表征线虫胚胎伸长的新指标 秀丽隐杆线虫

摘要

本文详细描述了专门用于监测线虫秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）胚胎伸长早期和晚期阶段发生的形态发生缺陷的实验方案。这些方案最终旨在鉴定调控这些阶段的基因，并表征其在胚胎前后轴线上差异性的功能需求。

摘要

解析在胚胎发育过程中调控形态发生过程改变的信号通路，需要可靠且敏感的测量指标。线虫Caenorhabditis elegans的胚胎伸长是发育后期的一个阶段，表现为胚胎沿其纵轴伸长。该发育阶段由表皮细胞与下方体壁肌肉之间的细胞间通讯所调控。这些信号机制通过重塑细胞骨架和细胞间连接结构来控制表皮细胞的形态。胚胎致死率、幼虫阶段的发育停滞，以及表皮细胞和肌肉细胞中细胞骨架和细胞间黏附结构的改变，是过去25年多来用于解析这些信号通路的经典表型。近期研究需要开发新的测量指标，专门针对胚胎伸长的早期或晚期阶段，并沿胚胎的前后轴对形态发生缺陷进行表征。本文提供了详细的实验方案，可用于精确测量伸长中胚胎的长度和宽度，以及同步化幼虫的长度。这些方法是识别调控伸长相关基因的有力工具，可用于评估这些基因是否同时调控该阶段的早期和晚期过程，以及其在胚胎前后轴上是否均匀发挥作用。

引言

近50年来，线虫 秀丽隐杆线虫 已成为研究发育、神经生物学、进化、宿主-病原体相互作用等重要科学问题的有力模型， 等等。¹ 该模型在发育研究中的优势在于：其生命周期短至3天；动物遗传操作简便；通体透明，便于在活体动物中观察细胞迁移与形态变化；且其发育主要在体外进行。线虫的发育阶段包括胚胎期及四个幼虫期（L1至L4），随后进入成虫期。在胚胎发育过程中，表皮形态发生备受关注，因其有助于深入理解上皮细胞如何以群体形式迁移、如何重组细胞连接、如何改变个体形态以及在功能性上皮中的相对位置。表皮形态发生可分为四个阶段：背侧嵌合，即背侧表皮细胞（亦称角质层下细胞）的重排；腹侧封闭，即腹侧角质层下细胞向腹侧中线迁移，从而将胚胎包裹为单层上皮细胞；早期与晚期伸长，将豆状胚胎转变为蠕虫形幼虫。形态发生完成后，胚胎孵化，L1幼虫开始摄食周围环境中的可利用细菌。

因此，胚胎伸长是胚胎发育的一个晚期阶段，其过程包括胚胎沿纵轴延伸以及横径缩小。这一过程涉及下皮细胞形态的显著改变。胚胎伸长分为早期和晚期两个阶段。早期阶段始于逗号期，结束于体壁肌肉开始收缩的1.75倍体长阶段（wild-type（wt）胚胎），即胚胎长度达到未伸长胚胎长度的1.75倍时。此阶段发生的形态发生过程主要由位于下皮细胞顶极的肌动蛋白丝束（FBs）收缩所驱动，促使细胞沿胚胎的前后轴方向伸长²。FBs的收缩受三种激酶LE....

方案

1. 早期延伸缺陷的表征 野生型 和突变动物

1. 用于微分干涉相差显微镜观察的胚胎固定
   1. 准备以下培养基和材料：
      1. M9缓冲液：将12.8 g/L Na₂HPO₄•7H₂O、3 g/L KH₂PO₄、5 g/L NaCl、0.25 g/L MgSO₄•7H₂O溶于蒸馏水中，高压灭菌以灭菌。
      2. NGM平板：将3 g/L NaCl、16 g/L琼脂、2.5 g/L蛋白胨溶于ddH₂O中，高压灭菌后加入1 mM MgSO₄、1 mM CaCl₂、1 mM磷酸盐缓冲液和5 µg/ml胆固醇。每60 mm培养皿倒入6 ml NGM。室温下静置24小时使培养基凝固。加入数滴在LB液体培养基中培养的饱和E. coli OP50菌液。让细菌生长48小时 ，然后将平板储存在4 °C。
      3. 制作线虫挑取针：将直径为0.01"的铂丝固定在短巴斯德吸管上。用本生灯加热玻璃吸管末端，将铂丝牢固地固定在末端。将铂丝末端压平，形成类似小铲的形状。
   2. 在60 mm NGM平板上于20 °C培养线虫品系....

结果

头部宽度、尾部宽度以及头尾宽度比是可靠的测量指标。

本文所述方案已成功用于表征Rho GTP酶调控因子和效应因子的功能 pix-1, pak-1 和 let-502 在早期延伸阶段⁷. pix-1 和 pak-1 分别编码Rac/Cdc42 GTP酶的鸟嘌呤交换因子（GEF）和特异性效应因子 let-502 编码 RHO-1 的效应因子 ⁷在本研究中，pix-1 和 pak-1 在早期伸长过程中被证明可调控表.......

讨论

本方案描述了用于表征胚胎伸长早期和晚期阶段的新颖指标。

在第1部分中，关键步骤是垫片上可能存在细菌。在图像采集过程中，胚胎被密封在垫片和盖玻片之间。由于采集时间超过两小时，封片是必要的，以防止样本脱水。据我们所知，目前用于将琼脂糖垫片固定在载玻片与盖玻片之间的封片剂均不具备透气性。因此，当垫片上存在大量细菌（或胚胎）时，经过数小时后可能导致缺氧，进而引起胚胎过早死亡。在观察目标胚胎的同时，记录三倍长胚胎（即长度为未伸长胚胎三倍的胚胎）的活动情况，可作为判断是否存在缺氧条件的良好指标，因为在缺氧情况下，这些胚胎会在卵壳内停止运动。切勿在缺氧条件下或对已死亡胚胎进行任何形态学测量。

使用延时成像技术时另一个关键步骤是胚胎发育所处的温度。C. elegans 目前使用温度敏感型突变体。温度变化的生物学效应可能是即时的，也可能是延迟的，具体取决于蛋白质的半衰期及其所携带突变的性质。因此，胚胎所处的温度应在时间上保持恒定，并通过显微镜室的适当通风或显微镜载物台上的加热-冷却装置进行精确控制。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂	BioShop	AGR001.500
琼脂糖	Bioshop	AGA001.500
CaCl2（氯化钙）	Bio Basic Inc.	CT1330
胆固醇	Sigma-aldrich	C8667
清洗液	union Biometrica	300-5072-000
玻璃盖玻片	Fisherbrand	12-542B
载玻片	Fisherbrand	12-552-3
高荧光对照颗粒	union Biometrica	310-5071-001
K2HPO4（磷酸氢二钾）	Bio Basic Inc.	PB0447
K2HPO4（磷酸二氢钾）	Bio Basic Inc.	PB0445
MgSO4（硫酸镁）	Sigma-aldrich	230391
Na2HPO4（磷酸氢二钠）	Bio Basic Inc.	SDB0487
NaCl（氯化钠）	Bio Basic Inc.	DB0483
Pebeo 绘图胶 45 ml	pébéo	PDG033000	任意美术/手工用品商店
蛋白胨	BioShop	PEP403.500
鞘液缓冲液	union Biometrica	300-5070-100
COPAS Biosort	union Biometrica