K2HPO4（磷酸二氢钾）Bio Basic Inc.PB0445
MgSO4（硫酸镁）Sigma-aldrich230391
Na2HPO4（磷酸氢二钠）Bio Basic Inc.SDB0487
NaCl（氯化钠）Bio Basic Inc.DB0483
Pebeo 绘图胶 45 mlpébéoPDG033000任意美术/手工用品商店
蛋白胨BioShopPEP403.500
鞘液缓冲液union Biometrica300-5070-100
COPAS Biosortunion Biometrica

参考文献

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