用于刺激载细胞水凝胶中细胞行为的梯度应变芯片

摘要

本文介绍了一种简单的方法，可在含细胞的同心水凝胶上施加非连续梯度静态应变，以调控组织工程中的细胞取向。

摘要

细胞排列的人工引导是组织工程领域的一个研究热点。以往大多数研究采用复杂的实验流程和大量控制系统，通过单轴应变诱导负载细胞的水凝胶中细胞的排列，但这些方法通常存在污染问题。因此，本文提出一种简单的方法，利用带有塑料PDMS盖层和紫外透明玻璃基底的微流控芯片，在三维水凝胶中构建梯度静态应变，以调控细胞行为。在微流控腔室内过量加载可光图案化的细胞预聚物，可在盖层上形成凸面曲率的PDMS膜。经过紫外交联后，结合曲面PDMS膜下方的同心圆微图案以及缓冲液清洗，在单个微流控芯片内即可自发建立一个用于研究多种梯度应变下细胞行为的微环境，无需依赖外部仪器。通过观察NIH3T3细胞在几何引导与应变刺激协同作用下的排列趋势变化（水凝胶上的应变范围为15–65%），验证了该方法的有效性。经过3天培养后发现，在低压缩应变条件下，水凝胶的几何形貌主导细胞排列方向；而在高压缩应变条件下，细胞沿水凝胶伸长方向排列。在这两种情况之间，由于水凝胶伸长方向的径向引导作用与图案化水凝胶的几何引导作用相互抵消，细胞呈现随机排列状态。

引言

水凝胶作为一种模拟天然微环境的块体材料，可含有细胞外基质（ECM），用于重建支持细胞生长的仿生组织支架。要实现组织功能，有序的细胞排列是基本要求。通过在具有微米或纳米结构的柔性基底上培养或包埋细胞，已在二维（即细胞在表面培养）和三维（即细胞包埋于水凝胶中）条件下实现了多种细胞排列方式¹。其中，微结构中的三维细胞排列更具吸引力，因其微环境更接近天然组织构造^2,3,4。实现三维细胞排列的一种常用方法是利用水凝胶形状提供的几何引导信号^2,3。由于细胞在短轴方向上的增殖空间受限，细胞倾向于沿微图案化水凝胶的长轴方向排列。另一种方法是对水凝胶施加拉伸应力，使细胞沿拉伸方向平行排列^4,5。

在细胞外基质水凝胶上施加生物物理刺激（如压缩应变或电场），可调节细胞功能，促进组织的适当整合、增殖和分化^1,

方案

1. GelMA 的合成

1. 称取10 g明胶粉末，加入含有100 mL杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）的玻璃烧瓶中。将磁力搅拌子放入烧瓶，并将烧瓶置于磁力搅拌加热板上。
2. 用铝箔覆盖烧瓶以防止水分蒸发。将加热板温度设定为50–60 °C，搅拌速度设为100 rpm，持续搅拌1小时，使明胶粉末充分溶解。
3. 明胶完全溶解后，使用移液器极其缓慢地（每秒一滴）加入8 mL甲基丙烯酸酐。在60 °C下反应3小时。
4. 向烧瓶中加入预热的DPBS（40 °C），调节终体积至500 mL，并继续搅拌15分钟，以充分混合并终止反应。
5. 同时，将透析膜（截留分子量14 kDa）剪成若干段，每段长25 cm。将其浸入去离子水（DI水）中15分钟，并打结封闭透析管的一端。
6. 将适量（30–60 mL）聚合物溶液装入透析管中，封闭另一端。将透析管放入盛有去离子水的5 L塑料烧杯中，透析一周。每天更换去离子水两次，并在透析过程中维持溶液温度在40–50 °C。
7. 将透析后的溶液从透析管中收集至500 mL玻璃瓶中。取约450–500 mL溶液加入500 mL滤杯（孔径0.22 µm），对滤杯施加真空压力，使溶液通过滤膜以实现无菌过滤。
8. 将无菌过滤后的聚合物溶液分装至多个50 mL无菌离心管中，于-80 °C超低温冰箱中保存3–5天。
9. 将-80 °C保存的聚合物使用冷冻干燥机冻干1周，得到GelM....

结果

为了比较完整梯度应变刺激芯片中每个圆形水凝胶的力学变化，我们测量了两个相同芯片中各圆形水凝胶的线宽，分别对应注射体积为 0 µL（图 4a）和 40 µL（图 4b）。各圆环处的伸长率通过将注射 40 µL 的芯片中的伸长量除以注射 0 µL 芯片中对应水凝胶的线宽计算得到（图 4c）。由于水凝胶为不可压缩材料，其垂直收缩应变将等于横向伸长应变。因此，在注射体积为 40 µL 的芯片中，伸长率显示为 15–65%，该值可转换为压缩应变（见补充文件 1）。

使用DAPI和鬼笔环肽分别对细胞核和F-肌动蛋白进行荧光染色，以分析细胞的排列情况。DAPI染色提供了细胞核取向的信息，而鬼笔环肽染色用于评估细胞铺展情况。

讨论

本文报道了一种简单的方法，用于比较细胞在水凝胶形状引导和拉伸作用后的排列行为。通过柔性聚二甲基硅氧烷（PDMS）膜形成穹顶状曲面，从而制备具有不同高度的同心环形水凝胶。释放压力后，PDMS膜会自动对微图案化水凝胶施加作用力，形成梯度应变/拉伸，其中中心处最大，外边界处最小。由于梯度应变的形成依赖于柔性PDMS膜和流体芯片的操作，因此有几个关键参数需要注意：（i）精确控制PDMS膜的厚度对于调节梯度应变值至关重要。若膜过厚，即使注入最大体积的细胞预聚物，也无法在PDMS膜中形成适当的凸面曲线，从而无法交联出具有梯度高度的载细胞水凝胶；相反，若PDMS膜过薄，则无法对水凝胶施加足够的力。请确保PDMS盖模中未固化PDMS的重量约为每芯片1.6–2.0 g。（ii）在流体芯片中处理载细胞水凝胶交联过程中，防止污染非常重要。在将芯片放入培养箱进行细胞培养前，用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）彻底冲洗流体通道，并用75%乙醇擦拭芯片表面，有助于避免污染问题。（iii）光引发剂的浓度和紫外光照射剂量应严格控制在约0.1%–2%范围内（推荐使用0.5%）。过度交联水凝胶或过量紫外照射会导致细胞活性降低。（iv）图案化水凝胶的线宽不宜过大，否则厚水凝胶中的营.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 黑色微量离心管	Argos Technologies	03-391-161	可用铝箔包裹的中性颜色 1.5 mL 离心管替代
10x DPBS	Sigma-Aldrich	56064C
Alexa Fluor 488 鬼笔环肽	Invitrogen	A12379
BSA	Sigma	A1595
钙黄绿素	Molecular Probe	C1430	用于标记活细胞
CCD	PCO. Imaging	Pixelfly qe
细胞膜通透溶液	Sigma-Aldrich	X100	含 0.5% Triton X-100，用于通透细胞膜
DAPI	Sigma-Aldrich	D8417	细胞核染色
透析膜	Sigma-Aldrich	D9527	截留分子量 = 14,000
DMEM	Gibco	11995-065
双面胶带	3M	8003
FBS	Hyclone	SH30071.03
明胶	Sigma-Aldrich	G2500	凝胶强度 300，A 型，来源于猪皮
高频电子电晕发生器	Electro-technic products	MODEL BD-20
甲基丙烯酸酐	Sigma-Aldrich	276685
微量注射器	Hamilton	80501	50 μL
显微镜	Olympus	IX71	配备两套滤光片：Semrock 公司的 LF405/LP-B-000 和 LF488/LP-C-000
氧气等离子体处理仪	Harrick plasma	PDC-001
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	P6148	用于细胞固定
PDMS	DOW CORNING	Sylgard 184	用于 PDMS 芯片浇铸成型的混合物
青霉素-链霉素溶液（Pen-Strep）	Gibco	10378-016	青霉素/链霉素
光引发剂	CIBA	Irgacure 2959
碘化丙啶	Sigma-Aldrich	P4170	用于标记死细胞
无菌过滤杯	Millipore	SCGPT05RE
TMSPMA	Sigma-Aldrich	440159	用于水凝胶固定化
超声波破碎仪	Delta	D150H	150W，43kHz
紫外灯	DAIHAN	WUV-L10
冷冻干燥机	FIRSTEK	150311025
NIH3T3（成纤维细胞）	食品工业发展研究所（FIRDI）	08C0011
MOXI Z Mini 自动细胞计数仪	ORFLO	MXZ001