本方案描述了一种高通量检测黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）单个个体产卵偏好行为的实验方法。该检测方法提供了一个简单、高效且可扩展的平台，可用于鉴定调控简单决策过程的基因及神经环路组分。
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摘要
摘要
最近，产卵偏好 果蝇 已成为研究简单决策过程神经基础的遗传学可操作模型。雌性果蝇在选择产卵地点时，能够评估不同选项的相对吸引力，并从中选择最优方案。 "两善择其大。" 然而，如果希望采用系统的遗传筛选方法来探究这种简单决策行为背后的神经环路基础，大多数产卵偏好实验并不实用，因为它们基于群体检测，且建立过程费时费力。为了提高对单个雌蝇产卵偏好研究的通量，我们开发了定制化实验腔室，每个腔室可同时检测多达三十只个体果蝇的产卵偏好，并建立了一套确保每只雌蝇具有高产卵率的实验方案（从而使它们的偏好更易辨别且结果更具说服力）。我们的方法操作简便，且结果高度一致。此外，这些腔室可配备不同的附件，以实现对产卵动物的视频记录，或用于光遗传学研究中的光照刺激。本文提供了这些腔室的制作蓝图以及用于检测的果蝇准备流程。
引言
Drosophila melanogaster 是研究行为神经基础的强有力遗传模式生物。针对神经元进行特异性操控的遗传工具迅速发展，加之复杂的行为分析工具不断涌现，极大提升了我们解析多种先天性与学习行为中感觉-运动转换过程背后神经环路机制的能力1-3。
果蝇 产卵是一种研究简单决策过程神经基础的合适模型。特别是 果蝇 雌性已被证明在“决定”将卵产于某一特定选项之前，具备比较和评估其可选方案的能力4-8例如，当仅提供不含蔗糖的普通基质或仅提供含蔗糖基质时，雌性果蝇均 readily 接受任一选项进行产卵。然而，在同时提供两种选择的情况下，雌性果蝇在某些情境下会强烈拒绝含蔗糖的基质7,9,10然而，关于雌性如何“在两种有利条件中选择较优者”的神经机制，目前所知甚少。一个主要障碍在于缺乏一种高效的方法来检测产卵偏好，从而难以采用系统的遗传筛选方法来研究这一问题。
在本报告中，我们描述了所开发的一种实验方案，该方案能够以单只动物为分辨率检测雌性个体的产卵偏好，并在通量和一致性方面显著优于以往的方法。具体而言，我们提供了所设计实验腔室的构建蓝图、用于准备雌性个体使其具备大量产卵能力的处理流程，以及使用这些腔室进行实验的操作步骤。
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方案
1. 准备受试果蝇
- 在25 °C、65%湿度的培养箱中，将果蝇培养于标准的糖蜜/玉米粉培养基上。注意避免培养瓶内果蝇过于密集。例如，可在一支窄口培养瓶中放入8只雌蝇和6只雄蝇。
注意：该 "窄口食物瓶" 此处使用的试管内径为2.3 cm。我们通常向每个试管中加入约10 ml的果蝇培养基。所用果蝇培养基的配方详见：http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/molassesfood.html。 - 雌性成虫羽化后2至3天，按图示准备装有新鲜酵母糊的试管 图1E将6 g活性酵母与10 ml 0.5%丙酸混合，新鲜配制酵母糊。用刮刀将酵母糊涂抹于食物小瓶的侧壁。将30–35只新羽化的雌蝇与20–25只雄蝇一同收集至小瓶中。
- 通常，从与雌性果蝇相同的培养瓶中收集雄性果蝇（以节省时间和劳力）。然而，若对雄性果蝇的生育力存在疑虑，则应使用野生型（WT）雄性果蝇。此外，酵母膏对促进产卵至关重要，因此需每日新鲜配制。
- 将收集的雌/雄蝇置于25 °C、65%湿度条件下饲养，除非果蝇对温度敏感。
- 大约 4 到 5 天后，检查样品管，观察雌蝇是否已准备好进行产卵实验。当培养基表面因幼虫在食物中活跃钻动而变湿时，表明雌蝇已准备好（参见 图1E - F).
注意：雌虫通常在食物表面变湿并爬满幼虫时停止产卵。此步骤可确保雌虫在接触到具有理想质地的基质时，能够准备充分并大量产卵例如，约1%琼脂糖）。
2. 腔室构建、组装与检测设置
- 请机械加工车间制作丙烯酸材质的产卵室（图1A - D）。不同部件的工程图纸见补充图1 - 3。高分辨率图片也可在此处获取（http://www.rebeccayang.org/pdf/chamber%20design.pdf）。
- 如图1C所示，将塑料片插入产卵室的加载（顶部）部件中。该塑料片在将果蝇装入各个产卵区域时作为底部表面。
- 使用CO2垫麻醉雌蝇，并将其逐个装入各个产卵区域。让果蝇恢复约30分钟，以从CO2麻醉中苏醒并适应新环境。
- 准备琼脂糖基质。
- 为方便起见，将一瓶预先熔化的1%琼脂糖置于55 °C水浴中备用。
- 将所需量的蔗糖储备液（2 M）加入50 ml锥形管中，并与适量琼脂糖混合。例如，制备150 mM蔗糖基质时，将750 µl的2 M蔗糖溶液加入管中，然后加入琼脂糖至10 ml刻度线。
- 以相同方式制备不含蔗糖的对照基质，但用蒸馏水代替蔗糖溶液。
注意：本方案中琼脂糖的终浓度略低于1%。根据我们的经验，只要琼脂糖浓度控制在约0.9 - 1.1%范围内，且两种基质的琼脂糖浓度一致，则具体浓度对实验结果无显著影响。
- 取出产卵室的基质（底部）部件，如图1D所示，用移液器将1,000 µl琼脂糖基质加入每个凹槽中。
- 让琼脂糖凝固约30分钟。
- 当琼脂糖基质和果蝇均准备就绪后，组装产卵室的三个部件，然后取出塑料片。
- 将产卵室放入果蝇培养箱中。
注意：产卵实验的持续时间可根据实验需求调整。我们通常进行过夜（O/N）实验（14 - 16小时）。此外，昼夜节律时间对产卵偏好的影响不显著。 - 通过向产卵室内注入CO2麻醉雌蝇。拆解产卵室，将麻醉后的果蝇丢弃至果蝇处理容器（i.e.，装有玉米油的空咖啡罐）。拍摄结果照片以供记录（见图2）。
- 人工计数卵的数量，并计算偏好指数用于分析。偏好指数计算公式为（Na - Nb）/（Na + Nb），其中Na和Nb分别表示在a位点和b位点的卵数。
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结果
产卵室由多个部件组成：基底（底部）部件、分隔（中部）部件、加样（顶部）部件以及两个滑动门（图1A - D）。这些部件可用于在产卵实验前独立设置果蝇和基底材料。图1F展示了雌性果蝇准备产卵时试管应呈现的状态。当果蝇可在普通基底与含蔗糖基底之间进行选择时，雌性果蝇显著偏好在普通基底上产卵，如图2所示。
图 1. 产卵室与产卵实验操作流程。 (A) 完全组装好的产卵室。(B) 拆解后的各组...
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讨论
本文所述的实验装置和方案相较于以往的产卵行为检测方法有多项改进。首先，该方法显著提高了单个动物偏好检测的通量。每个装置可同时检测30只单只雌蝇，且搭建时间不到一小时。其次，该方法提高了产卵偏好结果的一致性。通过标准化实验区域的尺寸、产卵基质的大小以及基质间的距离，使得不同实验日期及不同研究团队之间的结果更易于比较。第三，该装置可配备附加组件，以适应进一步的分析需求（补充图4）。例如，在行为学分析中，可在装置顶部安装视频摄像机以记录果蝇行为7,11-13。最重要的是，该方法具有良好的可扩展性。借助机械加工设备，这些装置的生产成本相对较低。此外，熟练操作人员通常可在不到2小时内完成5个装置（相当于150只单只雌蝇）的产卵实验设置。
研究单只雌性个体产卵偏好时，最关键的因素除了确保每只雌性均处于能够大量产卵的生理状态外，还包括（对某种产卵基质的偏好） "50 枚卵与 0 枚卵" 比偏好更具说服力 "1 枚卵 vs. 0 枚卵"）。若正确执行该方案，应能使正常的野生型果蝇（Canton S 和 w111...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢杜克大学物理车间，特别是Phil Lewis，帮助我们搭建行为实验装置和附件，并绘制了示意图。本研究由美国国立卫生研究院资助，资助编号为R01GM100027。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| UltraPure 琼脂糖 | Invitrogen | 16500-500 | |
| 蔗糖 | Sigma | S0389 | |
| 水浴锅 | Fisher | 15-462-6Q | |
| LifeCam Cinema 网络摄像头 | Microsoft | H5D-00013 | |
| 红色发光二极管（LED） | Cree | C503B-RAN-CA0B0AA1 | |
| 产卵室 | 定制 | ||
| 摄像头支架 | 定制 | ||
| LED 支架 | 定制 | ||
| 果蝇培养管（窄型） | Genesee | 32-116BC |
参考文献
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